S. cerevisiae

Organizmy modelowe drożdże
Saccharomyces cerevisiae i nie tylko
Co można badać na drożdżach?
•
Praktycznie wszystkie podstawowe aspekty biologii molekularnej,
biologii komórki, genetyki
Transdukcja sygnału
To czego nie można badać na
drożdżach
•
Różnicowanie i rozwój
•
Neurobiologia
•
Regulacja przez małe niekodujące RNA (siRNA, miRNA)
•
Alternatywny splicing
Drożdże i cykl komórkowy
Nobel dla drożdży
Drożdże i cykl komórkowy
Nobel 2001
Cykl komórkowy
Mutanty cdc S. cerevisiae
•
Cykl komórkowy podobny do wyższych Eukaryota
•
•
Fazy G1, S, G2, M i wrzeciono podziałowe
Lee Hartwell – zastosowanie genetyki drożdży do badania cyklu
komórkowego (1970-73)
!
•
Mutanty temperaturowrażliwe (ts), analizowane za pomocą mikroskopii
(zdjęcia poklatkowe)
•
populacja zatrzymuje się w tej fazie, której dotyka mutacja
•
stwierdzenie, której fazy cyklu dotyczy defekt w mutancie
Mutanty cdc S. cerevisiae
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2001/hartwell-lecture.pdf
Mutanty wee i cdc u S. pombe
•
Podziały komórki skoordynowane z wzrostem komórek
!
•
Mutant wee – komórki zaczynają się dzielić, kiedy są jeszcze małe –
zaburzona kontrola startu cyklu
Regulacja cyklu
•
wee1 – inhibitor cyklu;
•
cdc25, cdc2 – aktywatory
•
mutant typu wee dominujący
(konstytutywna aktywność)
•
utrata funkcji – duże komórki
Regulacja cyklu komórkowego
Od drożdży do człowieka
•
mutację cdc2 S. pombe można odwrócić wprowadzając na
plazmidzie ludzki gen CDK1 (Cyclin Dependent Kinase)
Drożdże i transkrypcja
Kolejny Nobel dla drożdży
Drożdże i transkrypcja
Drożdże i transkrypcja
Drożdże i transkrypcja
Drożdże i transkrypcja
Łatwość hodowli – przydatne w projektach oczyszczania i krystalizacji białek
Drożdże i mitochondria
Profil metaboliczny S. cerevisiae
•
Fakultatywne aeroby
•
Efekt Pasteura – tlen hamuje fermentację, ale…
•
Efekt Crabtree – w obecności glukozy (C6) fermentacja
anaerobowa nawet w obecności tlenu
•
Glukoza hamuje oddychanie
•
Etanol jest następnie wykorzystywany (jeżeli nadal jest tlen)
•
Strategia “akumulacja i konsumpcja”
S. cerevisiae i mitochondria – co
szczególnego?
•
Przeżywa bez funkcji oddechowej
(fakultatywny tlenowiec,
fermentacja)
•
•
Mutanty z defektywnym
oddychanie, – petite (lata 1960.)
Przeżywa bez genomu
mitochondrialnego (“petite
positive”)
glukoza
glicerol
(fermentacja) (oddychanie)
Fenotyp petite u S. cerevisiae
•
Zmiany w mtDNA
•
0
ρ
•
ρ
•
mit- - mutacje punktowe, prawidłowa struktura genomu
– całkowita utrata mtDNA
– częściowa utrata mtDNA, znaczne delecje i
reamplifikacja
!
•
Zmiany w nDNA – mutanty pet
Oddziaływania jądrowo
mitochondrialne
•
Proteom mitochondrium ~500-800
białek
•
8-9 kodowane w mtDNA
•
Ponad 150 genów jądrowych
niezbędnych do utrzymania
mitochondrialnego systemu
genetycznego
jądro
mitochondrium
Ucieczka genów
Ewolucja nowych funkcji
Utrata genów
Kompleks III Kompleks IV syntaza ATP
III
Błona wewnętrzna
IV
V
Matrix
Cox1
polimeraza RNA
Cox3
Atp6
Cox2
Atp9
Atp8
Cob
on
Rpo41
lati
s
n
Tra
24 tRNA
Mtf1
21S rRNA
mtDNA
Cob, Cox1, Cox2, Cox3, Atp6,
Atp8, Atp9, Var1
LSU
Transkrypcja
Translacja
SSU
15S rRN
A
9S RNA
Var1
+
Rybosom
Rpm2
RNaza P
Bartosz Zapisek, 2011.
Nie tylko S. cerevisiae
•
S. cerevisiae był od dziesiątków lat standardowym modelem genetyki
mitochondrialnej
•
metabolizm fakultatywnie aerobowy
•
przeżywa bez mtDNA (petite positive)
!
•
Pod wieloma względami jest nietypowy
•
przeżywa bez mtDNA (petite positive)
•
nietypowa organizacja, ekspresja i replikacja mtDNA
•
brak genów kompleksu I (dehydrogenaza NADH) w mtDNA
•
genom po epizodzie duplikacji całego genomu (WGD) i utracie redundantnych paralogów
Drożdże jako model dla
genetyki człowieka
Genomy
S. cerevisiae
~1,2 x 107 bp
~6500 genów
H. sapiens
~3 x 109 bp
~25 000 genów
~1800 genów wykazuje
homologie z genami H.
sapiens (30%)
~ 4000 genów wykazuje
homologie z genami S.
cerevisiae (13%)
Wiele podstawowych funkcji komórki jest
zachowanych.
Niekiedy możliwa wymienność białek drożdżowych i
ludzkich (np. Ras, Oxa1)
Baza danych
Przykładowe drożdżowe modele
chorób
•
Progerie Wernera i Blooma
•
Choroby związane z defektami naprawy DNA (HNPCC, ataksjatelangiektazja)
•
Ataksja Friedreicha
•
Zaburzenia komunikacji jądrowo - mitochondrialnej (PEO)
•
Choroby wywołane mutacjami w mtDNA (NARP)
•
Poszukiwanie leków za pomocą drożdży
Zespół Wernera
•
Normalny rozwój w dzieciństwie.
•
Przedwczesne starzenie rozpoczyna się
wraz z wiekiem dojrzewania.
•
Niski wzrost, owrzodzenia, zwapnienia,
siwienie włosów.
•
Pacjenci dożywają średnio 47 lat.
•
Przyczyną śmierci z reguły choroba
nowotworowa, albo schorzenia sercowonaczyniowe.
Przyczyna:
mutacje genu WRN kodującego
helikazę DNA z rodziny RecQ
Zespół Blooma
•
Opóźniony wzrost, karłowatość.
•
Zaburzenia pigmentacji skóry.
•
Predyspozycje do wczesnego (ok. 25 r.
ż.) występowania wielu różnych
nowotworów.
•
Z reguły nie dożywają 40-50 lat (1/3 nie
dożywa 25 lat).
Przyczyna:
mutacje genu BLM kodującego
kolejną helikazę DNA z rodziny RecQ
Zaburzenia w zespołach Wernera i
Blooma
•
Utrata stabilności genomu
•
Zaburzenia w okolicach
telomerów (WRN)
•
Zwiększona częstość wymiany
chromatyd siostrzanych (BLM)
•
Zwiększona częstość zaburzeń
kariotypowych
•
Zwiększona częstość mutacji
genów
SGS1 – model drożdżowy
•
Gen SGS1 jest drożdżowym homologiem genów WRN i BLM.
•
Fenotyp delecji SGS1:
•
zwiększona rekombinacja mitotyczna (zwłaszcza subtelomerowa)
•
zaburzenia segregacji chromosomów
•
zaburzenia mejozy
!
•
Białko Sgs1p jest zaangażowane w hamowanie nieuprawnionej
rekombinacji i utrzymywanie stabilności genomu.
•
Ludzkie geny BLM i WRN częściowo komplementują fenotyp delecji SGS1
C1orf31, COA6
•
C1orf31 - zachowywany w ewolucji gen, funkcja u człowieka
nieznana
•
Mutacje u chorych na choroby serca (kardiomiopatia przerostowa)
związane z defektami mitochondrialnymi
•
Homolog drożdżowy - COA6
COA6
•
Zaangażowany w składanie
kompleksu IV (oksydaza
cytochromowa)
Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014)
doi: 10.1093/hmg/ddu069
Fenotyp odwracany przez dodanie
2+
Cu
•
W sekwencji białka motywy, które
mogą wiązać jony miedzi
Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014)
doi: 10.1093/hmg/ddu069
Model mutacji znalezionych u
pacjenta
•
Mutacje u chorych w
konserwowanych pozycjach
•
Fenotyp zgodny z defektem
oddychania komórkowego
Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014)
doi: 10.1093/hmg/ddu069
Model w układzie wielokomórkowym
•
•
Wyciszenie homologicznego genu
w zarodkach ryby Danio (TB wyciszenie, MMC - kontrola)
•
nie wymaga funkcjonalnego serca
przez pierwsze 4-5 dni rozwoju
•
u ssaków byłby to efekt letalny
Fenotyp - defekt rozwoju serca
Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014)
doi: 10.1093/hmg/ddu069
Zaburzenia komunikacji jądrowomitochondrialnej
•
Mutacje w genach kodujących białka odpowiedzialne za
utrzymanie mtDNA
•
ANT1 (transporter ADP/ATP)
•
POLG (polimeraza DNA)
!
•
Choroby dziedziczone autosomalnie, objawiają się delecjami w
mtDNA lub deplecją mtDNA
PEO
•
PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie mięśni
gałki ocznej)
•
Postać dominująca (adPEO) lub recesywna (arPEO)
•
Objawy
•
opadanie powiek (ptosis),
•
niezdolność do poruszania gałkami oczu,
•
ogólne osłabienie mięśni,
•
zaburzenia neurologiczne,
Mutacje i modele drożdżowe
•
POLG (mitochondrialna polimeraza DNA)
•
•
drożdżowy homolog MIP1
ANT1 (mitochondrialny transporter ATP/ADP
•
drożdżowy homolog AAC2
http://tools.niehs.nih.gov/polg
Homologia POLG i MIP1
•
Mutacje w MIP1 powodują niestabilność genomu
mitochondrialnego
•
spontaniczne delecje
•
mutacje punktowe
•
całkowita utrata mitochondrialnego DNA
Choroby wywołane mutacjami w
mtDNA
•
Np. NARP – Neurogenic Ataxia Retinitis Pigmentosa
•
Mutacja w genie ATP6
•
W komórkach 70-90% zmutowanego DNA
•
Obniżona aktywność syntezy ATP
Drożdżowe modele chorób
mitochondrialnych
•
S. cerevisiae – jedyny organizm
modelowy, u którego można
wprowadzać DNA do
mitochondriów – ukierunkowana
mutageneza mtDNA
Rak, M. et al. J. Biol. Chem. 2007;282:34039-34047
Poszukiwanie nowych leków
Identyfikacja substancji aktywnych
Drożdże na szalce
(murawa)
Testowane związki
nakraplane na krążki filtrów
Drugs are
deposited on filters
kontrola negatywna
Związki aktywne
Identyfikacja celów działania substancji
aktywnych za pomocą genomiki drożdży
Długowieczność i starzenie
Długowieczność drożdży
•
Zastosowanie drożdży S. cerevisiae jako modelu zjawisk
związanych ze starzeniem proponowano od lat 60. (Mortimer &
Johnson)
•
Dwa mechanizmy
•
starzenie replikatywne – limit podziałów komórki-matki (~30)
•
starzenie chronologiczne – przeżywalność w fazie spoczynkowej
hodowli (wyczerpane źródła energii)
Mechanizmy kontrolujące długowieczność
mogą być konserwowane w ewolucji
Drożdże i biologia systemów
Drożdże w XXI wieku
Poszukiwanie interakcji genetycznych
•
Oddziaływania łagodzące (np. supresja)
•
selekcja bezpośrednia
!
•
Oddziaływania syntetyczne
•
syntetyczna letalność:
•
•
pojedyncze mutacje gen1 i gen2 nie są letalne, ale podwójny mutant gen1, gen2
nie przeżywa
syntetyczne wzmocnienie
•
pojedyncze mutacje gen1 i gen2 słaby fenotyp, podwójny mutant gen1, gen2 silny
fenotyp (np. spowolnienie wzrostu)
Ujęcie ilościowe
Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25
SGA
•
Synthetic Gene Array
•
Kolekcja delecji, krzyżowana z
badanym genem
•
Sporulacja,
•
Selekcja haploidów MATa
•
Selekcja pojedynczych i
podwójnych mutantów
Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437
SGA
http://www.utoronto.ca/boonelab/sga_technology/index.shtml
dSLAM
Diploid-based synthetic lethality analysis with microarrays (dSLAM)
Wyniki – sieci interakcji genetycznych
Costanzo i wsp., (2010) Science 327, 425
Ewolucja eksperymentalna
Ewolucja eksperymentalna
•
Możliwość prowadzenia wielu hodowli równolegle przez wiele
pokoleń
Ewolucja wielokomórkowości
•
Selekcja w hodowlach S. cerevisiae w kierunku szybkiego opadania
osadu
!
•
Pojawiają się grupy komórek (“płatki śniegu”)
Ewolucja wielokomórkowości
wyjściowe - jednokomórkowe
po 14 pokoleniach
selekcji
po 60 pokoleniach
selekcji
Ewolucja specjalizacji
•
Pod koniec w zgrupowaniach
pojawił się podział funkcji –
niektóre komórki inicjują
programowaną śmierć by ułatwić
podział grupy przez fragmentację
Podział kolonii
Podział kolonii