Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Patrycji Kozub pt

Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Patrycji Kozub pt.
“Otrzymywanie oraz charakterystyka liposomów – potencjalnych nośników leków
w celu zwiększenia skuteczności terapii fotodynamicznej”
W ostatnich latach dokonał się znaczący postęp w leczeniu nowotworów
złośliwych. Jest on w dużej mierze wynikiem wprowadzenia do praktyki klinicznej
nowych metod diagnostycznych, umożliwiających wczesne wykrycie i określenie
rozległości nowotoworu, a także wynikiem postępu w dziedzinie chemioterapii.
Neleży podkreślić jednak, iż aplikacja wielu leków stosowanych w chemioterapii
nowotworów, ze względu na brak swoistości tych leków, związana jest
z ogólnoustrojową toksycznością i słabą farmakokinetyką. Problemy te próbuje
się rozwiązać poszukując tzw. nowych nośników leków. Do tej pory
zaprojektowano i zbadano efektywność terapeutyczną wielu systemów
dostarczania leków m.in. koniugatów, w których substancją czynną jest białko,
peptyd lub polimer syntetyczny/naturalny. Na szczególną uwagę zasługują
również nośniki w postaci emulsji i liposomów, w których lek fizycznie zamykany
jest w nanocząstkach. Leki w tej postaci są mniej toksyczne, a jednocześnie
mogą wykazywać większą aktywność przeciwnowotworową w wyniku
poprawionych parametrów farmakokinetycznych.
Terapia fotodynamiczna jest metodą leczenia zarówno onkologicznych, jak
i nieonkologicznych zmian patologicznych. Polega na dostarczeniu do chorej
tkanki związku (fotouczulacza), który poddany ekspozycji na promieniowanie,
o odpowiedniej mocy i długości fali, generuje powstanie reaktywnych form tlenu
bezpośrednio odpowiedzialnych za destrukcję struktur komórkowych
w oświetlonym obszarze. Aby terapia fotodynamiczna przyniosła oczekiwany
efekt fotouczulacz musi spełniać określone kryteria (m.in. wykazywać wysoką
wydajność generowania tlenu singletowego, silną absorpcję światła w zakresie
podczerwieni, wybiórczą akumulację w tkankach zmienionych chorobowo).
Niestety dostępne obecnie na rynku związki fotouczulające nie spełniają
wszystkich tych wymogów, dlatego wciąż prowadzone są intensywne
poszukiwania nowych fotouczulaczy. Ponadto, w celu zwiększenia efektywności
PDT oraz zmniejszenia efektów ubocznych terapii, podobnie jak w przypadku
chemioterapii, tworzy się kompleksy barwników z różnorodnymi nośnikami by
zwiększyć selektywność ich akumulacji oraz stabilność w środowisku
biologicznym.
W tym aktualnym i ważnym nurcie kontrowersji naukowej osadzona jest
rozprawa doktorska Pani mgr Patrycji Kozub, będąca kontynuacją cyklu cennych
prac realizowanych przez Zespół badawczy pod kierunkiem prof. zw. dr hab. Alicji
Ratusznej.
Recenzowana rozprawa doktorska ma charakter interdyscyplinarny i porusza
problemy z pogranicza fizyki, chemii i biologii. Praca ma klasyczny układ, liczy
120 stron tekstu i zawiera 148 pozycji literaturowych. Składa się ze spisu treści,
wykazu skrótów stosowanych w pracy, wprowadzenia oraz rozdziałów: Wstęp
Cancer Research UK and EPSRC
Cancer Imaging Centre at
The Institute of Cancer Research
and The Royal Marsden NHS
Foundation Trust
Gabriela Kramer-Marek, Dr hab.
Team Leader
Preclinical Molecular Imaging
15 Cotswold Road
Surrey, SM2 5NG
T +44 20 8722 4412
E [email protected]
W [email protected]
2 of 5
Teoretyczny, Cel i Zakres Pracy, Materiały i Metody Badawcze, Analiza i Dyskusja
Wyników, Podsumowanie i Wnioski.
Ciekawie i klarownie zredagowany na 35 stronach Wstęp Teoretyczny rozprawy Doktorantka
przygotowała w sposób interesujący, w oparciu o najnowszą literaturę. Jest to również ta część
rozprawy, która bardzo dobrze wprowadza czytelnika do dalszych rozdziałów pracy. Autorka
omawia w tej częśći:
1. Główne założenia i ograniczenia terapii fotodynamicznej (PDT), w tym rolę fotouczulaczy,
tlenu i źródeł światła.
2. Rodzaje fotouczulaczy stosowanych w tej metodzie.
3. Mechanizmy śmierci komórek indukowane przez ten typ terapii.
4. Sposoby zwiększania selektywności oraz efektywności fotouczulaczy poprzez zastosowanie
nośników liposomowych, których budowa oraz sposoby przygotowania, a także
wykorzystanie w medycynie zostały szczegółowo przedyskutowane.
Do tej części pracy mam jedynie drobne uwagi, które nie wpływają jednak na jakość merytoryczną
tego rozdziału.





We Wstępie Autorka powinna oprzeć swoją statystykę zachorowalności oraz umieralności
na choroby nowotworowe na bardziej aktualnych danych, opublikowanych raczej w roku
2014 a nie 2012.
Unikałabym sformułowań typu: terapię fotodynamiczną wykorzystuje się do leczenia
nowotworów i nie tylko. Co znaczy „nie tylko”?
W rozdziale I.1.2 brakuje kilku pozycji literaturowych.
Dyskusji podlega fakt, czy porfiryny obecnie należą do najczęściej badanych związków pod
kątem PDT, ze względu na słabą penetrację światła w zakresie 630-650 nm.
Tabela 1 przedstawia charakterystykę 12 związków, które opisane zostały w 10
publikacjach. W tej sytuacji pozycje literaturowe powinny zostać umieszczone w tabeli
obok związku, którego dotyczą.
Cel Pracy: “Otrzymanie oraz charakterystyka liposomów jako potencjalnych nośników leków
przeciwnowotworowych” został jasno sprecyzowany i stanowi logiczną konsekwencję powyższego
wprowadzenia.
Materiał i Metody Badwcze opisane są w sposób staranny i należycie szczegółowy. Autorka do
swoich badań wykorzystała trzy fotouczulacze z rodziny chloryn. Parametry fizykochemiczne dwóch
z nich były przedmiotem innej pracy doktorskiej. Nie mniej jednak nowatorskie jest ich
wykorzystanie w połączeniu z nośnikami liposomowymi, będącymi przedmiotem niniejszej
rozprawy.
Wydaje mi się, iż niepotrzebnie Doktorantka umieściła w tej cześci pracy wprowadzenie
teoretyczne dotyczące każdej z wykorzystywanych metod. Taki opis metod fizykochemicznych
powinien raczej zostać umieszczony we wstępie pracy.
Protokoły eksperymentalne są przygotowane w sposób czytelny i szczegółowy. Na uwagę zasługuje
fakt, że zarówno materiał, jak i zastosowane metody badawcze zostały dobrane adekwatnie do
postawionego sobie celu badań, co świadczy o dobrym przygotowaniu metodycznym Doktoranta.
3 of 5
Poniżej szczegółowe uwagi:


Strona 52 - należałoby zaznaczyć, iż badana linia komórkowa to ludzkie komórki raka
okrężnicy Hct116.
W niektórych miejscach Doktorantka posługuje się określeniami anglojęzycznymi. Brakuje
jednak pewnej chronologii. Wiele określeń, których nazwę angielską należałoby
wprowadzić, zostało pominiętych. W takiej sytuacji raczej w ogóle nie wprowadzałabym
określeń obcojęzycznych.
Analiza i Dyskusja Wyników przedstawiona jest w sposób czytelny, opisowy oraz jest
odpowiednio udokumentowana w formie wykresów, w analizie których poprawnie uwzględniono
istotność statystyczną. Tę część pracy Autorka podzieliła na dwa etapy:
1. Badania fizykochemiczne fotouczulacza z rodziny chloryn pod kątem jego wykorzystania
w PDT.
2. Charakterystykę kompleksów liposom-fotouczulacz oraz określenie właściwości
otrzymanych kompleków w układzie biologicznym.
Badania fizykochemiczne wykonane przez Doktorantkę świadczą o szerokim i zrozumiałym
zgłębieniu wiedzy na temat reakcji fotodynamicznych oraz o dużej dojrzałości naukowej
Doktorantki.
Autorka zmierzyła widma absorpcjne chloryny w różnych rozpuszczalnikach, dla których wyznaczyła
także molowe współczynniki absorpcji. Dodatkowo sprawdziła czy związek nie ulega agreagacji w
badanych roztworach, co ma istotne znaczenie z punktu widzenia efektywności PDT. Autorka
zmierzyła także widma fluorescencji i wyznaczyła energię pierwszego wzbudzonego stanu
singletowego S1. Wyznaczone przez Nią wydajności kwantowe fluorescencji mieszczą się w zakresie
3.8-40% i zależą od użytego rozpuszczalnika. Wysokie wartości kwantowej wydajności
fluorescjencji w niektórych rozpuszczalnikach wskazywałyby na mało wydajne przejście
międzysystemowe S1-T1, co z kolei sugerowałoby niską użyteczność tego związku w terapii. Fakt
ten nie wyklucza jednak jego zastosowania w diagnostyce, gdzie wysoka wydajność fluorescencji
jest czynnikiem korzystnym, umożliwiającym dokładne zlokalizowanie zmian chorobowych.
Pierwszy wzbudzony stan trypletowy chloryny został scharakteryzowany przy zastosowaniu
nanosekundowej fotolizy laserowej i był wystarczający do wygenerowania tlenu singletowego.
Ponadto, wyznaczona przez Doktorantkę kwantowa wydajność tworzenia tlenu singletowego
badanego związku była wysoka co w ostateczności wskazuje na potencjalne wykorzystanie go jako
fotouczulacza w PDT. Tym bardziej, że przeprowadzone przez Doktorantkę badania fotodegradacji
związku wskazały na jego wysoką fotostabilność.
Ze względu na agregację przedstawionych w pracy fotouczulaczy w środowisku wodnym związki
zamykano w różnych formulacjach liposomowych, które obecnie często wykorzystywane są jako
nośniki leków przeciwnowotworowych. Doktorantka wykorzystała trzy typy liposomów: anionowe,
kationowe oraz neutralne. W pierwszym etapie określiła podstawowe parametry fizyczne
liposomów pustych oraz z fotouczulaczem zamkniętym w dwuwarstwie fosfolipidowej
tj. współczynik polidyspersyjności, średnicę liposomów, stabilność oraz efektywność zamykania
badanych związków w nośnikach liposomowych.
Następnie zbadała in vitro efektywność terapeutyczną uzyskanych kompleksów liposomfotouczulacz wykorzystując ludzkie komórki raka jelita grubego linii Hct116.
4 of 5
Do tej części pracy mam jednak największe wątpliwości. Dla skuteczności PDT istotne znaczenie
mają nie tylko właściwości fizykochemiczne fotouczulacza ale również jego farmakokinetyka oraz
farmakodynamika.
Zastosowanie nośników liposomowych niewątpliwie umożliwia skuteczny transport fotouczulaczy do
komórek. Jednak sposób w jaki Doktorantka przedstawiła użyteczność otrzymanych kompleksów
w układzie biologicznym budzi zastrzeżenia:









Autorka nie wykonała badań transportu oraz dystrybucji badanych nośników in vitro, jak
również nie wskazała literatury potwierdzającej, iż 4 godzinna inkubacja komórek
z kompleksem liposom-fotouczulacz jest czasem wystarczającym do zgromadzenia się
kompleksu w obszarze komórki. Zatem za zasadne uważam, iż w celach publikacyjnych
dobrze byłoby wykonać dodatkowe badania kolokalizacji kompleksów z organellami
komórkowymi na poziomie mikroskopu konfokalnego. Istotne jest zlokalizowanie takich
kompleksów, bowiem warunkuje to kierunek zmian i odpowiedzi komórkowej na zadaną
terapię. Niewątpliwie podniesie to również wartość merytoryczną pracy.
Nie wyjaśniła również dlaczego wybrała takie a nie inne dawki energii do naświetlania
komórek.
Ponadto, w testach nie umieściła grupy kontrolnej komórek, które poddane były tylko
ekpozycji na światło.
W tekście zabrakło sformułowania, iż badane nośniki liposom-fotouczulacz są nietoksyczne
jedynie w testowanym zakresie stężeń. Doktorantka przeprowadziła badania jedynie dla 4
różnych koncentracji.
Wszystkie wykresy przeżywalości komórek zostały błędnie opisane. Doktorantka oceniała
przeżywalność komórek po 28 godzinach (4 godziny inkubacji z kompleksami plus 24
godziny inkubacji w medium hodowlanym w 37oC), a nie po 4 godzinach jak wskazują
wszystkie opisy pod wykresami. Szkoda, że Doktorantka nie wyjaśnia, dlaczego
zdecydowała się aż na 24-godzinną inkubację po PDT, rezygnując z oceny przeżywalności
po krótszych czasach od naświetlania. Po 24 godzinach część uszkodzeń na terenie
komórki mogła zostać naprawiona.
W części Materiały i Metody doktorantka pisze, iż w przypadku liposomów pustych
podawała 5 L, 10 L, 25 L 50 L zawiesiny liposomalnej, co w przypadku kompleksów
odpwiadało stężeniom fotouczulaczy 0.5 M, 1 M, 2.5 M, 5 M. Na wykresach
przedstawiających przeżywalność komórek po inkubacji z pustymi liposomami w części
Analiza i Dyskusja doktorantka posługuje się pojęciem stężeń, co w tym wypadku jest
błędnym określeniem.
Analizując wszystkie wykresy przeżywalości wydaje się, iż niezależnie od rodzaju użytego
nośnika przy danej dawce energii efekt terapeutyczny pomiędzy użytymi nośnikami był
porównywalny. Uważam iż warto byłoby ten fakt skomentować.
Do uwag krytycznych należałoby dołączyć również nieprawidłowe posługiwanie się
pewnymi terminami takimi jak: liposom-lek. Przedstawiane w pracy folouczulacze nie są
jeszcze lekami.
W dyskusji brakuje również kilku zdań podsumowujących i określających perspektywy
wykorzystania wyników rozprawy w praktyce klinicznej bowiem praca ma jak najbardziej
charakter aplikacyjny i otwiera bardzo obiecujące pole wykorzystania.
W zakończeniu pracy Doktorantka przedstawia Podsumowanie i Wnioski, które są poprawnie
sformułowane i wynikają z uzyskanych wyników.
5 of 5
Recenzowana praca zawiera wyraźne elementy nowości i prezentuje wysoki poziom naukowy.
Dodatkowo wyróżnia się bogatą szatą graficzną oraz starannością edytorską. Większość zarzutów,
które wcześniej podniosłam można określić jako subiektywne opinie lub usterki redakcyjne, które
nie rzutują na moją wysoką ocenę rozprawy. A słabo opisana część biologiczna pracy wynika z
faktu, iż Doktorantka nie jest z wykształcenia biologiem.
Dlatego z pełnym przekonaniem uważam, że rozprawa spełnia warunki stawiane pracom
doktorskim i wnioskuję o dopuszczenie Pani mgr Patrycji Kozub do dalszych etapów przewodu
doktorskiego.
Sądzę ponadto, że ze względu na nakład pracy, stosowanie bogatego warsztatu badawczego oraz
uzyskane oryginalne i nowatorskie wyniki rozprawa ta zasługuje na wyróżnienie.
Gabriela Kramer-Marek, Dr hab.