rola mikro-RNA-199a-5p i mikro-RNA-199b-5p

Nr wniosku: 190706, nr raportu: 19846. Kierownik (z rap.): dr Jolanta Wiesława Kiewisz
Epigenetyczna regulacja ekspresji DDR1 i IKBKB w liniach komórkowych raka nerki
– rola mikro-RNA-199a-5p i mikro-RNA-199b-5p w patogenezie raka jasnokomórkowego nerki
Rak jasnokomórkowy nerki (ccRCC, clear cel renal cel cancer) jest najbardziej powszechnym typem histologicznym
wśród nowotworów nerek. Nowotwór ten powstaje w komórkach wyściełających kanalik kręty proksymalny (PCT,
proximal convoluted tubule). Rokowanie u pacjentów z ccRCC jest istotnie gorsze, niż w przypadku innych, niejasnokomórkowych raków nerkowokomórkowych. Guzy ccRCC, niezależnie od ich wielkości, charakteryzują się
zdolnością do tworzenia przerzutów i nawrotów choroby u 20-30% pacjentów poddanych nefrektomii. Wszystkie
metastatyczne i/lub lokalnie zaawansowane (naciekające) guzy raka jasnokomórkowego nerki charakteryzują się
opornością na klasyczne formy terapii adiuwantowej. Ze względu na charakterystykę ccRCC podejmowane są próby
zmierzające do 1/ opracowania nowych terapii celowanych, które umożliwiłyby skuteczne pooperacyjne leczenie
pacjentów poddanych nefrektomii oraz 2/ znalezienia nowych, wiarygodnych biomarkerów molekularnych, które
pozwolą na lepszą ocenę ryzyka oraz dobór odpowiedniej terapii u chorych na ccRCC. Mikro-RNA stanowią jedną
z najbardziej obiecujących grup związków, która jest intensywnie analizowana pod kątem przydatności jako biomarkery
oraz potencjalne substancje mogące stanowić cel lub czynnik terapeutyczny w terapii celowanej. Mikro-RNA są klasą
małych, niekodujących, jednoniciowych RNA, które znane są jako posttranskrypcyjne negatywne regulatory ekspresji
genów. Zmienione poziomy ekspresji poszczególnych mikro-RNA zostały powiązane z szeregiem fizjologicznych
i patologicznych procesów, wliczając w to także zmiany charakterystyczne dla guzów nerki.
Celem niniejszego projektu było zbadanie roli dwóch mikro-RNA: miro-RNA-199a-5p (miR-199a) oraz mikroRNA-199b-5p (miR-199b) w rozwoju i progresji ccRCC oraz przeanalizowanie ewentualnych korelacji pomiędzy
badanymi mikro-RNA a poziomem ekspresji dwóch genów stanowiących potencjalny cel supresyjnego działania
miR-199a i miR-199b: DDR1 (receptor zawierający domenę discoidiny 1) oraz IKBKB( podjednostka  kinazy inhibitora
czynnika jądrowego -B). Analizie poddano także potencjalny udział produktów niniejszych genów w patogenezie
ccRCC. Przeprowadzono doświadczenia wykorzystujące materiał pobrany od pacjentów z ccRCC oraz materiał
pochodzący z linii komórkowych stanowiących model in vitro raka nerki (Caki-1, Caki-2 i ACHN) oraz linii komórek
prawidłowych, stanowiącej model nabłonka kanalików bliższych nerki (HK-2), czyli struktury, z której wywodzi się
ccRCC.
Ekspresja obu analizowanych mikro-RNA była niższa w guzie niż w tkance nerki niezmienionej. Różnica ta była
istotnie statystyczna w przypadku miR-199a. Zawartość transkryptów i białkowe produkty genów DDR i IKBKB była
również istotnie obniżona w ccRCC. Przeprowadzone na skrawkach preparatów mikroskopowych reakcje
immunohistochemiczne wykazały, że zmianie ulega lokalizacja ekspresji białka DDR1 w komórkach nowotworowych:
z cytoplazmatycznej (w kanalikach bliższych nerki prawidłowej) na jądrową. Uzyskane wyniki sugerują udział w tym
procesie miR-199b, którego ekspresja koreluje dodatnio z immunoreaktywnością DDR1 w jądrze i ujemnie
w cytoplazmie. Obniżenie zawartości białka IKBKB w guzach pacjentów koreluje z występowaniem przerzutów
odległych (M1). Pacjenci objęci badaniami są monitorowani, a dane dotyczące ich przeżycia poddawane są analizie pod
kątem korelacji badanych czynników z progresją choroby. Na podstawie dotychczas zgromadzonych danych nie
potwierdzono istnienia zależności pomiędzy przeżywalnością pacjentów z ccRCC, a poziomem ekspresji badanych
mikro-RNA oraz genów. Doświadczenia in vitro potwierdziły, że endogenny poziom ekspresji miR-199a i miR-199b
w komórkach nowotworowych jest względnie niski. Przeprowadzony test demetylacji wskazuje, że najbardziej
prawdopodobnym mechanizmem wyciszenia ekspresji badanych mikro-RNA w analizowanych liniach komórek
nowotworowych jest hipermetylacja ich locii. Co ciekawe, komórki HK-2 pochodzące z nabłonka PCT prawidłowej nerki
nie różniły się pod tym względem od komórek linii nowotworowych. Transfekcje linii komórkowych oligonukleotydami
naśladującymi działanie endogennych miR-199a i miR-199b skutkowały przynajmniej częściowym wyciszeniem
ekspresji DDR1 i IKBKB, co wskazuje na udział badanych mikro-RNA w regulacji ekspresji analizowanych genów.
Wskazano także na istotny wpływ miR-199a i miR-199b na proliferację wszystkich badanych linii komórkowych oraz
stwierdzono negatywny wpływ transfekcji miR-199a na inwazyjne właściwości komórek Caki1.
Wyniki przeprowadzonych eksperymentów wskazują na możliwość udziału miR-199a i miR-199b oraz genów
DDR1 i IKBKB w rozwoju i progresji ccRCC, jednak obecny stan wiedzy na temat biologicznej funkcji i powiązań
pomiędzy badanymi czynnikami nie pozwala jednoznacznie określić ich roli w ccRCC i wymaga dalszych badań.