"ORRELIA BURGDORFERI jako markery przeciwciał klasy IgM i IgG

&ARM0RZEGL.AUK †
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
!NTYGENY"ORRELIABURGDORFERI
JAKOMARKERYPRZECIWCIAŒKLASY)G-I)G'WTEuCIE7ESTERNBLOT
"ORRELIABURGDORFERIANTIGENSASMARKERSOF)G-
AND)G'ANTIBODIESINTHE7ESTERNBLOTTEST
"EATA#HUDZIK+ATARZYNA-ATUSKA+ATARZYNA+RAWCZYK†0ODGÌRSKA
+ATARZYNA:AKASZEWSKA!NNA-ALM3ŒAWOMIR+ICIAK2OMA-ODRZEWSKA
:AKŒAD-IKROBIOLOGII,EKARSKIEJ3AMODZIELNY0UBLICZNY3ZPITAL+LINICZNYNRW,UBLINIE
+ATEDRAI:AKŒAD-IKROBIOLOGII&ARMACEUTYCZNEJZ0RACOWNI’$IAGNOSTYKI-IKROBIOLOGICZNEJ
5NIWERSYTET-EDYCZNYW,UBLINIE
#ENTRUM-EDYCZNE,UXMEDW,UBLINIE
0ORADNIAI+LINIKA#HORÌB:AKAxNYCH3AMODZIELNY0UBLICZNY3ZPITAL+LINICZNYNRW,UBLINIE
Streszczenie
Abstract
Podstawowym kryterium rozpoznania boreliozy z Lyme
są określone objawy kliniczne potwierdzone wywiadem
epidemiologicznym oraz wynikami badań serologicznych.
Serologiczna diagnostyka boreliozy, oparta o wykrywanie
przeciwciał klasy IgM i IgG, obejmuje w pierwszym etapie ilościowy przesiewowy test ELISA, a w drugim – jakościowy test potwierdzenia Western blot. Celem pracy
była analiza antygenów Borrelia burgdorferi jako markerów przeciwciał klasy IgM i IgG w teście Western blot;
analizie poddano wyniki badań uzyskane w przypadku 22
surowic pozytywnych w zakresie przeciwciał klasy IgM
oraz 52 surowic pozytywnych w zakresie przeciwciał klasy IgG. W przypadku surowic pozytywnych w zakresie
przeciwciał klasy IgM dominującym markerem był antygen p25, w zakresie przeciwciał klasy IgG – antygeny p17
i VlsE. Uzyskane wyniki zgodne są z danymi literaturowymi, że frakcja białek błony zewnętrznej OspC B. burgdorferi (antygen p25) jest dobrym markerem przeciwciał
klasy IgM, podczas gdy antygen VlsE (lipoproteina obecna na powierzchni komórki krętków) jest dobrym wskaźnikiem przeciwciał klasy IgG.
The basic criteria in diagnosis of borreliosis are some
clinic symptoms confirmed by the epidemiological interview and the results of serological tests. The serological
diagnostics of borreliosis, including detection of IgM and
IgG antibodies, is performed into two steps – quantitative
screening ELISA test and qualitative confirmatory Western blot test. The aim of this paper was to analyze antigens
of Borrelia burgdorferi as markers of IgM and IgG antibodies in the Western blot test; analysis was performed in
case of 22 positive sera in range of IgM antibodies and 52
positive sera in range of IgG antibodies. It was found that
the main marker of IgM antibodies was antigen p25, while
antigens p17 and VlsE were the main markers of IgG
antibodies. Our results are in accord with literature data
that the fraction of outer membrane protein OspC (p25)
of B. burgdorferi is good marker of IgM antibodies, while
antigen VlsE (surface lipoprotein on spirochete cells) is
good marker of IgG antibodies.
Keywords: borreliosis, Borrelia burgdorferi, Western
blot
Słowa kluczowe: borelioza, Borrelia burgdorferi, Western blot
Wstęp
Borelioza z Lyme jest przenoszoną przez kleszcze
chorobą infekcyjną o przewlekłym przebiegu i zróżnicowanych objawach utrudniających rozpoznanie [1].
Czynnikiem etiologicznym są Gram ujemne beztlenowce
należące do rzędu Spirochaetales - krętki Borrelia burgdorferi sensu lato. Gatunek ten został podzielony na ponad 20 genogatunków (genotypów), z których B. burgdorferi sensu stricto, B. garini i B. afzeli oraz B. bissetti
i B. spielmani są chorobotwórcze dla człowieka [2, 3].
W Stanach Zjednoczonych stwierdza się obecność B. burgdorferi sensu stricto oraz B. bissetti [2]. Wśród patogennych
genogatunków w Europie najczęściej występują B. garini i
B. afzeli, rzadziej - B. burgdorferi sensu stricto [2]. Zgodnie
z wynikami badań uzyskanymi przez Chmielewskiego i Tylewską-Wierzbanowską [4] w poszczególnych województwach w Polsce zachorowania na boreliozę z Lyme występują z podobną częstością, co wskazuje na równomierne zagrożenie na terenie całego kraju i sugeruje, że obszar Polski
można uznać za endemiczny dla tej jednostki chorobowej.
Podstawowym kryterium rozpoznania boreliozy są
określone objawy kliniczne potwierdzone wywiadem epidemiologicznym oraz wynikami badań laboratoryjnych [5].
W rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej nie prowadzi
się metod hodowlanych krętków B. burgdorferi ze wzglę-
&ARM0RZEGL.AUK
du na niewspółmierność pomiędzy koniecznością zastosowania złożonych podłóż mikrobiologicznych, a brakiem
specyficznego wzrostu bakterii [1]. Metody bezpośredniego
wykrywania krętków, czy techniki biologii molekularnej takie jak, reakcja łańcuchowej polimerazy (PCR) odgrywają
istotną rolę we wczesnym okresie choroby, wówczas gdy
odczyny immunologiczne nie są pozytywne mimo istnienia
zakażenia, jednakże należą do procedur czasochłonnych
i kosztownych [1].
W praktyce najczęściej stosuje się metody pośrednie,
pozwalające na ocenę swoistej odpowiedzi immunologicznej na obecność w organizmie człowieka krętków. Podstawą
laboratoryjnego rozpoznania boreliozy z Lyme jest diagnostyka serologiczna [2, 3]. Serologiczna diagnostyka boreliozy powinna być dwuetapowa; w pierwszym etapie wykonuje się ilościowy test przesiewowy ELISA, cechujący się
mniejszą swoistością ale dużą czułością, pozwalający na
oznaczenie miana przeciwciał klasy IgM i IgG, a w drugim
– jakościowy test potwierdzenia Western blot, w którym wykrywa się przeciwciała klasy IgM i IgG reagujące z antygenami B. burgdorferi. Test Western blot powinien być wykonany
w każdym przypadku wystąpienia dodatniego lub granicznego
(wątpliwego) wyniku testu skryningowego - ELISA [5, 6].
Celem pracy była analiza antygenów B. burgdorferi jako
markerów przeciwciał klasy IgM i IgG w teście Western blot
z uwzględnieniem częstości reakcji poszczególnych antygenów z surowicami pacjentów seropozytywnych w teście
ELISA.
Materiały i metody
Materiał do badań stanowiły surowice pacjentów seropozytywnych w kierunku B. burgdorferi w teście ELISA leczonych w Poradni i Klinice Chorób Zakaźnych Samodzielnego Publicznego Szpitala Klinicznego Nr 1 w Lublinie
w okresie od 31.08.2009 roku do 22.02.2010 roku.
Analizie poddano wyniki badań uzyskane w przypadku
22 surowic pozytywnych w zakresie przeciwciał klasy IgM
oraz 52 surowic pozytywnych w zakresie przeciwciał klasy
IgG w teście Western blot. Zastosowano test Western blot
Anty-Borrelia-Euroline-WB (Euroimmun, Niemcy) z frakcjami antygenowymi pochodzącymi z pełnych, natywnych
lizatów komórkowych B. burgdorferi i jedną frakcją rekombinowanego białka VlsE. Paski były oceniane elektronicznie
przy zastosowaniu oprogramowania EuroLineScan. Antygeny wchodzące w skład testu wykrywającego przeciwciała
w klasie IgM lub IgG to: p17, p19, p21, OspC (p25), p30,
OspA (p31), BmpA (p39), flagelina (p41), p83, VlsE.
Wyniki badań
Tabela I przedstawia analizę wyników badań dotyczących częstości reakcji antygenów B. burgdorferi w teście
Western blot z przeciwciałami obecnymi w surowicach
pacjentów seropozytywnych w teście ELISA. W przypadku surowic pozytywnych w zakresie przeciwciał klasy
IgM, dominującym markerem był antygen p25, reagujący z przeciwciałami obecnymi w 18 (81,82%) badanych
surowicach. Inne antygeny - p17, p30, p31 i p39 reagowały z pojedynczymi surowicami. W przypadku surowic
Tab. I. Częstość reakcji antygenów B. burgdorferi w teście
Western blot z przeciwciałami w klasie IgM i IgG obecnymi
w surowicach pacjentów seropozytywnych w teście ELISA
Antygeny
B. burgdorferi
p17
p19
p21
p25
p30
p31
p39
p83
VlsE
Liczba surowic reagujących
z poszczególnymi antygenami
IgM
n = 22
IgG
n = 52
1 (4,55%)
18 (81,82%)
1 (4,55%)
2 (9,10%)
2 (9,10%)
-
36 (69,23%)
20 (38,47%)
14 (26,93%)
13 (25%)
21 (40,39%)
7 (13,47%)
22 (42,31%)
18 (34,62%)
32 (61,54%)
pozytywnych w zakresie przeciwciał klasy IgG najczęściej obserwowano reakcję z przeciwciałami obecnymi
w badanych surowicach z antygenami p17 (36; 69,23%),
VlsE (32; 61,54%), a w mniejszym stopniu z antygenami:
p39 (22; 42,31%), p30 (21; 40,39%), p19 (20; 38,47%);
p83 (18; 34,62%), p21 (14; 26,93%). Najmniejszą częstość
reakcji pomiędzy przeciwciałami badanych surowic a antygenami testu Western blot obserwowano w przypadku antygenów p25 (13; 25%) i p31 (7; 13,47%).
Dyskusja
W Europie występują trzy patogenne genogatunki
B. burgdorferi sensu lato, różniące się antygenowo. Zmienność ta może stwarzać poważne trudności w prawidłowej
diagnostyce laboratoryjnej boreliozy z Lyme opartej o testy
serologiczne, co jest istotne z punktu widzenia narastającej
liczby chorych w wielu krajach europejskich, w tym również
w Polsce [7, 8]. Testy Western blot służące do potwierdzania
wyników dodatnich i wątpliwych (granicznych) uzyskanych
w pierwszym etapie badań – w teście skriningowym ELISA,
zawierają w swoim składzie antygeny B. burgdorferi obecne
w pełnych, natywnych lizatach bakteryjnych, jak również
syntetyczne antygeny rekombinowane otrzymane metodami
inżynierii genetycznej [5, 9].
Do frakcji antygenowych mających istotne znaczenie
w laboratoryjnej diagnostyce boreliozy należy zewnętrzne
białko powierzchniowe OspC (antygen p25) krętków [6, 10,
11]. Zgodnie z badaniami innych autorów [5, 6], antygen ten
jest ważnym markerem przeciwciał klasy IgM w teście Western blot. Wyniki prezentowane w niniejszej pracy potwierdzają, że antygen ten reaguje w znacznym odsetku (81,82%)
z przeciwciałami klasy IgM, a w niższym (25%) z przeciwciałami klasy IgG.
Inną frakcją antygenową ważną z punktu widzenia diagnostyki boreliozy jest VlsE – lipoproteina obecna na powierzchni komórek krętków. Dane literaturowe wskazują,
że frakcja VlsE jest dobrym wskaźnikiem przeciwciał klasy
IgG w późnych okresach boreliozy [5, 6, 11, 12].
&ARM0RZEGL.AUK
Wyniki prezentowane w niniejszej pracy potwierdzają, że antygen ten reaguje w znacznym odsetku (61,54%)
z przeciwciałami klasy IgG, nie wykazując reakcji z przeciwciałami klasy IgM. Tokarska-Rodak i wsp. [12] wykazali w podobnie dużym odsetku występowanie przeciwciał
przeciwko VlsE w klasie IgG, podczas gdy, w klasie IgM nie
stwierdzono przeciwciał VlsE.
Po wprowadzeniu do diagnostyki testów opartych na
konserwatywnym białku C6, fragmencie białka VlsE, poprawiła się znacznie swoistość testów, jak również możliwość wykrywania przeciwciał przeciwko B. burgdorferi,
łącząc możliwość wykrycia przeciwciał bakterii o dużej
zmienności antygenowej, nawet wewnątrzgatunkowej [13,
14]. Białko VlsE, główne zmienne białko z ekspresją in vivo
w zakażonym kręgowcu, ma wysokoimmunogenne epitopy wspólne dla różnych genogatunków [13, 14]. Dodanie
do panelu antygenowego w konstruowanych testach VlsE
(białko C6) poprawia dokładność rozpoznań szczególnie
w neuroboreliozie [15]. Tymczasem, Zajkowska i wsp. [9]
podają, iż testy oparte na konserwatywnej części białka
VlsE (C6), poszukujące przeciwciał w klasie IgM i IgG są
najbardziej obiecujące w diagnostyce wczesnej postaci boreliozy z Lyme.
Dane uzyskane w niniejszej pracy wskazują, że również
inne antygeny krętkowe, takie jak p17, p39, p30, p19, p83
i p21 mogą być dobrymi wskaźnikami przeciwciał w klasie
IgG. Należy zaznaczyć, że w późnych stadiach boreliozy
obserwuje się reakcję przeciwciał klasy IgG z co najmniej
czterema antygenami B. burgdorferi [16].
Wnioski
Przedstawione w niniejszej pracy wyniki potwierdziły,
że frakcja białek błony zewnętrznej OspC (p25) B. burgdorferi jest najlepszym markerem przeciwciał klasy IgM, a dobrymi markerami przeciwciał klasy IgG mogą być różne
frakcje antygenowe, w tym VlsE.
Piśmiennictwo
1. Wanyura H, Wagner T, Kowalska K. Borelioza – choroba z Lyme. Czas Stomatol 2006; 9: 640-648.
2. Tylewska-Wierzbanowska S, Chmielewski T. Borelioza
z Lyme – rozpoznanie kliniczne i laboratoryjne. Med
Zak 2009; 15: 565-570.
3. Tylewska-Wierzbanowska S. Kleszcze jako wektor i rezerwuar chorób infekcyjnych (profilaktyka i zwalczanie
zakażeń odkleszczowych). Ordynator leków 2009; 9:
20-29.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
4. Chmielewski T, Tylewska-Wierzbanowska S. Występowanie przeciwciał swoistych dla Borrelia burgdorferi
u ludzi zdrowych na terenie Polski. Przegl Epidemiol
2002; 56: 33-38.
5. Cisak E i wsp. Charakterystyka testów Western blot stosowanych w diagnostyce boreliozy u ludzi. Med Ogólna
2009; 15: 514-523.
6. Chmielewska-Badora J, Cisak E, Wójcik-Fatla A. Zastosowanie testu immunoblot w diagnostyce laboratoryjnej boreliozy. Przegl Epidemiol 2006; supl.1, Zbiór
referatów i streszczeń V Ogólnokrajowej Konferencji
Naukowo-Szkoleniowej nt. Neuroinfekcji, Białystok
21-22-kwietnia 2006.
7. Wilske B. Diagnosis of lyme borreliosis in Europe-status
report. IX International Conference on Lyme Borreliosis
and Other Tick Borne Diseases. 2002; August 18-22.
8. Wilske B. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe.
Vector Borne Zoonotic Dis 2003; 4: 215-227.
9. Zajkowska JM i wsp. Porównanie wyników testów
z antygenem VlsE (C6) oraz testów z zastosowaniem
antygenów rekombinowanych u chorych na boreliozę
z Lyme. Pol Merk Lek 2007; 134: 95-99.
10. Ramamoorthi N i wsp. The Lyme disease agent exploits
a tick protein to infect the mammalian host. 2005; 436:
573-577.
11. Wilske B. Epidemiology and diagnosis of Lyme borreliosis. Ann Med 2005; 37: 568-579.
12. Tokarska-Rodak M i wsp. Frequency and specificity of
the antibodies against Borrelia burgdorferi tasted by
Western blot method in patients with symptoms of arthritis. Centr Eur J Immunol 2008; 33: 220-223.
13. Hofman H i wsp. Diagnostic value of a new C6 and
C10 peptide ELISA for the serodiagnosis of Elary Lyme
Borreliosis – comparision to the European Two-step
Protocol. VII Internatinal Potsdam Symposium on Tick
Borne Diseases. Berlin 2003, 13-14 March
14. Levin A, Talaska T, Kavalenko V. C6 peptide ELISA:
Universal assay for detection of European Lyme Borreliosis. IX International Conference on Lyme Borreliosis
and Other Tick Borne Diseases. 2002; August 18-22.
15. Pannelius J i wsp. Improved laboratory diagnosis of
Lyme neuroborreliosis with antibodies to recombinant
proteins DbpA, BBK32 and OspCand VlsE IR6 protein.
IX International Conference on Lyme Borreliosis and
Other Tick Borne Diseases. 2002; August 18-22.
16. Hauser U i wsp. Interpretation criteria for standardized Western blots for three European species of Borrelia burgdorferi sensu lato. J Clin Microbiol 1997; 35:
1433-1444.
data otrzymania pracy: 02. 11.2010 r.
data akceptacji do druku: 11.01.2011 r.
Adres do korespondencji:
Anna Malm
Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej z Pracownią Diagnostyki Mikrobiologicznej
Uniwersytet Medyczny w Lublinie
ul. W. Chodźki
20-093 Lublin
Tel. +48 081 742 37 72; fax +48 081 742 37 72
e-mail: [email protected]