Terapia genowa

biologia i życie
Terapia genowa
– obietnice i rzeczywistość
Terapia genowa jest postrzegana jako dziedzina, która już istnieje. Tak
naprawdę, choć są pewne sukcesy, warto zauważyć, że opis pierwszych
sukcesów terapeutycznych ukazał się ponad 15 lat temu, a nadal
nie ma komercyjnie dostępnej terapii genowej – i nieprędko będzie.
EWA BARTNIK
ało zagadnień jest tak atrakcyjnych jak terapia genowa. Leczenie
chorób związanych z wadliwą ekspresją genów (nowotwory), brakiem ich
produktów lub obecnością produktów
szkodliwych (choroby genetycznie uwarunkowane, choroby neurodegeneracyjne) jest
bardzo często leczeniem objawowym, nieusuwającym przyczyny zaburzenia. Istotą
terapii genowej jest właśnie usunięcie przyczyny – przez wprowadzenie genu, którego
brakuje czy wyłączenie genu, którego produkt jest szkodliwy. Być może to właśnie
spowodowało, że terapia genowa jest przez
wielu ludzi postrzegana jako dziedzina, która już istnieje, a nie taka, którą próbuje się
dopiero wprowadzić. Spotkałam się z odnoszeniem do terapii genowej jako czegoś, co
już jest dobrze ustalone, zarówno w podręcznikach licealnych, jak i w propozycjach zadań maturalnych. Tak naprawdę, choć są
pewne sukcesy, to w naszym komercyjnym
świecie może warto zauważyć, że opis pierwszych sukcesów terapeutycznych ukazał się
ponad 15 lat temu, a nadal nie ma komercjalnie dostępnej terapii genowej – i myślę,
że nieprędko będzie.
M
Geny terapeutyczne można wprowadzać
do komórek pobranych z organizmu (ex vivo), a następnie komórki te wprowadza się
z powrotem do pacjenta. Łatwe do manipulowania w ten sposób są tylko komórki
krwi i szpiku. Często konieczne jest na-
12
mnażanie pobranych komórek in vitro, ponieważ uzyskuje się ich za mało, by mogły,
po wprowadzaniu do nich terapeutycznego
genu, produkować dostatecznie dużo pożądanego produktu i wyleczyć pacjenta.
Alternatywą jest wprowadzanie genu
na wektorze bezpośrednio do organizmu
pacjenta (in vivo). Zazwyczaj w obu typach
terapii stosuje się wektory do wprowadzania DNA.
Wybierając wektor służący wprowadzeniu
terapeutycznego genu, należy mieć
na uwadze to, że głównym celem komórek
ssaka nie jest pobieranie obcego materiału
genetycznego, a wręcz przeciwnie
– od dawna powstały liczne mechanizmy
obronne przeciwko wprowadzaniu takiego
materiału do komórek. Istnieją w zasadzie
trzy sposoby wprowadzania genów do komórek – za pomocą wirusów, jako nagi
DNA i za pomocą różnego rodzaju technik
niewykorzystujących wirusów. Warto jeszcze wspomnieć, że wyłączanie genów defektywnych może się odbywać na innej drodze – przez wprowadzanie tzw. siRNA
Terapia genowa jest przez wielu
ludzi postrzegana jako dziedzina,
która już istnieje, a nie taka,
którą próbuje się dopiero
wprowadzić.
biologia w szkole
biologia i życie
Tabela 1. Wektory wirusowe (wg. www.wiley.co.uk/genmed/clinical i CE Thomas i wsp., Nature Reviews Genetics,
4(2003)346-358, zmodyfikowane.
Materiał
genetyczny
Pojemność
Integracja
do genomu
Retrowirusy
RNA
8 kb
Lentiwirusy
RNA
Adenowirusy
Wirus
% badań
klinicznych
(2006)
Zalety
Wady
Tak
Gen wbudowany
na stałe
Tylko dzielące się komórki;
potencjalna aktywacja
onkogenów
24
8 kb
Tak
Gen wbudowany
na stałe; namnaża
się w większości
typów komórek
Potencjalna aktywacja
onkogenów
0.4
dsDNA
8 kb/30 kb*
Nie
Bardzo dobrze
wnika do większości
tkanek
Silna reakcja
na białka kapsydu
25
AAV
ssDNA
<5 kb
10%
integruje,
na ogół w
konkretnym
miejscu
w chromosomie
19
Niepatogenny,
nie powoduje
zapalenia
Mała pojemność
3,3
HSV-1
dsDNA
40kb/150kb*
Nie
Duża pojemność.
Przenika barierę
krew-mózg
Może wywoływać
zapalenia
3,3
* dotyczy wirusów w zasadzie pozbawionych genów wirusowych
(od ang. small inhibitory RNA – mały hamujący RNA), który specyficznie hamuje
ekspresję danego genu. Technika ta znana
jest jako RNAi (i – od ang. interference).
Bardzo popularnymi wektorami są wirusy
– potrafią obejść zabezpieczenia komórki
przed wprowadzaniem i ewentualnie wbudowywaniem obcego DNA. W obecnie prowadzonych badaniach klinicznych w około 70%
przypadków wykorzystuje się takie wektory.
Są to wirusy należące do grup retrowirusów,
lentiwirusów, adenowirusów, AAV (wirus
związany z adenowirusem) i HSV-1 (wirus
opryszczki). Są też próby stosowania innych
wirusów, np. wirusa ospy krowianki.
Podstawowym problemem przy stosowaniu wektorów wirusowych jest ich chorobotwórczość. Rozwiązuje się go, usuwając
geny, które mogą wywoływać niepożądane
reakcje odpornościowe u leczonej osoby.
Ważne jest, aby wirusy nie replikowały się
w komórkach pacjenta, a tylko wprowadziły odpowiednie geny, a następnie – w mia-
3/2006
rę możliwości – ich pozostałości zanikły.
Wirusy te są silnie pozmieniane, by uniemożliwić im replikację.
Dwie pierwsze grupy (retrowirusy i lentiwirusy) są wirusami RNA, które w swoim cy klu ży cio wym są przepi sy wa ne
na DNA. Wiele retrowirusów to wirusy rakotwórcze u zwierząt. U ludzi nowotwory
stwierdzono tylko dla dwóch wirusów,
HTLV-1 i HTLV-2. Powodują one białaczkę komórek T u niewielkiego procentu osób zakażonych po bardzo długim czasie i oczywiście nie są stosowane jako
wektory. Retrowirusy mają wiele zalet
– łatwo się je otrzymuje i modyfikuje,
a także łatwo się do nich wprowadza geny
(do 2-niciowego DNA, który powstaje
w czasie replikacji). Ich wadą jest to, że
potrafią zakażać tylko komórki, które się
dzielą. Ponieważ terapia może być potrzebna dla niedzielących się tkanek – nabłonka płuc przy mukowiscydozie, komórek nerwowych czy mięśniowych – nie są
one wektorem uniwersalnym.
13
biologia i życie
Lentiwirusy (najbardziej znanym przedstawicielem jest HIV) są bliskimi krewnymi
retrowirusów, zdolnymi jednak do zakażania niedzielących się komórek. Mają podobne zalety do retrowirusów, jednak obie
grupy wektorów mają podobną wadę
– wbudowują się do DNA jądrowego preferencyjnie w miejsca aktywne, tzn. takie,
w których znajdują się działające geny.
Zwiększa to szansę zaburzenia jakiegoś
procesu, a także, ponieważ wirusy wnoszą
ze sobą sekwencje promotorów i enhancerów, możliwość uruchomienia np. ekspresji
onkogenów. Te obawy nie są bezpodstawne, wrócę w dalszej części artykułu do tego
zagadnienia.
Adenowirusy mają genom z dwuniciowego DNA, nie włączają się do genomu.
Bardzo łatwo wprowadza się je do większości tkanek, problemem jest, że białka wirusowe powodują reakcje odpornościowe
i zapalenie. 90% ludzi ma przeciwciała
przeciwko adenowirusom.
AAV są niepatogenne i nie powodują
zapaleń ani reakcji odpornościowych. Jednak mają dość małą pojemność i nie są
jeszcze często stosowane.
Wirusy opryszczki mają dwie zalety – olbrzymią pojemność i zdolność do przenikania przez barierę krew/mózg, co może mieć
duże znaczenie przy terapii chorób neurodegeneracyjnych.
Wprowadzanie terapeutycznych genów
bez stosowania wektorów wirusowych
zyskało na popularności od 1999 r. W czasie jednej z prób klinicznych terapii genowej z wykorzystaniem wirusa zmarł uczestnik badań, 19-letni Jesse Gelsinger.
Przyczyną śmierci była niesłychanie silna
reakcja odpornościowa jego organizmu
na podany adenowirus. Jesse cierpiał
na niedobór karbamoilotransferazy ornitynowej, jednak choroba jako taka była kontrolowana dietą i lekami, a chory nie był
w stanie zagrożenia życia.
Drugim ciosem dla wektorów wirusowych było stwierdzenie, że u trzech z jedenastu chłopców, u których zastosowano te-
14
rapię genową w celu wyleczenia wrodzonego złożonego niedoboru odporności sprzężonego z płcią, rozwinęła się białaczka.
U dwóch z nich stwierdzono, że przyczyną
choroby było wbudowanie się terapeutycznego retrowirusa koło onkogenu LMO2.
(W wypadku trzeciego chłopca nie znalazłam danych). U wszystkich pacjentów
terapia genowa była przeprowadzona
w okresie noworodkowym, na komórkach
macierzystych szpiku, które namnażano in
vitro. Przez pewien czas uzyskane efekty
były uważane za ogromny sukces terapii
genowej.
Dostarczanie DNA do komórek bez
stosowania wirusów można podzielić na
metody wprowadzania nagiego DNA i na
opłaszczanie DNA za pomocą różnych
substancji. W 2006 r. około 25% badań klinicznych prowadzonych jest bez stosowania wektorów wirusowych.
DNA można wprowadzić do komórek
za pomocą powleczonych nim mikropocisków, mikroiniekcji i elektroporacji (DNA
wnika przez pory w błonie komórkowej,
otwarte wskutek impulsu elektrycznego).
Wszystkie te techniki stosuje się raczej
do komórek pobranych z organizmu i są
one mało wydajne. Pewne efekty osiąga się
wstrzykując DNA bezpośrednio do tkanek,
a nie do komórek in vitro.
DNA można też opłaszczać różnymi
otoczkami, które składają się np. z kationowych lipidów, kationowych peptydów lub
polietylenoiminy. Możliwe jest też połączenie tych substancji z ligandem, który jest
rozpoznawany przez specyficzny receptor
na powierzchni danego typu komórek.
Od paru lat wektory te mogą zawierać dodatkowe białka, które np. chronią DNA
przed nukleazami, umożliwiają ucieczkę
z endosomu (przy pobieraniu DNA na drodze endocytozy znajduje się ono w endosomach i może w nich „ugrzęznąć”). Do niektórych wektorów dołączane są np. białka
z sygnałami importu do jądra itp. Jednak
najwięcej sukcesów dotychczas odniosło
wstrzykiwanie plazmidów bez tych wszyst-
biologia w szkole
biologia i życie
kich dodatków do uszkodzonego serca lub
naczyń krwionośnych, plazmidy zawierały
czynnik stymulujący wzrost naczyń (VEGF
– vascular endothelial growth factor).
Warto jeszcze wspomnieć o siRNA.
Odkryte parę lat temu u roślin i nicienia
Caenorhabditis elegans zjawisko wyciszania ekspresji genów przez małe cząsteczki
RNA od paru lat stało się nie tylko ulubioną, ale wręcz niezbędną techniką badań nad funkcjonowaniem genów u ssaków. W każdej pracy badającej jakiś gen
nieomal obowiązkowe stało się podawanie danych o efektach jego wyłączenia
przez siRNA. Pokrótce polega to na tym,
że w komórce RNA są przycinane do
małych kawałków, które łącząc się z konkretnym, komplementarnym mRNA powodują bądź jego degradację, bądź zahamowanie translacji, w efekcie wyciszając
dany gen. Chwilowo zaledwie około 1%
prób klinicznych dotyczy siRNA, jedna
dotyczy zwyrodnienia plamki żółtej, co
może być przyczyną ślepoty u osób starszych. Badany jest siRNA przeciwko receptorowi VEGF i wyniki wydają się być
obiecujące, choć jest to dopiero początek
takich badań u ludzi.
Ogromne nadzieje związane ze stosowaniem terapii genowej nadal pozostają jedynie nadziejami. Niedawno opublikowany
przegląd prób terapii genowej dla najczęstszej choroby monogenowej u rasy białej,
mukowiscydozy (Lee i wsp. 2005), kończy
się stwierdzeniem, że choć wykazano możliwość przenoszenia genów terapeutycznych do nabłonka płuc, poziom ekspresji
jest za niski, by uzyskać efekty terapeutyczne. Mukowiscydoza wydawała się idealnym
kandydatem do terapii genowej, najbardziej poważne objawy występują w stosunkowo łatwo dostępnej tkance – nabłonku
płuc, choroba jest dość częsta, o znanym
dziedziczeniu. Ponadto, co nie jest bez znaczenia, występuje także w bogatych krajach, a jak widać, wyniki kilkunastu lat
kosztownych badań nie są szczególnie zachęcające.
3/2006
Dostępność komórek jest ogromnym problemem. Idealna teoretyczna komórka,
do której ma być wprowadzany terapeutyczny gen, to taka, która żyje wiecznie, jest
łatwo dostępna, będzie wyrażać gen na wysokim poziomie. Nie ma wiele takich typów
komórek, a jeśli nawet są, jak np. macierzyste komórki szpiku, nie jest wcale łatwo je
uzyskać. Jeżeli nie są to komórki typu macierzystego, terapia musi być powtarzana
wielokrotnie, co wzmaga ryzyko powstawania reakcji odpornościowych czy zapalnych.
Taki skutek uboczny stwierdzono
przy próbach wielokrotnego wprowadzania
genów do zróżnicowanego nabłonka płuc
w przypadku mukowiscydozy. Ponieważ
na ogół nie steruje się wbudowywaniem terapeutycznego genu do genomu, może on
włączyć się w różnych miejscach i w efekcie
dawać bardzo różną ekspresję, co dla niektórych typów terapii może być problemem. Na przykład przy leczeniu anemii
sierpowatej czy talasemii, proporcje syntetyzowanych łańcuchów alfa i beta globiny
powinny wynosić 1:1, nadmiar któregokolwiek z nich jest szkodliwy.
Innym problemem jest unieczynnianie
wbudowanych genów przez proces metylacji, który zachodzi dość często i którym jest
trudno sterować.
Ryc. Robert Mirowski
15
biologia i życie
Dla chorób genetycznych powodowanych
przez mutacje dominujące (choroba Huntingtona, rodzinne formy choroby Alzheimera) nie chodzi o wprowadzanie genu, ale
o wyłączenie wadliwej kopii. Tu raczej myśli
się o technice RNAi, choć zarówno docelowa tkanka (dla obu chorób jest to mózg), jak
i problem sposobu wprowadzania, czyni
z tego bardzo trudne zagadnienie.
Najwięcej wysiłków skierowanych jest
na terapię genową nowotworów. Wynika
to z faktu, że nowotwory są częste, i że
w ostatnich stadiach, przy braku funkcjonalnych terapii, zarówno komisje etyczne
jak i pacjenci akceptują procedury eksperymentalne. Ogólnie podejścia opierają się
na wprowadzaniu brakujących supresorów
nowotworów. Bardzo ciekawy był parę lat
temu pomysł przygotowania zmutowanego
adenowirusa, który namnażał się tylko
na komórkach pozbawionych produktu genu supresora nowotworów p53. Gen ten
jest zmutowany w ponad połowie ludzkich
nowotworów. Niezmutowany wirus unieczynnia p53 w normalnych komórkach,
zmutowany jest do tego niezdolny, a więc
powinien namnażać się tylko w komórkach
nowotworowych i powodować ich lizę. Niestety, wirus nie okazał się być całkowicie
specyficzny.
Terapia genowa rodzi także poważne problemy etyczne. Eksperymenty są prowadzone najpierw na hodowlach komórkowych, potem na myszach, ale w którymś
momencie trzeba włączyć badania na ludziach. Osoby, poddawane takim eksperymentalnym terapiom, muszą być poinformowane o tym, co będzie badane i jakie
jest ryzyko badań, co jest bardzo trudno
ocenić. Po śmierci Jessego Gelsingera jego
ojciec stwierdził, że syn nie był poinformowany o możliwości silnych efektów ubocz-
P
16
IŚMIENNICTWO
Lee T. M. – Novel molecular approaches to cystic fibrosis gene
therapy. Biochem. J. 2005, 387: 1-15
nych, ale z drugiej strony nikt się tego efektu nie spodziewał i taka sama dawka nie
spowodowała śmierci u innej osoby.
W przypadku 11 dzieci poddanych terapii
genowej na wrodzony złożony niedobór
odporności, u 8 terapia zapobiegła rozwojowi tej śmiertelnej choroby, a jedynie 3
osoby zachorowały na białaczkę. Czy stanowi to akceptowalne ryzyko dla prowadzenia dalszych badań?
Informację o aktualnie prowadzonych badaniach klinicznych nad terapią genową
można znaleźć na stronie internetowej
www.wiley.co.uk/genmed/clinical. Według
danych ze stycznia 2006 w toku było 1145
badań, ale zaledwie ok. 2% dotyczyło fazy III (ocena skuteczności i efektów ubocznych, na ogół u setek osób). Faza I (badanie bezpieczeństwa i dawki, obejmuje
niewielu pacjentów) obejmowała 62%, faza I/II – 20%, II – 14% (badania skuteczności na małą skalę), a II/III – zaledwie 1%. Widać, że do rutynowej terapii genowej trzeba jeszcze wielu lat badań.
Olbrzymia większość badań dotyczy terapii genowej nowotworów (66,6%), choroby monogeniczne i choroby układu krążenia zajmują ex equo 2. miejsce (po 8,7%).
Od kilkunastu lat na pytanie, kiedy będzie
naprawdę dostępna terapia genowa, udzielam odpowiedzi, że za jakieś 20 lat, i to tylko
dla bogatych krajów, bo nie będzie tania. Myślę, że tak jest nadal – mimo licznych prób
klinicznych i kilku wyleczonych za pomocą
terapii genowej osób, perspektywy jej szybkiego wdrożenia na większą skalę wcześniej
niż za 20-30 lat są mało realne.
Prof. dr hab. EWA BARTNIK
pracuje w Instytucie Genetyki i Biotechnologii
Wydziału Biologii Uniwersytetu
Warszawskiego oraz w Instytucie
Biochemii i Biofizyki PAN. Zajmuje się m.in.
chorobami ludzi związanymi z mutacjami
w mitochondrialnym DNA.
Jest rzeczoznawcą ds. podręczników
i programów biologii MEiN
oraz ekspertem w dziedzinie
nauk przyrodniczych PISA 2006.
biologia w szkole