Chemometrycznie wspomagana analiza oddziaływania α

Chemometrycznie wspomagana analiza oddziaływania α-laktoalbuminy
z modelową błoną lipidową
mgr Adriana Litwioczuk - Mammadova
Promotor: Prof. dr hab. Maria Rospenk
Promotor pomocniczy: dr Katarzyna Cieślik-Boczula
Niniejsza rozprawa doktorska pt. „Chemometrycznie wspomagana analiza oddziaływania
α-laktoalbuminy z modelową błoną lipidową” zawiera omówienie wyników otrzymanych podczas
realizacji celu pracy, jakim było zbadanie wzajemnego oddziaływania między bydlęcą
α-laktoalbuminą (-LA) w różnych stanach konformacyjnych a modelową błoną lipidową zbudowaną
z cząsteczek DPPC (dipalmitoilofosfatydylocholina), w funkcji temperatury i pH. W pierwszym
rozdziale pracy, zatytułowanym „Przegląd literaturowy”, przedstawiono aktualny stan wiedzy na
temat właściwości i struktury poszczególnych składników badanego kompleksu, tj. błony DPPC oraz
-laktoalbuminy. Zaprezentowano również główne techniki pomiarowe powszechnie stosowane do
badao układów biologicznych a mianowicie spektroskopię FT-IR-ATR oraz spektroskopię
fluorescencyjną. Przegląd literaturowy zawiera także opis stosowanych metod chemometrycznych:
analizy czynników głównych (PCA) i dwuwymiarowa analiza korelacyjna (2D-COS), które pozwoliły na
zwiększenie rozdzielczości spektralnej widm i otrzymanie pełnej charakterystyki badanego efektu.
Cel pracy oraz kolejne kroki jego realizacji omówiono szczegółowo w rozdziale drugim.
W części eksperymentalnej pracy szczegółowo opisano procedurę otrzymywania badanych
układów, warunki i parametry pomiarowe, sposób przygotowania danych spektralnych do analizy
chemometrycznej, zagadnienie „Generalnej Polaryzacji” oraz sposób wyznaczania stężeo
otrzymywanych próbek.
Najważniejszą częśd pracy zatytułowaną „Wyniki i Dyskusja” podzielono na cztery
podrozdziały, które odpowiadają kolejnym zadaniom, wyznaczonym w celu zrealizowania założeo
pracy. Pierwszy z nich przedstawia analizę zmian konformacyjnych -LA towarzyszących przejściu ze
stanu natywnego do kwasowej stopionej globuli. Do najważniejszych wniosków wynikających z tej
części pracy należą:
 Przejście -LA ze stanu natywnego do kwasowej stopionej globuli jest procesem o charakterze
„wszystko albo nic”.
 Początkowe obniżenie pH z 8 do 4, powoduje głównie zmiany strukturalne w obrębie pętli oraz
wokół reszt Trp w otoczeniu silnie apolarnym (Trp26 i Trp104).
1
 W koocowym etapie formowania się kwasowej stopionej globuli dochodzi do silnej reorganizacji
-helis, zmian w obrębie struktur -zgięd i -kartki oraz do wyeksponowania wszystkich
czterech reszt Trp w kierunku polarnych cząsteczek rozpuszczalnika.
 W przedziale pH od 5 do 4 -LA tworzy agregaty, które w silnie kwaśnym środowisku ulegają
przekształceniu w monomeryczne formy kwasowej stopionej globuli.
W drugiej częśd rozdziału pt. „Wyniki i dyskusja” zbadano termiczną stabilnośd uwodnionych
filmów -LA w stanie natywnym (N) i kwasowej stopionej globuli (MG) oraz w punkcie pośrednim
przejścia NMG. To pozwoliło przedstawid następujące profile zmian:
 W początkowym etapie grzania próbki -LA przy pH 8, zachodzą liniowe zmiany w obrębie
struktur -helikalnych, które w zakresie wysokich temperatur tworzą zagregowane struktury
-kartki (tzw. termiczne przejście ).
 Wzrost temperatury próbek białka o pH 3.5, oprócz termicznego przejścia , powoduje
również reorganizację w obrębie izolowanych struktur -kartki.
 Grzanie -LA w stanie kwasowej stopionej globuli prowadzi do jej termicznej denaturacji, której
towarzyszą gwałtownie zmiany strukturalne -helis, -zgięd już w początkowym etapie.
Kolejny podrozdział zawierający porównanie zmian strukturalnych błony lipidowej podczas
głównego przejścia fazowego, pokazał, że:
 Podczas głównego przejścia, nie zależnie od pH, zmiany upakowania błony DPPC z symetrii
trójskośnej do zaburzonej heksagonalnej zachodzą przed jej uwodnieniem.
 Obniżenie pH zachowuje podobny stan konformacyjny łaocuchów alifatycznych, uwodnienia
fazy żelowej na poziomie grup estrowych oraz zbliżone ułożenie przestrzenne fragmentu
fosforanowego w fazie ciekłokrystalicznej.
 Zmiana kwasowości z pH 8 do 2 powoduje protonację grup fosforanowych co prowadzi do
utworzenia sieci wiązao wodorowych typu PO···HOP, które zwiększają siłę oddziaływao van der
Waalsa między łaocuchami alifatycznymi i tym samym zmniejszają efektywną polarności błony,
co w konsekwencji prowadzi do ogólnego wzrostu stabilizacji błony.
Rezultaty badao wpływu modelowej błony lipidowej na termiczną stabilnośd -LA w różnych
stanach konformacyjnych, przedstawione w trzecim podrozdziale, pozwoliły sformułowad
następujące wnioski:
2
 Oddziaływanie z błoną DPPC, niezależnie od pH, powoduje obniżenie stabilności termicznej
-LA, efekt ten jest najsilniejszy w trakcie kontaktów -LA z błoną w fazie żelowej i podczas
samego głównego przejścia fazowego.
 Mechanizm wbudowywanie się -LA w błonę DPPC przy pH 8 i 2 jest bardzo podobny. W
pierwszym etapie grzania białko wbudowuje się w dwuwarstwy lipidowe elementami
-helikalnymi, natomiast w zakresie wysokich temperatur białko wnika aż w apolarną częśd
błony.
 Przy pH 3.5 oddziaływanie -LA z błoną zachodzi według odmiennego scenariusza. Wbudowanie
się białka w struktury błony następuje znacznie szybciej i w przeciwieostwie do pozostałych
próbek, w zakresie niskich temperatur, ten proces nie odbywa się poprzez -helisy. Kontakty z
błoną wymuszają na białku przybranie takiej struktur, która zapewnia izolację grup Trp od
polarnego otoczenia.
W ostatniej części „Wyników i dyskusji” umieszczono opis wpływu obecności -LA na
właściwości fizykochemiczne modelowej błony lipidowej w zależności od pH, na postawie którego
wykazano:
 Tworzenie się micelarnego kompleksu białkowo-lipidowego przy pH 3.5 przez solubilizację błony
DPPC przez -LA na krysztale ATR, który ulega konwersji do formy lameralnej w zakresie
najwyższych temperatur.

Kompleks micelarny -LA/DPPC odznacza się silnie polarnym otoczeniem grup -PO2- przez
wzrost uwodnienia spowodowany obecnością -LA lub przez bezpośrednie oddziaływanie grup
fosforanowych DPPC z polarnymi resztami aminokwasowymi białka.

Oddziaływanie -LA w stanie natywnym nie wywołuje znacznego wpływu na właściwości
fizykochemiczne błony DPPC.

Wbudowanie się białka w stanie kwasowej stopionej globuli powoduje największe zmiany w
części polarnej błony zwłaszcza w obrębie fragmentu CG-O-P-O-CC.
Rozprawę doktorską zakooczono podsumowaniem, w którym przedstawiono najważniejsze
osiągnięcia uzyskane w trakcie prowadzonych badao. Ostatnie kilkanaście stron zajmuje spis
fachowej literatury z której korzystano podczas przygotowania niniejszej rozprawy.
3