72530-72531 syphilis total ab (883679) pl - Bio-Rad

Syphilis Total Ab
1 płytka 5 płytek -
96
480
72530
72531
ZESTAWY DO JAKOŚCIOWEGO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ TREPONEMA
PALLIDUM W SUROWICY LUB OSOCZU KRWI LUDZKIEJ Z ZASTOSOWANIEM
TECHNIKI ENZYMATYCZNEGO TESTU IMMUNOLOGICZNEGO
883679 - 2014/11
SPIS TREŚCI
1.
PRZEZNACZENIE .................................................................................... 3
2.
PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIE TESTU ............................................... 3
3.
PODSTAWY PROCEDURY ....................................................................... 3
4.
ODCZYNNIKI ........................................................................................... 4
5.
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI ................................................ 5
6.
PRÓBKI ................................................................................................... 6
7.
PROCEDURA .......................................................................................... 7
8.
OGRANICZENIE TESTU ......................................................................... 10
9.
CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA .......................................................... 10
10.
BIBLIOGRAFIA ....................................................................................... 13
[PL] 2
1. PRZEZNACZENIE
Zestawy przeznaczone są do stosowania przez pracowników prawidłowo przeszkolonych
i wykwalifikowanych w zakresie jakościowego wykrywania przeciwciał Treponema pallidum
w surowicy lub osoczu krwi ludzkiej. Produkt można stosować do wykonywania badań przesiewowych
u dawców krwi i do wspomagania diagnozowania pacjentów z podejrzeniem zarażenia kiłą.
2. PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIE TESTU
Kiła jest przewlekłą chorobą zakaźną, mającą wyraźne postaci: pierwotna, wtórna, późna
(trzeciorzędowa) i czwartorzędowa. Postaci te mają odmienne objawy kliniczne, zazwyczaj są to
początkowe owrzodzenia, znane jako wykwity pierwotne, następnie powstaje osutka, a w końcu
pojawiają się długie okresy uśpienia choroby. Nieleczone zakażenia mogą ostatecznie powodować
zaburzenia układu krążenia i kiłę układu nerwowego.
Zakażenie powodują krętkiTreponema pallidum; choroba jest zazwyczaj przenoszona drogą płciową,
chociaż zdarzają się również przypadki zakażenia poprzez przetoczenie zakażonej krwi. Odnotowano
również przypadki zakażeń wewnątrzmacicznych. Udowodniono, że w zasadzie nie można hodować
tych drobnoustrojów na sztucznej pożywce i rozpoznanie zakażenia zazwyczaj zależy od obecności
we krwi przeciwciał, które pojawiają się tuż po zakażeniu i mogą się utrzymywać przez wiele lat.
Testy kiłowe dzielą się na cztery kategorie: bezpośrednie badanie mikroskopowe, testy przeciwciał
krętkowych, testy na obecność przeciwciał niekrętkowych i bezpośrednie testy na obecność antygenu.
Ze względu na długi okres uśpienia i nieswoisty charakter testów na obecność przeciwciał
niekrętkowych, coraz popularniejsze stają się w badaniach przesiewowych metody wykrywające
swoiste przeciwciała krętkowe w próbkach krwi. Jednym z takich testów jest Syphilis Total Ab.
3. PODSTAWY PROCEDURY
Test Syphilis Total Ab wykorzystuje trzy rekombinowane antygeny do oznaczania w testach
„kanapkowych”. Antygeny te wykrywają swoiste dla T. pallidum przeciwciała IgG, IgM i IgA,
umożliwiając tym samym stosowanie tego testu do wykrywania przeciwciał we wszystkich stadiach
zakażenia.
Zagłębienia pokrywane są mieszanką rekombinowanych antygenów T. pallidum 15Kd, 17Kd i 47Kd.
Swoiste przeciwciała w próbkach surowicy lub osocza łącza się z tymi antygenami i z tymi samymi
antygenami skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową po dodaniu koniugatu do zagłębienia,
w którym próbka jest inkubowana. Po usunięciu nieprzereagowanego materiału przez przemywanie,
obecność znacznika związanego enzymu, wskazującego na obecność w próbce swoistych
przeciwciał, objawia się przez zmianę koloru w mieszaninie substratu/chromogenu. Intensywność
zabarwienia jest porównywana do zagłębień kontrolnych, aby ustalić obecność lub brak określonych
przeciwciał.
[PL] 3
4. ODCZYNNIKI
4.1. Opis
Oznaczenia na
etykiecie
R1
Microplate
Opis
Mikropłytka
12 pasków z 8 zagłębieniami pokrytych
rekombinowanymi antygenami
(rAg) T. pallidum
Specyficzny numer ID = 97
Stężony roztwór do płukania (20X)
Bufor Tris NaCl pH 7,4
Środek konserwujący: ProClin™ 300
(0,04%)
Ujemna surowica kontrolna
Bufor Tris, zawierający BSA (surowicza
albumina wołowa)
Środek konserwujący: ProClin™ 300
(0,1%)
Dodatnia surowica kontrolna (ludzka)
Ludzka surowica zawierająca przeciwciała
przeciwko T.pallidum ujemne dla HIV1/2,
HBs Ag, HCV i rozcieńczone w buforze
Tris zawierającym BSA (albuminę
surowicy bydlęcej)
Środek konserwujący: ProClin™ 300
(0,1%)
Koniugat
rAg T.pallidum /peroksydaza
Środek konserwujący: ProClin™ 300
(0,05%)
Liczba/
Przygotowanie
72530
Liczba/
Przygotowanie
72531
1 płytka
Gotowe do użycia
5 płytek
Gotowe do użycia
1 fiolka
70 ml
Do rozcieńczenia
1 fiolka
235 ml
Do rozcieńczenia
1 fiolka
2,1 ml
Gotowe do użycia
1 fiolka
2,1 ml
Gotowe do użycia
1 fiolka
1,6 ml
Gotowe do użycia
1 fiolka
1,6 ml
Gotowe do użycia
1 fiolka
8 ml
Gotowe do użycia
1 fiolka
30 ml
Gotowe do użycia
1 fiolka
60 ml
Do odtworzenia
1 fiolka
60 ml
Do odtworzenia
R2
Concentrated
Washing
Solution (20X)
R3
Negative
control
R4
Positive control
R6
Conjugate
R8
Substrate
buffer
R9
Chromogen:
TMB solution
(11X)
Chromogen: Roztwór TMB (różowy)
Roztwór zawierający 3,3’-, 5,5’tetrametylobenzydynę (TMB)
1 fiolka
5 ml
Do rozcieńczenia
1 fiolka
5 ml
Do rozcieńczenia
R10
Stopping
solution
Roztwór przerywający reakcję
Roztwór kwasu siarkowego (H2SO4 1N)
1 fiolka
28 ml
Gotowe do użycia
1 fiolka
28 ml
Gotowe do użycia
Bufor substratu
Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu
pH 4,0; zawierający H2O2 (0,015%)
i DMSO (4%)
4.2. Przechowywanie i postępowanie z produktem
Zestaw należy przechowywać w temperaturze +2–8°C. Każdy element zestawu przechowywany
w temperaturze +2–8°C może być stosowany aż do daty ważności wskazanej na opakowaniu (chyba
że określono inaczej).
Po otwarciu i przy braku skażenia odczynniki R3, R4, R6, R8, R9 i R10 przechowywane
w temperaturze +2–8°C mogą być stosowane aż do daty ważności wskazanej na etykiecie.
[PL] 4
Identyfikacja
R1
R2
R8+R9
Przechowywanie w odpowiednich warunkach
Po otwarciu torebki zamkniętej próżniowo paski z mikrozagłębieniami
przechowywane przy temperaturze +2–8°C mogą być stosowane przez
1 miesiąc w oryginalnej, starannie zamkniętej ponownie torebce.
Rozcieńczony roztwór do płukania może być przechowywany przez
2 tygodnie w temperaturze +2–30°C. Stężony roztwór do płukania (R2)
może być przechowywany w temperaturze +2–30°C.
Po odtworzeniu odczynniki przechowywane w ciemności mogą być używane
w ciągu 6 godzin w temperaturze pokojowej (18–30°C).
5. OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
Do diagnostyki in vitro. Produkt przeznaczony wyłącznie do stosowania przez personel medyczny.
5.1. Instrukcje BHP:
§ Ten zestaw przeznaczony jest wyłącznie do stosowania przez wykwalifikowany personel
przeszkolony w zakresie procedur laboratoryjnych i zaznajomiony z wynikającymi z nich
potencjalnymi zagrożeniami. Należy stosować odzież ochronną, rękawiczki, ochronę oczu
i twarzy oraz posługiwać się zestawem zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej.
§ Zestaw testowy zawiera składniki krwi ludzkiej. Materiały pochodzenia ludzkiego stosowane
do przygotowania odczynników zostały przetestowane i stwierdzono, że są niereaktywne
względem antygenu powierzchniowego wirusowego zapalenia wątroby typu B (HBs Ag),
przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom niedoboru odporności (HIV-1 i HIV-2) i przeciwciał
przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV). Żadna znana metoda przeprowadzania
testu nie gwarantuje braku obecności czynników zakaźnych. Z tego powodu z materiałem
pochodzenia ludzkiego, odczynnikami i próbkami pobranymi od pacjentów należy
postępować jak z materiałem potencjalnie zakaźnym, stosując uniwersalne środki
ostrożności związane z patogenami krwiopochodnymi zdefiniowane przez przepisy lokalne,
regionalne i krajowe.
§ Skażenie biologiczne: Rozlany materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako
materiał potencjalnie zakaźny.
Rozlany materiał niezawierający kwasu należy niezwłocznie usunąć i odkazić skażony
obszar, materiały oraz wszelkie skażone powierzchnie lub wyposażenie za pomocą
odpowiedniego chemicznego środka dezynfekującego skutecznie eliminującego potencjalne
zagrożenie biologiczne związane z daną próbką (zwykle w tym celu należy użyć roztworu
1:10 wybielacza, 70–80% roztworu etanolu lub izopropanolu, jodoforu [np. 0,5%
Wescodyne™ Plus itd.] i wytrzeć do sucha).
Rozlany materiał zawierający kwas należy usunąć (zetrzeć) w odpowiedni sposób lub
zneutralizować, a skażony obszar przemyć wodą i wytrzeć do sucha. Materiał użyty do
zebrania rozlanego materiału należy zutylizować jako odpad potencjalnie niebezpieczny.
Następnie należy odkazić skażony obszar za pomocą chemicznego środka
dezynfekującego.
UWAGA: Nie umieszczać roztworów zawierających wybielacz w autoklawie!
§ Wszystkie próbki i materiał użyty do przeprowadzenia testu utylizować jak materiał
potencjalnie zakaźny. Wszelkie odpady laboratoryjne, chemiczne i odpady stwarzające
zagrożenie biologiczne należy przenosić i utylizować zgodnie z wszystkimi przepisami
lokalnymi, regionalnymi i krajowymi.
§ Zalecenia dotyczące zagrożeń i środków ostrożności związanych z substancjami
chemicznymi znajdującymi się w tym zestawie testowym można znaleźć na piktogramach
zamieszczonych na etykietach oraz w informacjach zamieszczonych na końcu niniejszej
instrukcji obsługi.
Karta charakterystyki substancji jest dostępna na stronie www.bio-rad.com.
[PL] 5
5.2. Środki ostrożności związane z procedurą
5.2.1. Przygotowanie
Wiarygodność wyników jest zależna od prawidłowego wdrożenia następujących zasad dobrej praktyki
laboratoryjnej:
• Nie używać przeterminowanych odczynników.
• Podczas danej serii testów nie mieszać ani nie łączyć odczynników pochodzących z różnych serii.
• Przed przystąpieniem do użytkowania należy zaczekać 30 minut, aby odczynniki ustabilizowały się
w temperaturze pokojowej (18–30°C).
• Nazwa testu oraz specyficzny numer identyfikacyjny testu są zapisane na ramce każdej mikropłytki.
Ten specyficzny numer identyfikacyjny jest podany także na każdym pasku.
Syphilis Total Ab: Specyficzny numer ID = 97
Przed użyciem należy zweryfikować specyficzny numer identyfikacyjny. Jeśli numer identyfikacyjny
jest niedostępny lub różni się od numeru odpowiadającemu oznaczeniu przeznaczonemu do
testowania, to paska nie należy używać.
UWAGA: W przypadku roztworu do płukania (R2, identyfikacja na etykiecie: 20X, w kolorze zielonym),
buforu substratu peroksydazy (R8, identyfikacja na etykiecie: bufor TMB, w kolorze niebieskim),
chromogenu (R9, identyfikacja na etykiecie: TMB 11X, w kolorze fioletowym) i roztworu
przerywającego reakcję (R10, identyfikacja na etykiecie: 1N, w kolorze czerwonym) możliwe jest
użycie odczynników innych niż te zawarte w zestawie, pod warunkiem, że ten sam odczynnik jest
stosowany w ramach danego przebiegu testu. Te odczynniki mogą być stosowane z niektórymi innymi
produktami naszej firmy. Szczegółowy informacji udziela nasz serwis techniczny.
• Ostrożnie przygotować odczynniki, unikając zanieczyszczenia.
• Używać szklanych naczyń, dokładnie umytych i opłukanych wodą dejonizowaną lub, o ile to możliwe,
jednorazowego materiału.
• Nie pozwolić na wyschnięcie mikropłytki między zakończeniem operacji płukania a dystrybucją
odczynników.
• Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na jony metali. Nie należy pozwolić na kontakt
metalowego elementu z różnymi roztworami koniugatów lub substratów.
• Roztwór wywoławczy (bufor substratu + chromogen) musi być zabarwiony w kolorze różowym.
Zmiana różowego koloru w ciągu kilku minut po rozpuszczeniu oznacza, że użycie odczynnika jest
niemożliwe i należy go wymienić.
Roztwór wywoławczy należy przygotować w czystej plastikowej tacy do jednorazowego użytku lub
w zbiorniku szklanym umytym przy użyciu 1N HCl i dokładnie wypłukanym wodą destylowaną,
a następnie osuszonym. Ten odczynnik należy przechowywać w ciemności.
• Nigdy nie używać tego samego zbiornika do dystrybucji koniugatu i roztworu wywoławczego.
5.2.2.
Proces
• Nie wprowadzać zmian w procedurze oznaczania.
• Nie wykonywać testu przy obecności reaktywnych oparów (oparów kwasowych, zasadowych,
aldehydowych) lub pyłu, który mógłby zmienić aktywność enzymatyczną koniugatu.
• Do każdej próbki należy użyć nowej końcówki do dystrybucji.
• Odpowiednie płukanie zagłębień jest krytycznym krokiem tej procedury: wykonać zalecaną liczbę
cykli płukania i upewnić się, że każde z zagłębień jest całkowicie napełniane, a następnie całkowicie
opróżniane. Niewłaściwe płukanie może prowadzić do niedokładnych wyników.
• Należy ściśle przestrzegać opisanych procedur płukania, aby uzyskać maksymalną wydajność testu.
W przypadku niektórych przyrządów może być konieczne zoptymalizowanie procedury płukania
(zwiększenie liczby cykli kroków lub objętości buforu płuczącego dla każdego cyklu) w celu uzyskania
akceptowalnego poziomu OD dla próbki ujemnej.
• Informacje na temat adaptacji i procedur specjalnych można uzyskać w naszej firmie.
6. PRÓBKI
Próbkę krwi pobrać zgodnie z obowiązującymi zasadami.
Testy przeprowadzić na nierozcieńczonej surowicy lub osoczu (pobranych na EDTA, cytrynianie sodu,
heparynie sodowej lub ACD)
[PL] 6
Próbki zawierające cząstki stałe należy przed testem oczyścić przez wirowanie. Próbki należy
przechowywać w temperaturze + 2–8°C, jeśli test ma być wykonany w ciągu 7 dni lub przechowywać
w temperaturze -20°C przez dłuższy czas. Nie wykonywać cykli zamrażania/rozmrażania więcej niż
5 razy. Można stosować próbki, które zostały poddane obróbce cieplnej w temperaturze 56°C przez
pół godziny.
Próbki zawierające do 120 g/l albuminy, 200 mg/l bilirubiny, 33 g/l trioleiny albo 2 g/l hemoglobiny nie
wpływają na wyniki. Nie jest jednak zalecane używanie skażonych hiperlipemicznie lub
hiperhemolizowanych próbek surowicy bądź osocza.
Przed przystąpieniem do wykonywania testu próbki powinny być rozmrożone i dobrze wymieszane.
Jeśli próbki będą transportowane, należy zapakować je zgodnie z obowiązującymi regulacjami
dotyczącymi transportu czynników etiologicznych i najlepiej transportować w stanie zamrożonym.
7. PROCEDURA
7.1. Wymagane materiały, które nie wchodzą w skład zestawu
• Woda destylowana.
• Podchloryn sodu (domowy wybielacz) i wodorowęglan sodu.
• Bibuła chłonna.
• Rękawiczki jednorazowe.
• Okulary ochronne.
• Jednorazowe probówki.
• Automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub wstępnie ustawione pipety lub pipety
wielokanałowe do pomiaru i dozowania 50 µl, 1 ml i 10 ml.
• Cylindry miarowe o pojemności 100 ml i 1 l.
• Automatyczny, półautomatyczny lub ręczny system mycia mikropłytek (*).
• Inkubator do mikropłytek ustawiony termostatycznie na 37°C ± 1°C (*).
• Pojemnik na odpady niebezpieczne.
• Czytnik mikropłytek z filtrami 450 nm, 490 nm i 620–700 nm (*).
(*) Udzielamy szczegółowych informacji na temat sprzętu zalecanego przez nasz dział techniczny.
7.2. Przygotowanie odczynników
7.2.1. Odczynniki gotowe do zastosowania
Odczynnik 1 (R1): Mikropłytka
Każda ramka zawierająca 12 pasków jest owinięta szczelnie zamkniętą torebką foliową. Przeciąć
torebkę nożyczkami lub skalpelem 0,5 do 1 cm nad zgrzewem. Otworzyć torebkę i wyjąć ramkę.
Ramkę z niewykorzystanymi paskami odłożyć z powrotem do torebki. Dokładnie zamknąć torebkę
i umieścić w temperaturze +2–8°C.
Odczynnik 3 (R3): Ujemna surowica kontrolna
Odczynnik 4 (R4): Dodatnia surowica kontrolna
Odczynnik 6 (R6): Koniugat
Zhomogenizować przez odwracanie przed użyciem.
Odczynnik 10 (R10): Roztwór przerywający reakcję
7.2.2. Odczynniki do odtworzenia
Odczynnik 2 (R2): Stężony roztwór do płukania (20X)
Rozcieńczyć w stosunku 1:20 w wodzie destylowanej, aby uzyskać gotowy do użycia roztwór do
przepłukiwania.
Przygotować 800 ml dla jednej płytki zawierającej 12 pasków.
[PL] 7
Odczynnik 8 (R8) + odczynnik 9 (R9): Roztwór wywoławczy enzymu
Rozcieńczyć chromogen (R9) w buforze substratu w stosunku 1:11 (np. 1 ml odczynnika R9 + 10 ml
odczynnika R8) przy założeniu, że 10 ml jest wymagane i wystarczające do przetworzenia 12 pasków.
Wstrząsnąć, aby uzyskać zhomogenizowaną postać.
7.3. Procedura oznaczania
Ściśle przestrzegać procedury.
Użyć ujemnych i dodatnich surowic kontrolnych dla każdego testu w celu zweryfikowania jakości testu.
Stosować zasady dobrej praktyki laboratoryjnej:
1) Dokładnie opracować plan dystrybucji i identyfikacji próbek.
2) Przygotować rozcieńczony roztwór do płukania R2
3) Wyjąć ramkę i wymaganą liczbę pasków (R1) z opakowania ochronnego. Niewykorzystane
paski odłożyć z powrotem do opakowania. Zamknąć opakowanie i umieścić je w temperaturze
+2–8°C.
4) Dystrybuować do zagłębienia w następującej kolejności (zalecana dystrybucja na płytce):
• 50 µl ujemnego wskaźnika (R3) do zagłębień A1, B1 i C1;
• 50 µl dodatniego wskaźnika (R4) do zagłębień D1 i E1;
• 50 µl nierozcieńczonej próbki do każdego zagłębienia, F1, G1, itd.
• 50 µl koniugatu (R6) do każdego zagłębienia.
W zależności od stosowanego systemu możliwa jest zmiana pozycji wskaźników lub kolejności
dystrybucji.
Homogenizować mieszaninę reakcyjną, stosując co najmniej trzy aspiracje lub wytrząsać
w wytrząsarce mikropłytek przez 5 sekund.
UWAGA:
Dystrybucja próbki i wskaźników może być na tym etapie manipulacji kontrolowana wzrokowo,
ponieważ występuje różnica zabarwienia między pustym zagłębieniem i zagłębieniem z próbką.
Dozować koniugat w ciągu 5 minut po dystrybucji próbki. Istnieje wyraźna różnica zabarwienia
między pustym zagłębieniem a zagłębieniem zawierającym czerwony roztwór koniugatu (R6)
(patrz § 7.7)
5) Jeśli to możliwe, nakryć płytkę folią samoprzylepną.
6) Poddać mikropłytkę inkubacji w przez 30 do 35 minut w temperaturze 37°C ± 1°C.
7) W razie potrzeby zdjąć folię samoprzylepną. Zassać zawartość wszystkich zagłębień do
pojemnika na odpady ciekłe i dodać do każdego zagłębienia co najmniej 370 µl roztworu do
płukania. Zassać ponownie i powtórzyć płukanie co najmniej 4 razy (łącznie 5 cykli). Pozostała
objętość musi być mniejsza niż 10 µl (w razie potrzeby osuszyć paski, odwracając je na
chłonnej bibule).
W przypadku stosowania myjki automatycznej postępować zgodnie z tą samą procedurą.
UWAGA: W ciągu 20 minut przejść do kroku płukania.
8) Przygotować roztwór wywoławczy (odczynnik R8 + R9).
9) Szybko dozować do każdego zagłębienia 50 µl roztworu wywoławczego (R8+R9),
przygotowanego bezpośrednio przed użyciem. Pozwolić na przeprowadzenie reakcji
w ciemności przez 25 do 35 minut w temperaturze pokojowej (18–30°C). W czasie tej
inkubacji nie używać folii samoprzylepnej.
UWAGA: Na tym etapie można kontrolować wzrokowo dystrybucję roztworu wywoławczego, który
jest różowy. Istnieje wyraźna różnica zabarwienia między pustym zagłębieniem a zagłębieniem
zawierającym różowy roztwór substratu. (patrz § 7.7).
10) Dodać 50 µl roztworu przerywającego reakcję (R10) w tej samej kolejności i w tym samym
rytmie, co przy dodawaniu roztworu substratu. Zhomogenizować mieszaninę reakcyjną.
UWAGA: Na tym etapie manipulacji można kontrolować wzrokowo dystrybucję bezbarwnego
roztworu przerywającego reakcję. Kolor substratu, różowy (w przypadku próbek ujemnych) lub
niebieski (w przypadku próbek dodatnich), blaknie w zagłębieniach, które stają się bezbarwne
[PL] 8
(w przypadku próbek ujemnych) lub żółte (w przypadku próbek dodatnich) po dodaniu roztworu
przerywającego reakcję.
11) Ostrożnie wytrzeć spód płytki. Zaczekać co najmniej 4 minuty roztworu przerywającego
reakcję i w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji odczytać gęstość optyczną przy 450/620690 nm, używając czytnika płytek.
12) Sprawdzić zgodność odczytów spektrofotometrycznych i wizualnych oraz dystrybucji płytek
i próbek oraz planu identyfikacyjnego.
7.4. Kontrola jakości
Użyć wskaźnika ujemnego (R3) oraz dodatniego (R4) dla każdego przebiegu w celu zweryfikowania
wyników testów. (Patrz § 7.5).
7.5. Kryteria walidacji testu
Test jest zweryfikowany, jeśli są spełnione poniższe warunki:
1) W przypadku wskaźnika ujemnego R3:
OD R3 ≤0,080
Jeśli wartość kontrolna jest wyższa niż ta wartość, nie należy jej brać pod uwagę i przeprowadzić
obliczenia używając dwóch pozostałych ujemnych wartości kontrolnych.
2) W przypadku wskaźnika dodatniego R4:
OD R4 ≥0,900
7.6. Obliczanie/interpretacja wyników
Wartość graniczną określa się przy użyciu wskaźnika ujemnego R3:
Obliczyć średnią wartość absorbancji mierzoną dla wskaźnika ujemnego R3 i obliczyć wartości
odcięcia (COV) w następujący sposób:
COV = średnia wartość OD R3 + 0,100
Próbki z OD mniejszym niż COV są uważane za ujemne dla Syphilis Total Ab.
Wyniki tuż poniżej wartości odcięcia (COV -10% <OD < COV) powinny być jednak interpretowane
z ostrożnością. Jeśli zezwalają na to systemy i procedury laboratoryjne, zaleca się ponowne
przetestowanie duplikatu odpowiednich próbek.
Próbki o OD wyższym niż lub równym COV są uważane za dodatnie dla Syphilis Total Ab; przed
wykonaniem ostatecznej interpretacji należy ponownie przetestować duplikaty.
Ponownie przetestowane próbki, które dają wynik powyżej COV w co najmniej jednym duplikacie są
uważane za dodatnie i powinny być poddane dalszej weryfikacji. Próbki, których wynik jest poniżej
odcięcia dla obydwóch duplikatów, są uważane za ujemne.
W przypadku bardzo niskiej gęstości optycznej testowanych próbek (ujemna wartość OD)
i kontrolowania obecności odczynników oraz próbek wyniki mogą być interpretowane jako ujemne.
Zaleca się potwierdzenie dodatnich próbek, postępując zgodnie z obowiązującymi krajowymi
zaleceniami i algorytmami.
7.7. Spektrofotometryczna weryfikacja próbki i pipetowanie koniugatu
(opcjonalnie)
Próbki i kontrole
Obecność próbek i kontroli w zagłębieniach można zweryfikować przez automatyczny odczyt przy
450/620 nm.
Zagłębienie z dodaną próbką będzie mieć gęstość optyczną (OD) od 0,050 do 1,100.
Koniugat
Koniugat ma kolor czerwony.
[PL] 9
Obecność koniugatu w zagłębieniach można kontrolować przez automatyczny odczyt przy
450/620 nm. Zagłębienie z próbką i koniugatem będzie mieć OD ≥1,200.
Weryfikacja pipetowania roztworu wywoławczego
Możliwe jest zweryfikowanie obecności różowego roztworu wywoławczego w zagłębieniu przez
automatyczny odczyt przy 492 nm.
Zagłębienie z roztworem wywoławczym musi mieć gęstość optyczną >0,100 (mniejsza wartość OD
oznacza nieodpowiednie dozowanie roztworu wywoływacza).
8. OGRANICZENIE TESTU
Jak w przypadku wszystkich testów serologicznych w kierunku kiły, w celu przedstawienia całościowej
diagnozy klinicznej należy użyć interpretacji wyników uzyskanych w ramach testu Syphilis Total Ab
EIA w połączeniu z objawami klinicznymi pacjenta, historią choroby i innymi wynikami badań
laboratoryjnych.
Nie ma jednego testu lub ostatecznego standardu odniesienia dla każdego stadium choroby.
Diagnostyka kiły opiera się zatem głównie na badaniach serologicznych, wymagających wyników
z metod bezkrętkowych i krętkowych.
Żaden test diagnostyczny nie zapewnia absolutnej pewności, że próbka nie zawiera niskiego poziomu
przeciwciał przeciwko T. pallidium, takich jak obecne w bardzo wczesnym stadium infekcji. Dlatego też
ujemny wynik uzyskany w dowolnym momencie nie wyklucza możliwości narażenia na zakażenie kiłą.
Wszelkie techniki ELISA mogą zwracać wyniki fałszywie dodatnie. Zaleca się sprawdzanie swoistości
reakcji dowolnej próbki, która wielokrotnie dawała wynik dodatni, według kryteriów interpretacji
zestawu Syphilis Total Ab, stosując odpowiednią metodę: Test hemoglutynacji Treponema pallidum.
Wszystkie wyniki krętkowe mają tendencję do pozostawania reaktywnymi po zakażeniu krętkami,
dlatego nie powinny być wykorzystywane do oceny odpowiedzi na leczenie. Ze względu na
utrzymującą się reaktywność, na ogół przez całe życie pacjenta, testy w kierunku krętków nie mają
żadnej wartości w ustalaniu nawrotów lub ponownego zakażenia pacjenta, który miał wynik reaktywny.
W takim wypadku zaleca się zastosowanie innej metody oznaczania: Syphilis IgM EIA, RPR i TPHA.
Spektrofotometryczna metoda weryfikacji próbek, koniugatu, osadu roztworu wywoławczego nie
umożliwia zweryfikowania dokładności dozowanej objętości próbek i koniugatu. Ta metoda pokazuje
jedynie obecność próbki i koniugatu. Współczynnik błędów przy stosowaniu tej metody jest ściśle
związany z dokładnością używanego systemu (skumulowany współczynnik zmienności powyżej 10%
dla dozowania i odczytywania znacznie obniża jakość tego etapu).
9. CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA
9.1. Dokładność pomiaru
Powtarzalność i dokładność pośrednia zostały ustalone przy użyciu próbek z różnymi stężeniami
przeciwciał kiły. Próbki testowano 30 razy w tej samej serii testów w celu określenia powtarzalności.
Próbki były również badane w dwóch duplikatach w ciągu 20 dni, po dwa testy dziennie.
Obliczano średnie współczynniki, standardowe odchylenia (SD) i współczynniki zmienności (CV).
[PL] 10
9.1.1. Powtarzalność:
N
Średni
współczynnik
Odchylenie
standardowe
CV %
Niski ujemny
30
0,14
0,014
9,5%
Wysoki ujemny
30
0,68
0,051
7,5%
Niski dodatni Syphilis ab
30
1,90
0,070
3,7%
Dodatni Syphilis ab
30
3,76
0,130
3,5%
Próbki
CV uzyskane z pozytywnych próbek są poniżej 10%.
Dokładność pośrednia
Próbki
N
Średni
współczynnik
Oznaczenie
wewnętrzne
Oznaczenie
pośrednie /
Operator
SD
CV %
SD
CV %
SD
CV %
SD
CV %
Dzień
pośredni
Powtarzalność
całkowita
Niski ujemny
80
0,15
0,035
22,5%
0,023
14,7%
0,017
10,9%
0,045
29,0%
Wysoki ujemny
80
0,74
0,038
5,1%
0,074
10,0%
0,006
0,8%
0,084
11,2%
80
2,30
0,112
4,9%
0,312
13,5%
0,099
4,3%
0,346
15,0%
80
4,13
0,180
4,3%
0,543
13,1%
0,195
4,7%
0,604
14,6%
Niski dodatni
Syphilis ab
Dodatni Syphilis
ab
CV uzyskane z próbek dodatnich są poniżej lub równe 15%.
9.2. Działanie kliniczne
Działanie kliniczne oznaczania w teście Syphilis Total Ab ustalono testując próbki z badań
prospektywnych i retrospektywnych:
Badanie prospektywne:
- 5195 próbek od losowo dobranych dawców krwi;
- 460 próbek od pacjentów, u których podejrzewano kiłę
Badanie retrospektywne:
- Wynik dodatni u 350 pacjentów z chorobami przenoszonymi drogą płciową.
Badania przeprowadzono w dwóch punktach krwiodawstwa, w centrum chorób przenoszonych drogą
płciową i w ośrodku Bio-Rad.
9.2.1. Swoistość diagnostyczna
Badanie przeprowadzono na próbkach surowicy i osocza EDTA, zebranych na dwóch bankach krwi
od przypadkowych dawców we Francji.
Badanie swoistości przeprowadzono również na próbkach pobranych od pacjentów.
Wszystkie wyniki porównano z wynikami uzyskanymi z innych testów w kierunku kiły z oznaczeniem
CE.
[PL] 11
Tabela 1: Swoistość testu (IR = początkowa reaktywny; RR = powtarzalnie reaktywny)
Populacja
Dawcy
krwi
Ośrodek
#1 + #2
Pacjenci
#3
Łączna
liczba
próbek
Początkow
o
reaktywne
(IR)
Powtarzaln
ie
reaktywne
(RR)
Swoistość
RR (%)
Surowica SST
3127
2
2*
3125/3125
Osocze EDTA K2
2068
2
2*
2066/2066
Razem
5195
4
4*
Surowica
351
1
1
Typ próbki
100%
5191/5191
99,72%
350/351
95% CI (%)
99,93%–
100%
98,42–100%
*Powtarzalnie
reaktywne próbki dające wynik dodatni z innymi EIA z oznaczeniem CEOznaczanie w kierunku
kiły zostały wykluczone z obliczeń swoistości diagnostycznej.
9.2.2. Czułość diagnostyczna
Badanie retrospektywne:
Badanie przeprowadzono na 350 zamrożonych próbkach, z których dwie próbki dały wynik ujemny
i 348 dało potwierdzony wynik dodatni z oznaczeniem CE w kierunku kiły.
Spośród tych 348 próbek dodatnich, 7 próbek pochodziło od pacjentów z wczesnym stadium
zakażenia.
Wszystkie 348 próbki dały wynik pozytywny przy zastosowaniu testu Bio-Rad Syphilis Total Ab.
Badanie prospektywne:
Stosując test Syphilis Total Ab firmy Bio-Rad zbadano łącznie 460 świeżych próbek i porównano je
z wynikami testów w kierunku kiły z oznaczeniem CE.
Uzyskano 348 wyników ujemnych zarówno w testach Bio-Rad i referencyjnych (wyniki dwóch próbek
zostały błędnie oznaczone jako fałszywie dodatnie względem testu referencyjnego EIA)
W obydwóch badaniach testowych stwierdzono 109 wyników dodatnich.
Trzy próbki wykazywały sprzeczne wyniki (po powtórnym przetestowaniu testem Bio-Rad):
• W teście Bio-Rad 1 próbka dała wynik dodatni i wysoce ujemny w testach referencyjnych. Ta
próbka z niskim wskaźnikiem kiły była na granicy wartości odcięcia dla obu testów EIA:
• 1 próbka z wynikiem dodatnim w testach referencyjnych, z wynikiem ujemnym w teście BioRad (od 1 pacjenta bez objawów)
• 1 próbka z wynikiem dodatnim z testów referencyjnych, z wynikiem ujemnym IR i dodatnim
z ponowionego testu Bio-Rad.
Badania retrospektywne i prospektywne:
Ogólna czułość diagnostyczna jest równa 99,56% (457/459) z przedziałem ufności na poziomie 95%
[98,44% z 99,95%].
Czułość kliniczna:
Zbadano również czułość kliniczną w 3 panelach komercyjnych i 1 panelu serokonwersji. Test Syphilis
Total Ab firmy Bio-Rad porównano z testami w kierunku kiły z oznaczeniem CE. Wykrywanie każdej
próbki paneli jest równoważne między testem Bio-Rad oraz testami referencyjnymi w kierunku kiły.
9.3. Czułość analityczna
Czułość analityczna została oceniona według 2 norm NIBSC i obliczana według wartości odcięcia za
pomocą regresji:
1. Granica wykrywalności dla IgG/IgM była oceniana na 3 seriach testu Syphilis Total Ab
i oszacowana na 0,53 mIU/ml z 95% CI [0,10 mIU/ml – 1,30 mIU/ml] przy użyciu normy WHO
dla IgM/IgG (kod NIBSC: 05/132).
2. Granica wykrywalności dla IgG była oceniana na 1 serii testu Syphilis Total Ab i oszacowana
na 0,11 mIU/ml z 95% CI [0,02 mIU/ml – 0,27 mIU/ml] przy użyciu normy WHO dla IgG (kod
NIBSC: 05/122).
[PL] 12
9.4. Swoistość analityczna / badanie reaktywności krzyżowej
W teście Syphilis Total Ab zbadano łącznie 125 potencjalnie zakłócających próbek zawierających
przeciwciała patogenów, które mogą prowadzić do chorób zakaźnych (Lyme, toksoplazmoza, EBV,
Leptospiroza, SLE (toczeń), przeciwciała wirusowego zapalenia wątroby typu A, przeciwciała
wirusowego zapalenia wątroby typu B, przeciwciała wirusowego zapalenia wątroby typu C, HTLV I/II
i HIV) lub próbki od pacjentów z grupy ryzyka (kobiety w ciąży i kobiety wieloródki) bądź próbki od
pacjentów z zaburzeniami układu odpornościowego (czynnika reumatoidalnego).
Wśród zbadanych 125 próbek 1 próbka dała wynik powtarzalnie dodatni w teście Syphilis Total Ab;
próbka ta została zweryfikowana jako prawdziwa w badaniach z użyciem innych testów EIA
z oznaczeniem CE i testów potwierdzających.
Swoistość zaobserwowana na tej populacji wynosi 100% (124/124), z 95% przedziałem ufności
[97,1% – 100,0%].
9.5. Efekt „haka”
Istnienie ewentualnego wpływu haka przebadano testując 6 próbek z wynikiem dodatnim w kierunku
kiły, z wysokimi mianami w różnych rozcieńczeniach. Równoważność wyników obserwowanych
w nierozcieńczonej i rozcieńczonej próbce wskazuje na brak efektu haka na badanych próbkach.
10. BIBLIOGRAFIA
1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay
Interference. J. Clin. Immunoassay 15: 108-115,1992.
2. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their
structural, functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt. 1993 Vol 57.
3. Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for
syphilis. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1):1–21.
4. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay
for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol. 1995
Mar; 33(3):525–7.
5. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and
some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187–209.
6. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin
Chem Lab Med. 2009. 47:596-606.
7. International Journal of STD & AIDS 2009; 20: 300–309.
8. Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization.
2009
9. M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, 'It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody
Screening Tests for Diagnosis of Syphilis', J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6.
[PL] 13
[PL] 14
[PL] 15
[PL] 16
[PL] 17
Bio-Rad
3, Boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette Francja
Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00
Faks: +33 (0) 1 47 41 91 33
www.bio-rad.com
2014/11
883679
[PL] 18