Polimorfizm transpozonów z rodziny Tc1
Transkrypt
Polimorfizm transpozonów z rodziny Tc1
Instytut Oceanologii Polskiej Akademii Nauk Sopot Polimorfizm transpozonów z rodziny Tc1-podobnych w genomach ryb Rozprawa doktorska Anita Poćwierz-Kotus Promotor: prof. dr hab. Roman Wenne Recenzenci: prof. dr hab. Grzegorz Węgrzyn dr hab. Dariusz Grzebelus Wprowadzenie Elementy transpozonowe Transpozony są odcinkami DNA zdolnymi do zmiany miejsca położenia w genomie. Transpozony mają znaczący udział w składzie prokariotycznych i eukariotycznych genomów, a zakres ich występowania obejmuje prawie wszystkie zbadane organizmy. Dzięki zdolności do transpozycji elementy te mogą rozprzestrzeniać się zarówno w obrębie pojedynczej komórki poprzez kopiowanie się w nowych miejscach genomu, jak i między osobnikami wewnątrz populacji, a także pomiędzy gatunkami w procesie horyzontalnego transferu (HT). Wprowadzenie Elementy transpozonowe Eukariotyczne elementy transpozonowe I klasa: retrotranspozony II klasa: transpozony DNA mechanizm transpozycji „copyand-paste” w transpozycji uczestniczy RNA gen kodujący odwrotną transkryptazę LTR LTR gag RT RH IN mechanizm transpozycji „cutand-paste” gen kodujący transpozazę odwrócone terminalne powtórzenia - ITR (ang. inverted terminal repeat) ITR ITR gen transpozazy Wprowadzenie Transpozony Tc1 Jedną z rodzin TE klasy II jest rodzina transpozonów Tc1-podobnych, homologiczna do sekwencji Tc1 u nicienia Caenorhabditis elegans. Występuje ona w genomach wielu gatunków zwierząt, szczególnie zaś rozpowszechniona jest w genomach ryb i płazów. Większość kopii transpozonów Tc1 z powodu wielokrotnych mutacji jest nieaktywna i występuje w postaci stałych składników genomu (tzw. genetyczna skamieniałość). RT Wprowadzenie Horyzontalny transfer HT - zjawisko umożliwiające transmisję TE od jednego gatunku gospodarza do innego, za pośrednictwem wektora. HT aktywnego transpozonu Wzrost liczby kopii Kolonizacja genomowego DNA Rozprzestrzenienie w populacji Gatunek A Stochastyczna utrata Kolejny HT Wertykalna inaktywacja Kolejny HT Mutacje punktowe Gatunek C Gatunek B Wprowadzenie Horyzontalny transfer Doniesienia w pracy Leavera (2001) o HT u ryb i płazów: RT Kompletna kopia transpozonu Tc1-podobnego zidentyfikowana w genomie Pleuronectes platessa może świadczyć o zachowaniu zdolności do transpozycji tego transpozonu. Obecność spokrewnionych transpozonów z rodziny Tc1podobnych w genomach Pleuronectes platessa, Salmo salar, Rana temporaria, czyli gatunków, których dywergencja nastąpiła ponad 400 mln lat temu może świadczyć o horyzontalnej transmisji tego transpozonu. Cele pracy Zbadanie zakresu występowania transpozonów z rodziny Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb. Określenie polimorfizmu i uzyskanie charakterystyki sekwencji transpozonów Tc1-podobnych w badanych gatunkach ryb. Przeprowadzenie analizy filogenetycznej transpozonów Tc1-podobnych zidentyfikowanych w genomach ryb. Wykazanie możliwości zajścia horyzontalnego transferu u wybranych gatunków ryb. Opracowanie metodyki określania miejsc integracji transpozonów Tc1-podobnych w genomach ryb. Metody Pobór prób Badaniami objętych było 495 osobników należących do 36 gatunków ryb zasiedlających wody słone i słodkie. Najliczniejszą grupę stanowili przedstawiciele rodzin: Pleuronectidae – 179 osobników: Scophthalmidae – 82 osobniki: Scophthalmus maximus Percidae – 54 osobniki: Platichthys flesus Pleuronectes platessa Perca fluviatilis Liczebnościowo mniejsze grupy stanowili przedstawiciele rodzin: Esocidae, Cyprinidae, Poeciliidae, Anguillidae, Scorpaenidae. Salmonidae, Clupeidae, Dasyatidae, Scombridae, Gobidae, Belonidae, Ophidiidae, Gempylidae, Merlucciidae, Gadidae, Channichthyidae, Carangidae, Metody Polimorfizm transpozonów Tc1-podobnych Izolacja DNA Trawienie enzymami restrykcyjnymi Amplifikacja PCR Startery komplementarne do genu transpozazy RFLP Pojedynczy starter komplementarny do ITR Klonowanie do wektora pGEM3Zf(+) Sekwencjonowanie Analiza bioinformatyczna sekwencji Transfer DNA na membranę nylonową Hybrydyzacja z sondą specyficzną do fragmentu genu transpozazy Metody Identyfikacja miejsc insercji transpozonów Tc1-podobnych Izolacja DNA Trawienie enzymami restrykcyjnymi Ligacja fragmentów restrykcyjnych Odwrotna reakcja PCR (ang. inverse PCR) Ponowna reakcja PCR (rePCR) Sekwencjonowanie Obróbka bioinformatyczna sekwencji Wyniki Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb Analiza przesiewowa przy pomocy techniki PCR Liczba przebadanych gatunków – 36 Liczba przebadanych osobników – 495 starter I (1) starter I (1630) produkt produktPCR PCR(1630 (1630pz) pz) starter APK1 (407) starter APK2 (1220) produkt PCR (814 pz) ITR gen transpozazy ITR Wyniki Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb Dystrybucja transpozonów Tc1-podobnych w genomach wybranych gatunków ryb oszacowana dzięki amplifikacji PCR z pojedynczym starterem I. A 1 B 2 C 3 4 5 D 6 7 8 E F B G F E F H F H I 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 3530 1904 1584 1375 947 564 A - P. platessa B - P. flesus C - S. salar D - H. platessoides E - R. hippoglossoides F - E. lucius G - S. maximus H - S. lucioperca I - C. harrengus (I) Wyniki Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb Dystrybucja transpozonów Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb oszacowana z zastosowaniem amplifikacji PCR z parą starterów komplementarnych do genu Tnp. M P. platessa P. flesus S. trutta fario M 947 564 90 Platichthys flesus Pleuronectes platessa Salmo trutta fario Salmo trutta trutta Anguilla anguilla Salmo salar Esox lucius Scophthalmus maximus Stizostedion lucioperca Limanda aspera Neogobius melanostomus Blicca bjoerkna Danio rerio Clupea harengus Sprattus sprattus Belone belone Theragra chalcogramma Poecilia sphenops Thunnus albacares Megalaspis cordyla Perca fluviatilis Abramis brama Urogymnus asperrimus Hippoglossoides platessoides Merluccius merluccius Oncorhynchus nerka Rutilus rutilus Gadus morhua Reinhardtius hippoglossoides Cyprinus carpio Tinca tinca Genypterus capensis Champsocephalus gunnari Scomber scombrus Ruvettus pretiosus Sebastes marinus % 142 25 19 1 3 7 16 82 21 4 5 1 2 10 10 8 3 2 4 4 33 13 3 3 2 6 5 21 5 2 3 8 14 3 2 3 Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb Wyniki Liczebność 100 150 PCR 1 PCR 2 135 80 120 70 105 60 90 50 75 40 60 30 45 20 30 10 15 0 0 Wyniki Potwierdzenie specyficzności wykrytych transpozonów Tc1-podobnych Liczba osobników Gatunek Miejsce pochodzenia Platichthys flesus 15 Morze Bałtyckie Pleuronectes platessa 10 Morze Bałtyckie Scophthalmus maximus 5 Morze Bałtyckie Salmo trutta fario 2 hodowla rybna, Gościcino Salmo salar 2 Morze Norweskie Esox lucius 13 Jezioro Żarnowieckie fragment restrykcyjny 711 pz PvuII (663) BamHI (763) gen transpozazy PvuII(1374) Wyniki Potwierdzenie specyficzności wykrytych transpozonów Tc1-podobnych Użyto enzymów restrykcyjnych: PvuII, BamHI, HindIII. Enzym restrykcyjny PvuII Platichthys flesus Pleuronectes platessa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ok. 710 pz Wyniki Polimorfizm sekwencji transpozonów Tc1-podobnych określony przy użyciu RFLP Użyto enzymów restrykcyjnych: AluI, MboI, DdeI, HinfI. Gatunek Liczba osobników Miejsce pochodzenia Platichthys flesus 44 Morze Bałtyckie Morze Północne Pleuronectes platessa 20 Morze Bałtyckie Scophthalmus maximus 5 Morze Bałtyckie Salmo trutta fario 5 hodowla rybna, Gościcino Salmo salar 10 Morze Norweskie A - Platichthys flesus B - Pleuronectes platessa A B A B A B 417 311 249 200 140 Wyniki Polimorfizm sekwencji transpozonów Tc1-podobnych na podstawie analizy sekwencji nukleotydowych Klonowanie sekwencji transpozonów Tc1-podobnych z 10 osobników ryb reprezentujących 8 gatunków: Lp. Gatunek Symbol osobnika Pochodzenie Liczba uzyskanych klonów 1 Platichthys flesus 31S 200S 8ST Morze Bałtyckie Morze Bałtyckie Morze Północne 94 20 20 2 Pleuronectes platessa 50G Morze Bałtyckie 20 3 Scophthalmus maximus 11SKB Morze Bałtyckie 20 4 Esox lucius 10E Jezioro Żarnowieckie 30 5 Belone belone BB5 Morze Bałtyckie 16 6 Neogobius melanostomus 4B Morze Bałtyckie 19 7 Perca fluviatilis O35 Morze Bałtyckie 16 8 Oncorhynchus nerka ON6 Ocean Spokojny 20 Ogółem 275 klonów Wyniki Polimorfizm sekwencji transpozonów Tc1-podobnych na podstawie analizy sekwencji nukleotydowych Przeprowadzono zestawienie 275 sekwencji, na bazie którego skonstruowano globalne drzewo filogenetyczne. Na podstawie jego topologii wydzielono 7 kladów: A, B, C, D, E, F, G, których odrębność potwierdzono za pomocą obliczeń średniego zróżnicowania genetycznego. KLAD GATUNKI Śr. zróżnicowanie genetyczne A P. flesus (131), P. platessa (20), S. maximus (18), O. nerka (1) 0,043 B N. melanostomus (19), P. fluviatilis (13) 0,01 C B. belone (10) 0,06 D O. nerka (19) 0,19 E E. lucius (11), B. belone (6), P. fluviatilis (3) 0,1 F P. flesus (3), S. maximus (2) 0,04 G E. lucius (19) 0,0005 Wyniki Analiza filogenetyczna transpozonów Tc1-podobnych z uwzględnieniem sekwencji uzyskanych z baz danych A P. flesus, P. platessa S. maximus , O. nerka B N. melanostomus , P. fluviatilis C B. belone D O. nerka E E. lucius , B. belone P. fluviatilis F P. flesus , S. maximus G E. lucius a - (Leaver, 2001) b - (Ivics i in., 1996) c - (Sinzelle i in., 2005) d – transozaza BX294110 of Danio rerio, e – transpozaza CR931802 of Danio rerio, f - (Jaillon i in., 2004) Wyniki Analiza filogenetyczna transpozonów Tc1-podobnych oparta na sekwencjach aminokwasowych W obrębie zidentyfikowanych 7 kladów wydzielono 13 sekwencji konsensusowych dla każdego gatunku: Tc1-1Pla, Platichthys flesus Tc1-1Ple, Pleuronectes platessa Tc1-1Sco, Scophthalmus maximus Tc1-1Onc, Oncorhynchus nerka Tc1-2Onc, Oncorhynchus nerka Tc1-1Bel, Belone belone Tc1-1Neo, Neogobius melanostomus Tc1-2Per, Perca fluviatilis Tc1-1Eso, Esox lucius Tc1-1Per, Perca fluviatilis Tc1-2Pla, Platichthys flesus Tc1-2Sco, Scophthalmus maximus Tc1-2Eso, Esox lucius Wyniki Analiza filogenetyczna transpozonów Tc1-podobnych oparta na sekwencjach aminokwasowych PPTN, Ple uron ectes pla tessa Tc1-1P le, Pleuronectes platessa Tc1-1S co , S co phthalmus maximus 98 Tc1-1Pla, Platichthys flesus 100 Tc1-1Onc , Oncorhynchus nerka Tc1-2P la, Platichthys flesus 100 Tc1-2Sco , S co phthalmus maximus 63 98 1 Tc1-10Xt (Eagle), Xenopus trop icalis Tc1-2Ory, Oryzias la tipes Glan, On corhyn chus mykiss 1 00 Tc1-1Ory, Oryz ias la tip es 97 92 89 Tc1-2Onc, Oncorhynchus nerka 61 Barb, Onc orhynchus m ykiss SSTN, Salmo s alar Tc1-12Xt, Xenopus tropicalis 1 00 99 Tc1-1Bel, Belone belone Tc1-1Eso, E so x lucius 89 98 2 3 RTTN , Rana temporaria Tc1-1Per, Perca fluviatilis 89 Tzf, Danio rerio Tc1-3Ory, O ryzias latipes 74 100 1 00 100 100 68 100 85 99 77 Tc1-1Neo, Neogobius melanostomus Tc1-2Per, Perca flu viatilis Niezidentyfikowa ny Tc1 , Danio re rio Tc1-11Xt (Fro ggy), Xen opu s tropicalis Tc1-1D r, Dan io rerio Tc1-1Xt (XtT Xr), Xen opu s tropicalis Tc1-FR4, F ugu rubripes Tc1-8Xt, Xe nop us tropic alis Tc1-4Xt, Xeno pus tro pic alis Tc1-1Tet, Tetrao don n igrovirid is 100 Tc 1-FR6, Fugu rub ripe s Tss, Sa lmo salar Tdr1, Danio rerio Tc1-2Xt (M ay a), Xenopus trop icalis 89 Tc1-2E so, Eso x lucius 1 00 1 00 59 63 TC 1 0.1 Tc1 -FR1, F ugu rubripes Titof2, Tetraodon n igro viridis Tc1 DR3 , Danio re rio Tc1-4Ory, Oryzias la tipes 4 5 Wyniki Szacowanie prawdopodobieństwa zajścia HT na podstawie dystrybucji zidentyfikowanych transpozonów Tc1-podobnych w genomach ryb Xenopus tropicalis Rana temporaria Danio rerio 485MYA Oncorhynchus mykiss 75MYA 400MYA Oncorhynchus nerka Salmo salar 261 MYA Esox lucius Porównanie struktury transpozonów Tetraodon nigroviridis 84MYA Takifugu rubripes 288MYA Neogobius melanostomus 190MYA Belone belone 99% Oryzias latipes 180MYA Perca fluviatilis Pleuronectes platessa 1.6MYA 5MYA Platichthys flesus Scophthalmus maximus 98% Wyniki Opracowanie metodyki umożliwiającej identyfikację miejsca integracji transpozonów Tc1-podobnych w genomie storni P. flesus genomowy DNA Tc1 Tc1 Tc1 trawienie HindIII Tc1 Tc1 odwrotna reakcja PCR APK1 (1) Tc1 inv3 (124) starter I (1381) ligacja Tc1 inv1 (1614) inv4 (1493) Tc1 Tc1 inv6 (1251) 1630 pz Tc1 Tc1 Tc1 SFT inv5 (989) HindIII (748) Wyniki Identyfikacja i analiza sekwencji miejsca integracji kopii transpozonu Tc1-podobnego w genomie storni P. flesus Wykres zależności filogenetycznych: sekwencje aa 156 sekwencji RVT z bazy Pfam (tzw. SEED) 10 reprezentantów ze 100 sekwencji z bazy est (GenBank) SFT LINE: ryby, owady niescharakt. RVT retrowirusy retroelementy: owady, rosliny 0.1 Wnioski Transpozony z rodziny Tc1-podobnych są szeroko rozpowszechnione w genomach ryb. Lokalizacja sekwencji transpozonowych w obrębie gatunku jest konserwatywna, natomiast zaobserwowano polimorfizm na poziomie międzygatunkowym. Identyczność transpozonów zidentyfikowanych u okonia i babki może wskazywać na horyzontalny transfer. Wnioski Zademonstrowano integrację transpozonu Tc1 do zdegenerowanego retrotranspozonu LINE. Zależności filogenetyczne między analizowanymi transpozonami nie potwierdzają hipotezy Leavera. . uwagę Dziękuję za Poćwierz-Kotus A, Wenne R. Properties of mobile elements of genomes and their application in biotechnology. Environmental Biotechnology, in press. Wenne R, Handschuh L, Poćwierz-Kotus A, Urbaniak R, Formanowicz P, Całkiewicz J, Brzozowska K, Figlerowicz M, Węgrzyn G, Wróbel B. The application of microarray technology to the identification of Tc1-like element sequences in fish genomes. Marine Biology Research, in press Poćwierz-Kotus A, Burzyński A, Wenne R. 2010. Identification of a Tc1like transposon integration site in the genome of the flounder (Platichthys flesus): a novel use of an inverse PCR method. Marine Genomics, 3: 45-50 Poćwierz-Kotus A, Burzyński A, Wenne R. 2007. Family of Tc1-like elements from fish genomes and horizontal transfer. Gene, 390: 243-251 . uwagę Dziękuję za