na ekspresję genów na przykładzie operonu lac

Wpływ tetracykliny i ampicyliny na ekspresję genów na przykładzie operonu lac
Escherichia coli
Prowadzący ćwiczenia:
dr Agata Krawczyk-Balska
Wstęp:
Operon laktozowy (operon lac) jest modelowym przykładem regulacji ekspresji genów
bakteryjnych. Operon laktozowy składa się z trzech genów strukturalnych: lacZ (kodujący βgalaktozydazę), lacY (kodujący permeazę laktozową) i lacA (kodujący transacetylazę βgalaktozydów). W pobliżu operonu laktozowego zlokalizowany jest wyrażany konstytutywnie gen
lacI kodujący represor operonu laktozowego. Represor LacI, pod nieobecność laktozy w
środowisku, pozostaje przyłączony w obszarze operatora operonu (którego sekwencja pokrywa się
ze znaczną częścią promotora operonu) blokując ekspresję genów operonu. Pojawienie się laktozy
(lub innego induktora tj. drobnocząsteczkowego związku zawierającego wiązanie β-galaktozydowe)
i jej połączenie z represorem powoduje zmiany konformacji represora, które prowadzą do utraty jego
powinowactwa do sekwencji DNA operatora i w konsekwencji do derepresji ekspresji genów
operonu lac. Poziom ekspresji genów operonu lac jest również regulowany przez stężenie glukozy w
środowisku – w obecności glukozy operon lac podlega represji katabolicznej, co jest związane z
brakiem „sygnału głodu” tj. niskim poziomem cAMP. cAMP (którego poziom w komórce wzrasta
pod nieobecność glukozy) stymuluje transkrypcję wielu operonów katabolicznych poprzez wiązanie
się z białkiem CRP (zwanym również CAP). Przyłączenie się cAMP do białka CAP powoduje, że
utworzony kompleks wiąże się silnie i specyficznie z sekwencją DNA bezpośrednio poprzedzającą
promotor operonu lac, co skutkuje zwiększeniem częstości wiązania polimerazy RNA i inicjacji
transkrypcji. Schemat budowy operonu lac z zaznaczoną lokalizacją operatora oraz miejscem
wiązania kompleksu cAMP-CAP, przedstawiono na rysunku poniżej.
Tetracyklina – antybiotyk z grupy tetracyklin o szerokim spektrum działania przeciwbakteryjnego,
wytwarzany przez niektóre szczepy Streptomyces.
Ampicylina – półsyntetyczny antybiotyk β-laktamowy z grupy aminopenicylin o szerokim spektrum
działania. W swej strukturze chemicznej zawiera pierścień tiozolidynowy sprzężony z pierścieniem
β-laktamowym.
Cel ćwiczenia: Ocena i porównanie wpływu β-laktamów i tetracyklin na ekspresję genów
bakteryjnych.
Wykonanie ćwiczenia:
1. Przygotować hodowlę wykładniczą Escherichia coli (OD600 = 0,2–0,4) w podłożu
Davisa uzupełnionym glicerolem do stężenia końcowego 0,4 % i hydrolizatem kazeiny do
stężenia końcowego 0,1 % przez zaszczepienie podłoża hodowlą nocną w stosunku 1:25.
1
2. Do hodowli dodać IPTG (izopropylotio--galaktozyd) do końcowego stężenia 0,5 mM z
roztworu IPTG o stężeniu 0,5 M.
3. Pobrać po 20 ml hodowli i przenosi do 3 kolbek, a następnie dodać:
a) do pierwszej kolby – nic (kontrola)
b) do drugiej kolby - ampicylinę do stężenia końcowego 28 g/ml z roztworu o stężeniu 10
mg/ml
c) do trzeciej kolby - tetracyklinę do stężenia końcowego 0,2 g/ml z roztworu o stężeniu 0,1
mg/ml
4. Zmierzyć gęstość optyczną (OD600) każdej hodowli, a następnie odpipetować 1 ml
hodowli do probówki i wstawić ją do lodu.
5. Hodowle po pobraniu prób inkubować z wytrząsaniem w 37 oC. Po 10, 20, 30 i 40
minutach pobierać po 1 ml hodowli do probówek i wstawiać do lodu. Równolegle
mierzyć OD prowadzonych hodowli.
6. Po pobraniu ostatniej próby, wszystkie odwirować z wykorzystaniem mikrowirówki typu
Eppendorf (10 tyś. RPM, 5 minut).
7. Osad zawiesić w 120 l 0,1 M buforu fosforanowego zawierającego 1 mM MgSO4 i
0,25% merkaptoetanol.
8. Do prób dodać 40 l chloroformu i 40 l 0,1 % SDS. Wytrząsać 10 sekund.
9. Dodać 800 l 0,1 M buforu fosforanowego zawierającego 1 mM MgSO 4 i 0,25%
merkaptoetanol.
10. Dodać 175 l roztworu ONPG (o-nitrofenylo--galaktozyd) o stężeniu 4 mg/ml
11. Próby wymieszać i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
12. Do prób dodać 325 l 1,3 M Na2CO3
13. Próby odwirować (5 min., 8 tys. RPM)
14. Przygotować próbę ślepą do pomiarów spektrofotometrycznych przygotowanych prób
(zaproponuj skład próby ślepej ).
15. Wykonać pomiary absorbancji przygotowanych prób przy długości fali  = 420 nm
i  = 550 nm.
16. Obliczyć aktywność -galaktozydazy w badanych próbach korzystając ze wzoru
A = [(OD420 próby badanej – 1,75  OD550 próby badanej)]/ (czas trwania reakcji w minutach
 OD600 komórek w hodowli wykorzystanej do przygotowania mieszanin reakcyjnych)
Opracowanie wyników:
Po przeprowadzonych ćwiczeniach należy:
1. Sporządzić wykres krzywych wzrostu hodowli E. coli bez antybiotyku i w obecności
ampicyliny oraz tetracykliny.
2. Sporządzić wykres zmian aktywności -galaktozydazy w czasie, izolowanej z hodowli E.
coli bez antybiotyku i w obecności ampicyliny oraz tetracykliny
Na podstawie uzyskanych wyników ocenić i porównać wpływ ampicyliny i tetracykliny na
wzrost E. coli oraz poziom ekspresji genu kodującego -galaktozydazę.
Zinterpretować uzyskane wyniki korzystając z danych literaturowych (1, 2).
Literatura:
1. Baj J i Markiewicz Z. Biologia molekularna bakterii. PWN 2006
2. Markiewicz Z, Kwiatkowski A.: Bakterie, antybiotyki, lekooporność. PWN 2001
2