Tautomeria zasad purynowych i pirymidynowych

Tautomeria zasad purynowych i pirymidynowych
STRESZCZENIE
W
artykule przedstawiam zarys i tło badań tautomerii form obojętnych i jonowych pirymidyn, puryn i ich pochodnych, które, pod kierunkiem profesora Davida Shugara, rozpoczęły się w Katedrze Biofizyki Uniwersytetu Warszawskiego w końcu lat 60-tych XX wieku.
WPROWADZENIE
Kiedy na przełomie lat 60. i 70. ub. wieku, jako młodzi asystenci profesora
Shugara na właśnie utworzonej Katedrze Biofizyki w Instytucie Fizyki Doświadczalnej Uniwersytetu Warszawskiego, szalenie zaangażowani w naszą pracę,
pytaliśmy profesora Davida Shugara czemu nie robimy wielkich projektów badawczych, profesor odpowiadał, że w naszych warunkach możemy robić tylko
„przyczynki”. Efekty pracy nad tymi „przyczynkami” podsumowujemy teraz, do
prac z tamtego, pionierskiego okresu ciągle odwołują się autorzy współcześni, a
prof. Shugar pozostaje w czołówce najczęściej cytowanych polskich uczonych.
„What is Life?” — pytał Schrodinger w 1945 roku [1], Watson i Crick w 1953
publikowali swoje sztandarowe prace [2,3]. Kluczowa rola kwasów nukleinowych
w procesie zapisywania i przekazywania informacji genetycznej spowodowała, że
ich struktura i własności azotowych zasad nukleinowych były w drugiej połowie
XX wieku obiektami szczególnie intensywnych i pożądanych badań.
Anna Psoda*
Interdyscyplinarne Centrum Modelowania
Matematycznego i Komputerowego, Uniwersytet Warszawski, Warszawa
Interdyscyplinarne Centrum Modelowania
Matematycznego
i
Komputerowego,
Uniwersytet Warszawski, ul. Prosta 69, 00-838
Warszawa; e-mail: [email protected]
*
Artykuł otrzymano 22 lipca 2015 r.
Artykuł zaakceptowano 29 lipca 2015 r.
Słowa kluczowe: tautomeria zasad nukleinowych, równowaga tautomeryczna, mutageneza, spektroskopia w podczerwieni, drgania
rozciągające, pasma karbonylowe
Wiele z pochodnych zasad azotowych, z uwagi na ich aktywność biologiczną, okazało się bardzo ważne z punktu widzenia farmakologicznego. Obszerny
przegląd badań tautomerii puryn, pirymidyn, ich analogów naturalnych i syntetycznych, w kontekście znaczenia biologicznego, przedstawiony jest w pracach
przeglądowych Shugara i Psody [4] oraz Shugara i Kierdaszuka [5]. W pracy [4]
wykorzystaliśmy i cytujemy wyłącznie prace oryginalne, prezentujące wyniki
własne autorów, również w przypadku prac przeglądowych. Obszerną przeglądówkę W. Guschlbauer zadedykował prof. Shugarowi na 80-te urodziny, nadając
jej wdzięczny tytuł „Small is beautiful: major modifications in DNA structure of
dynamic by small substituents or ligands”[6]. Badania nad molekularnymi mechanizmami mutagenezy dla szerokiej klasy związków prowadzone w zespole prof.
Shugara opisuje w niniejszym numerze Postępów Biochemii B. Kierdaszuk.
Prace Davida Shugara i J.J. Foxa z 1952 roku [7-10], pierwsze w literaturze poświęcone spektroskopowym pomiarom absorpcji w nadfiolecie form obojętnych
i zjonizowanych pirymidyn i ich analogów, były dla nas punktem wyjścia do
dalszych badań tautomerii zasad. Przez jakiś czas byłam szczęśliwą posiadaczką odbitki fotograficznej jednej z nich, innej możliwości kopiowania wtedy nie
było. Nasze narzekania na małe ilości związków do prowadzenia badań profesor
ucinał stwierdzeniem: „my z Foxem w 52-gim mieliśmy pół (chyba?) miligrama
uracylu”. Do prac nad tautomerią niezbędne były specyficzne pochodne zasad
syntetyzowane przez Zygmunta Kazimierczuka, Jarosława Kuśmierka i Jerzego
Giziewicza, w tworzonym od podstaw laboratorium chemicznym. Były to skomplikowane, wieloetapowe syntezy, do których również wstępne substraty musiały
być u nas syntetyzowane, bo nawet jeśli były dostępne na rynku, to uzyskanie
na nie przydziału tzw. puli dolarowej było trudne i długotrwałe. Korzystaliśmy
oczywiście ze wsparcia ze strony Zakładu Biofizyki IBB PAN, ale wiele niezbędnych związków chemicznych, odczynników, rozpuszczalników oraz drobnego
sprzętu laboratoryjnego (kuwety do spektrofotometrów !!!) mieliśmy tylko dzięki
staraniom i kontaktom profesora Shugara1.
Oto wakacyjna kartka, z sierpnia 1971 r., cyt.: „Dziękuję za list który dziś otrzymałem. Także cieszę się
że artykuł przyjęty bez zmian. W tym tygodniu dostałem formycina. Przesyłam z żoną 3-metylocytydyna
oraz 1-metyloinozyna. Żona przyjeżdża 27-VIII. Zamawiam rzeczy dla Marysia oraz lampę xenonową.
Mam nowe projekty, o których pomówimy w październiku. Wyjeżdżam stąd 17-IX do Warszawy. Gorące
pozdrowienia dla p. Sierakowskiego, Marysia, Edek, Monika, Lilka i wszystkich, a także dla Was. DS
1
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
305
Zespół w Katedrze Biofizyki w większości składał się z
młodych fizyków i chemików. Był to nasz pierwszy kontakt
z biochemią i biologią, które odbieraliśmy jako nauki opisowe, mało konkretne; przy zetknięciu się ze złożonymi strukturami ciągle zadawaliśmy pytania dlaczego? dlaczego?
dlaczego? oczekując precyzyjnego powiązania struktur z
oddziaływaniami na poziomie molekularnym, a nawet atomowym2,3. Dziś możliwości modelowania i symulacji złożonych układów biologicznych, powiązanie ich struktury z
funkcjami życiowymi, zależą wyłącznie od wizji badawczej
i mocy obliczeniowych komputerów4, a wyniki tych obliczeń są natychmiast wykorzystywane przez zespoły doświadczalne i vice versa, co ma bezpośrednie przełożenie na
ich wdrożenie w medycynie i farmakologii. Minęło ponad
40 lat i formułka o znaczeniu farmakologicznym naszych
badań podstawowych, którą umieszczaliśmy w uzasadnieniu ich podejmowania, znalazła potwierdzenie.
WARSZTAT DOŚWIADCZALNY
Ogromne zainteresowanie badaniami struktur tautomerycznych zasad nukleinowych w kontekście ich roli w procesie mutagenezy, w szczególności powstawania mutacji
spontanicznych, zbiegło się w czasie z burzliwym rozwojem technik spektroskopowych w latach 60. i 70. Ograniczeniem, często uniemożliwiającym badania spektroskopowe
pochodnych zasad nukleinowych w roztworach (szczególnie w środowisku wodnym), była słaba rozpuszczalność
związków. Najciekawsze badania nad syntetycznymi polinukleotydami i ich składnikami były wtedy prowadzone z
wykorzystaniem spektroskopii w nadfiolecie, gdzie wystarczało stężenie kilka rzędów niższe niż w zakresie podczerwieni (IR) lub spektrometrii jądrowego rezonansu (NMR).
Późniejsze wprowadzenie analizy fourierowskiej do analizy
widm NMR i IR pozwoliło znacznie poszerzyć zakres prowadzonych badań. Obszerny przegląd stosowania spektroskopii IR w badaniach struktur kwasów nukleinowych
podaje Tsuboi [11].
Problem środowiska, w którym prowadzone były badania i który decydował o wyborze metod doświadczalnych,
był tematem ciągłych, burzliwych dyskusji w naszym zespole. Wychodziliśmy z założenia, że nawet środowisko
wodne, będące przecież środowiskiem naturalnym dla procesów zachodzących w komórce, jest tylko jego najlepszym
przybliżeniem. Pytaliśmy, jak się ma środowisko wodne do
środowiska naturalnego dla DNA? Zarzucaliśmy danym z
dyfrakcji rentgenowskiej, że były rejestrowane na materiale krystalicznym, widmom UV w roztworach wodnych, że
stężenie badanych związków jest o kilka rzędów wielkości
niższe niż w warunkach naturalnych, badaniom w roztworach niepolarnych, że nie uwzględniają oddziaływań z
Nasz wiara w moc fizyki była ogromna. M. Geller prowadził kurs mechaniki kwantowej dla naszych biochemiczek, M. Fikus i E. Kulikowskiej. Było to działanie wbrew panującemu stereotypowi, że fizyka
biologii nauczysz, ale biologa fizyki już nie. I na pewno zmniejszyło
przepaść wiedzy między nami.
3
Praca Schrodingera, zapis publicznych wykładów autora z 1943 roku,
uważana za początek myślenia biofizycznego o zjawisku życia, była
analizowana przez nas na wielu seminariach.
4
W obecnym miejscu pracy mam kontakt z absolwentami Katedry Biofizyki, którzy korzystają z komputerów dużej mocy. Ich kariery naukowe są imponujące.
2
306
wodą, a obliczeniom teoretycznym, że dotyczą fikcyjnych
sytuacji istniejących w próżni. Później okazywało się, że nasze wątpliwości były często na wyrost; dobrym przykładem
tego było potwierdzenie komplementarności zasad (ich wybiórcze łączenie się w pary poprzez wiązania wodorowe) w
środowisku niepolarnym [12,13].
Badania form obojętnych i zjonizowanych w podczerwieni prowadziliśmy w środowisku wodnym (ciężka woda)5,
w zakresie częstości 1250–1750 cm–1, gdzie obecne są pasma
absorpcyjne silnie związane z drganiami rozciągającymi wiązań podwójnych. Identyfikowaliśmy i analizowaliśmy pasma pochodzące od drgań grup karbonylowych C=O, C=C
i C=N obecnych w purynach i pirymidynach, proponowaliśmy strukturę badanych układów oraz, o ile było to możliwe,
wyznaczaliśmy stałe równowagi tautomerycznej. Widma w
poczerwieni i nadfiolecie były rejestrowane na spektrofotometrach produkcji Carl Zeiss Jena, w dawnym NRD. Była to
bardzo dobra, jak na tamte czasy, aparatura.6 Pisałam już o pozyskiwaniu związków potrzebnych do badań tautomerii7, dopiero z perspektywy lat doceniłam kunszt naszych chemików.
Trudne warunki pracy zmuszały ich do wytyczania własnych,
oryginalnych metod, do dziś są one cytowane w publikacjach.
TAUTOMERIA PIRYMIDYN
TIOPOCHODNE URACYLU
Nie wydaje mi się celowe po raz kolejny uzasadnianie
znaczenia podstawowych badań nad strukturą i tautomerią
form obojętnych i jonowych zasad nukleinowych, odsyłam
czytelnika do wspomnianej już wcześniej pracy przeglądowej Shugara i Psody [4]. Katritzky w pracy przeglądowej
z 1963 r. [14] podsumowuje wczesne prace z badań w roztworze wodnym i w stanie krystalicznym, dokumentujące
dominację form keto-amino dla podstawowych zasad. Bardzo istotna w historii badań nad tautomerią zasad jest praca
Lowdina z 1963 r. [15] o roli rzadkich form tautomerycznych w powstawaniu mutacji spontanicznych. Warte odnotowania są też praca Beak’a z 1977 r. [16] oraz przeglądowa
praca Kwiatkowskiego i Pullmana [17].
Prezentując nasze wyniki pokrótce przedstawiam genezę tych badań. Tiopochodne uracylu (Ryc. 1) nie były
systematycznie badane pod kątem poznania struktury ich
anionów. Dla 2-tiouracylu Shugar i Fox [10], na podstawie
widm UW, zaproponowali strukturę monoanionu podobną
do proponowanej przedtem dla uracylu [7], to jest z ładunkiem ujemnym na azocie N(3) bądź na tlenie O(4) i siarce
Jeśli badany związek za słabo się rozpuszczał w D2O stosowaliśmy
DMSO, mocniejszy jako rozpuszczalnik, o zbliżonej do wody polarności. Położenia pasm absorpcyjnych w badanym obszarze IR w obu
rozpuszczalnikach były zbliżone.
6
Mój pierwszy spektrofotometr IR zadziwiał goszczących u nas naukowców zza żelaznej kurtyny, był większy od małego fiata, mocno się
grzał, musiał być chłodzony wodą, bardzo głośno warczał. Produkował surowe widma, nie było mowy o żadnej obróbce ilościowej (ekstynkcja, rozkład pasm na składowe itp.).
7
Wprowadzanie podstawników (najczęściej grupy metylowej) eliminowało możliwość dysocjacji protonu z wybranej pozycji, a więc narzucało określoną formę tautomeryczną. Dla każdego podstawowego
związku potrzebnych było kilka metylowanych pochodnych. Z kolei
dla poprawienie rozpuszczalności wprowadzano duże podstawniki,
często też na grupach hydroksylowych rybozy.
5
www.postepybiochemii.pl
Rycina 1. Uracyl i cytozyna.
S(2). Wprowadzenie do tych badań spektroskopii w podczerwieni umożliwiło bezpośrednią obserwację pasm charakterystycznych dla wiązań podwójnych. 4-Tiouracyl miał
znaczenie biologiczne ze względu na obecność w tRNA, niskie pKa dysocjacji protonu wskazywało na obecność monoanionu w pH obojętnym, tak więc poznanie tautomerii form
jonowych było ważne.
Podjęte w latach 60. w Zakładzie Biofizyki IBB PAN badania równowagi tautomerycznej form jonowych uracylu,
tyminy i ich pochodnych w środowisku wodnym wykorzystały spektroskopię w podczerwieni do określenia struktury
tautomerów, co przyniosło bardzo interesujące wyniki [18].
Dzięki wnikliwej analizie pasm absorpcyjnych, charakterystycznych dla drgań rozciągających wiązań podwójnych
(C=O i C=C), udowodniono występowanie monoanionu
uracylu w formie dwóch tautomerów N(1)-H i N(3)-H w
stosunku 1:1, przy czym w obu ładunek ujemny okazał się
zdelokalizowany na pierścieniu pirymidyny. Związkami
modelowymi, w których podstawnik „wymusza” jedną
z form tautomerycznych monoanionu były 1- i 3-metylouracyl. W widmach monoanionów uracylu i jego metylowanych pochodnych znikały pasma karbonylowe C(2) =O
i C(4)=O, charakterystyczne dla form obojętnych. Podobne
badania wykonano również dla tyminy, 5-fluorouracylu i
innych pochodnych 2,4-dwuketopirymidyn [18]. Prowadzono też próby przesuwania równowagi tautomerycznej
poprzez zmianę środowiska lub inne czynniki zewnętrzne.
Podsumowanie badań struktur monoanionów innych dwuketopirymidyn przedstawiamy w pracy [4].
W podobnych metodologicznie badaniach tautomerii
tiopochodnych uracylu [19] napotkaliśmy nieco inną sytuację, wywołaną brakiem widmie pasma rozciągającego
drgań C(4) =S. Częstość ta jest nieaktywna ze względu na
mały moment dipolowy wiązania, trudno jest określić jego
charakter, tak więc analiza widma monoanionu zapowiadała się inaczej niż w uracylu. W widmach form obojętnych,
mierzonych w różnych rozpuszczalnikach (D2O, DMSO i
CDCl3) w zależności od rozpuszczalności, obecne są dwa
pasma o porównywalnym dla wszystkich pochodnych natężeniu, jedno bardzo mocne około 1700 cm–1, charakterystyczne dla drgań grupy karbonylowej, i drugie słabsze przy
1620 cm–1, identyfikowane jako drgania grupy C(5)=C(6) w
pierścieniu. Pasmo karbonylowe przesuwa się krótkofalowo pod wpływem metylacji, podobne przesunięcie dla uracylu i tyminy obserwowali Horak i Gut [20]. Natomiast potwierdzeniem przyporządkowania pasma 1620 cm–1 grupie
C(5) =C(6) jest jego znikanie po wysyceniu tego wiązania,
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
w widmie 1-metylo-5,6-dihydro-4-tioU obserwujemy tylko
częstość karbonylową przy 1707 cm-1. W widmie samego
uracylu pasmo(C(5)=C(6) nie występuje, pojawia się dopiero w widmie monoanionu [18]. Autorzy tłumaczą to silnym
sprzężeniem między C(4)=O a (C(5)=C(6). Zgodnie z tą interpretacją, obecność pasma (C(5)=C(6) w widmie 4-tioU
oznacza brak takiego sprzężenia. I rzeczywiście, podstawienie grupy metylowej na siarce (C(4)-S-CH3) nie przesuwa
pasma C(5)=C(6), jednocześnie silnie przesuwając pasma
C(2) =O (o 46 cm-1), co z kolei świadczy o silnym sprzężeniu
pomiędzy C(4)=S i C(2)=S. Podobnej analizy dokonano dla
widm cząsteczek obojętnych 2-tio i 2,4-dwutioU [22], wnioski były identyczne.
Przyporządkowanie pasm rozciągających wiązaniom podwójnym z jednej strony potwierdziło formę keto-tiono dla
cząsteczek obojętnych 4-tiouracylu8, a z drugiej, jednoznacznie identyfikując pasmo (C(5)=C(6), umożliwiło przejście do
badań struktury monoanionu. Porównanie widm UV monoanionów 4-tioU, 1-metylo-4-tioU i 3-metylo-4-tioU prowadziło
do wniosku, że monoanion 4-tiouracylu ma strukturę taką jak
anion jego 3-metylowanej pochodnej, a więc z protonem na
azocie N(1)-H. Natomiast żmudna analiza widm w podczerwieni, której nie będę przytaczać, wskazywała na równowagę
tautomeryczną N(1)-H i N(3)-H. Rozstrzygnięcie przyniosło
różniczkowe widmo UV [21], na podstawie którego okazało
się, że pasmo tam występujące składa się z dwóch, nachodzących na siebie pasm, które odpowiadają dwóm różnym tautomerom z ładunkiem rozmytym podobnie jak w pierścieniu
uracylu. Udział obu form tautomerycznych, wyznaczony ze
stosunku integralnych absorpcji pasm składowych, wyniósł
1:2.7 (N(3)-H/N(1)-H). Ta sama wielkość, wyznaczona ze stosunku natężeń pasm (C(5)=C(6) w podczerwieni, wynosi 1:3.
W obu przypadkach zaniedbywany był wpływ metylacji na
natężenie pasm w widmach monoanionów. Badania widm
UV i IR dwuanionu 4-tiouracylu zgodnie wskazały całkowitą
delokalizację ładunków ujemnych po dysocjacji protonów. Podobne badania tautomerii 2-tiouracylu [10,22] i 2,4-ditiouracylu [22] nie pozwoliły uzyskać tak jednoznacznych wyników9.
Zaproponowaliśmy dla monoanionu 2-tioU równowagę tautomeryczną N(3)-H / N(1)-H, w stosunku 1:1, z rozmytym
ładunkiem, co wyniknęło z ponownej analizy widm UV [10].
Interpretacja widm IR nie była tak jednoznaczna jak dla 4-tioU.
Natomiast w monoanionie 2,4-ditioU dominuje tautomer
N(3)-H, z 5% domieszką N(1)H.W pomiarach widm w podczerwieni i ramanowskich uczestniczyła nasza magistrantka
Katarzyna Machalska [23]. Równolegle z pracami doświadczalnymi prowadzone były obliczenia teoretyczne, pierwsze
w Katedrze, w tym dotyczące struktur tiouracyli [24]. Mają
one teraz jedynie wartość historyczną. Chciałam w tym miejscu dodać, że w Katedrze, pod kierunkiem Bogdana Lesynga
i wsparciem Stanisława Kwiatkowskiego z Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu, powstała bardzo silna grupa teoretyczna. Profesor Shugar początkowo zachowywał duży dystans do prac teoretycznych, ale później życzliwie je wspierał,
dając teoretykom pełną niezależność w prowadzeniu badań.
Ostatecznym potwierdzeniem formy keto-tiono była obecność w widmie
1-cykloheksylo-4tioU w chloroformie, w zakresie drgań rozciągających wiązań pojedynczych, pasma 3385 cm–1, charakterystycznego dla
N-H i brak absorpcji przy około 3600 cm–1, typowej dla O-H.
9
Nie mieliśmy wszystkich potrzebnych pochodnych i wystąpiły problemy z rozpuszczalnością.
8
307
Rycina 2. Kwas barbiturowy.
Rycina 3. Adenina i guanina.
KWAS 2-TIOBARBITUROWY,
2-TIOBARBITAL I ICH POCHODNE
pirymidynowym, a więc taką samą strukturę tautomeryczną obu kationów.
Pochodne kwasu barbiturowego (Ryc. 2) mają bardzo duże
znaczenie farmakologiczne, a ich tiopochodne są stosowane
w anestezjologii. Tautomerię kwasu barbiturowego badali i
opisali Shugar i Fox w 1952 r. [9], natomiast brakowało systematycznych badań dla kwasu 2-tiobarbiturowego i 2-tiobarbitalu. Przedstawiona w pracy Smith i wsp. z 1970 r. [25]
błędna interpretacja widm absorpcyjnych UV i wyciągnięcie
na tej podstawie wniosków o dominacji formy enolowej w
obojętnym kwasie 2-tiobarbiturowym, skłoniło nas do zajęcia się tym problemem. Było to bardzo interesujące wyzwanie. Te z badanych związków, w których mogły dysocjować
dwa protony, miały pK1 poniżej 7, a pK2 powyżej 12, należało
więc ustalić równowadze jakich form jonowych odpowiadają
poszczególne wartości tych stałych równowagi. Smith i wsp.
[25] twierdzili, że pK1 odpowiada przejściu z formy dwuprotonowej do monoprotonowej (dwukation i kation), a pK2
przejściu od formy uprotonowej do obojętnej. Nasza analiza
widm UV [26], poparta mocnymi dowodami w postaci widm
IR10 wskazywała na zupełnie coś innego, mianowicie, że pK1
odpowiada przejściu z formy obojętnej do monoanionu, a pK2
z monoanionu do dwuanionu. Wykazaliśmy, że powodem
błędnej interpretacji widm UV [25] było przypisanie wartości
pK10,7 równowadze jonowej kwasu 1,3-dimetylo-5,5’-di-n-propylo-2-tiobarbiturowego (podstawione wszystkie protony
zdolne do dysocjacji), podczas gdy faktycznie był to odwracalne, rozerwanie wiązania 1,6 pierścienia pirymidynowego
w środowisku alkalicznym. Poza jednoznacznym ustaleniem
struktur form obojętnych, monoanionów i dwuanionów kwasów tiobarbiturowych i tiobarbitali, omawiana praca zawiera
opis kilku nowych metod syntezy tiobarbituranów.
CYTOZYNA
Nasze badania nad tautomerią cytozyny stanowiły niewielki wkład do badań nad mutagennym działaniem hydroksyloaminy, prowadzonych przez zespół profesora Shugara w latach 70. [27-30]. Pamiętam, jakie znaczenie przywiązywał on do widm11 w podczerwieni (1450-1750 cm-1):
kationu 1-metylocytozyny (w tautomerycznej formie aminowej) i kationu 1,3-dwumetylocytozyny (zafiksowany tautomer w formie imino). Widma te były prawie identyczne,
co wskazywało na jednakowy rozkład wiązań w pierścieniu
W widmach w chloroformie pochodnych z zafiksowaną formą keto-tiono, zidentyfikowaliśmy intensywne pasma: 3370 cm–1 (drgania rozciągające grupy N-H) i pasma około 1700 cm–1 (drgania rozciągające
C=O). W widmach w wodzie w pH obojętnym brak pasm przy 1700
cm-1.
11
Były to jedyne widma IR cytowane w tej pracy przeglądowej [4].
10
308
Badaliśmy również strukturę i oddziaływania w roztworach niepolarnych pochodnych 5-metylo-N4-hydroksycytocyny [31,32], śledząc wpływ stężenia, temperatury i
polarności rozpuszczalnika na widmo IR. Stwierdziliśmy,
że: a) badane związki występują w formie imino, również
w fazie gazowej; b) grupa hydroksylowa występuje w konformacji syn względem azotu N(3); c) pomiędzy protonem
grupy N(3)-H a tlenem O4 prawdopodobnie tworzy się wewnątrzcząsteczkowe wiązanie wodorowe; d) 1,5-dimetylo-N4-hydroksycytozyna tworzy w roztworze międzycząsteczkowe asocjaty liniowe poprzez wiązanie wodorowe
(dla którego wyznaczono jego parametry termodynamiczne); e) nie stwierdzono oddziaływań hydroksyaminocytozyn z potencjalnie komplementarną 9-etyloadeniną. Późniejsze badania, prowadzone w innych warunkach, wykazały jednak ich występowanie [33].
Badania były kontynuowane, ich szczegółowy opis zawiera artykuł B. Kierdaszuka w niniejszym numerze Postępów Biochemii. Swoje badania tautomerii 5-podstawionych
cytozyn metodą spektrometrii IR (izolowanych w matrycach gazów szlachetnych) i teoretycznych obliczeń ab initio
przedstawia także Jaworski [34]. Badania te, zainicjowane
przez prof. Shugara, były później prowadzone przez inne
zespoły w Polsce m. in. w Instytucie Fizyki PAN, Instytucie
Chemii Fizycznej PAN i Instytucie Fizyki Politechniki Warszawskiej.
TAUTOMERIA PURYN
Badania tautomerii pochodnych puryn (Ryc. 3), modyfikowanych chemicznie do związków promutagennych
wywołujących trwałe błędy genetyczne (zobacz artykuły
J. Kuśmierka i R. Stolarskiego w tym numerze) rozpoczęły się w Katedrze od O6-metyloguaniny. Prowadziliśmy
badania szerokim frontem, z wykorzystaniem metod
spektroskopowych, syntezy chemicznej i obliczeń teoretycznych [34,35]. Te i dalsze badania obszernie prezentuje w tym numerze B. Kierdaszuk.
Badaliśmy też tautomerię wielu specyficznych puryn,
bardzo zróżnicowanymi metodami. Wpływ rozpuszczalnika na przesunięcie równowagi keto-enolowej w isoguaninie badał Sepioł i wsp. [36], a struktury jej uprotonowanej formy w krysztale Banerjee i Saenger we wspólpracy z
zespołem Shugara [37].
www.postepybiochemii.pl
INOZYNA
Na koniec przejdę do badań tautomerii inozyny, od których zaczęłam pracę pod kierunkiem profesora Shugara; ich
wyniki zostały opublikowane [39] w bardzo dobrym czasopiśmie. To o nich pisze Profesor w pocztówce, którą cytuję
w przypisie 1. To była dla mnie duża satysfakcja, nigdy później nie poszło tak gładko.
Na podstawie badań doświadczalnych [40], potwierdzonych teoretycznie [41], wiadomo było, że inozyna
w środowisku obojętnym występuje w formie 6-keto.
Znajomość formy tautomerycznej inozyny miała duże
znaczenie ponieważ zasada ta jest ona obecna w antykodonie tRNA, gdzie odgrywa ważną rolę. Występowanie
jej w rzadkiej formie enolowej mogłoby mieć poważne
następstwa. Występowanie inozyny w równowadze keto-enolowej, z jednakowym udziałem obu form, postulował Wolfenden [42] na podstawie widm absorpcji UV i IR
oraz analizy przesunięć chemicznych w widmach NMR.
Nasze własne badania widm IR i UV [39] oraz prowadzone równolegle badania rozpraszania ramanowskiego [43]
nie potwierdziły rewelacji Wolfendena. Przeanalizowaliśmy jego rozumowanie. Sugerował on, że asymetryczne
pasmo w zakresie karbonylowym w widmie IR obojętnej
inozyny (1675 cm–1 ) to dwa słabo rozdzielone pasma: karbonylowe i pasmo związane z drganiami deformacyjnymi grupy hydroksylowej. Podobnie interpretował widmo
absorpcyjne UV, w którym asymetrię widoczną na długofalowym zboczu głównego pasma przypisał formie enolowej. Tymczasem asymetria występuje też w widmie UV
1-metyloinozyny, która ma zafiksowaną formę keto, nie
może więc być przypisana formie enolowej. Porównanie
widm IR inozyny z widmami 1-metyloinozyny (keto) i
rybozydu 6-metoksypuryny (strukturalny odpowiednik
formy enolowej inozyny) jednoznacznie wskazuje na formę keto samej inozyny. W widmie pochodnych inozyny
w rozpuszczalnikach niepolarnych zidentyfikowaliśmy
pasmo rozciągające wiązania N-H przy 3385 cm–1 i brak
absorpcji odpowiadającej drganiom grupy O-H, co ostatecznie zaprzeczyło obecności formy enolowej. Wkrótce
Wolfenden wycofał się ze swojej interpretacji. Przykład
inozyny był jednym z wielu przypadków nieskutecznego
polowania na rzadkie formy tautomeryczne zasad nukleinowych.
Przedmiotem naszych wieloletnich zainteresowań była
także tautomeria ksantyny, tioksantyny i dużej grupy ich
pochodnych (Ryc. 4). Wyniki badań były prezentowane na
konferencjach, początkowe badania opisała w swojej pracy
magisterskiej G. Hahn-Mendoza [44], całości niestety nigdy
nie przygotowałam do publikacji.
ZAKOŃCZENIE
Przystępując do pisania tego artykułu próbowałam zorientować się dokąd doprowadził dalszy rozwój badań nad
tautomerią zasad nukleinowych. Okazało się to dla mnie z
różnych względów niewykonalne, mogę tylko powtórzyć
za Beak’iem: „Old Problems — New Answers”(1977) [16].
Odsyłam zainteresowanych do kilku prac z ostatnich lat,
których tytuły mówią same za siebie [45-50].
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
Rycina 4. Hipoksantyna i ksantyna.
PIŚMIENNICTWO
1. Schrodinger (1945) What is life? – The physical aspect of the living cell.
The Macmillan Co
2. Watson JD, Crick FHC (1953) Molecular structure of nucleic acids: A
structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171: 737-738
3. Watson JD, Crick FHC (1953) General implications of the structure of
deoxyribonucleic acid. Nature 171: 964-967
4. Shugar D, Psoda A (1990) Tautomerism of purines and pyrimidines,
their nucleosides and various analogues W: Landoldt-Bornstein – Numerical Data and Functional Relationship in Science and Technology,
New Series, Group VIII, Vol. 1: Nucleic Acids, subvol. D: Physical
Data II, str. 308-344
5. Shugar D, Kierdaszuk B (1985) New light on tautomerism of purines
and pyrymidines, and its biological and genetics implications. J Biosci
8: 657-668
6. Guschlbauer W (1996) „Small is beautiful”: major modifications in
DNA structure of dynamic by small substituents or ligands. Acta Biochim Polon 43: 77-94
7. Shugar D, Fox JJ (1952) Spectrophotometric studies of nucleic acid derivatives and related compounds as a function of pH. I. Pyrimidines.
Biochim Biophys Acta 9: 199-218
8. Fox JJ, Shugar D (1952) Spectrophotometric studies of nucleic acid derivatives and related compounds as a function of pH. II. Natural and
synthetic pyrimidine nucleosides. Biochim Biophys Acta 9: 369-384
9. Fox JJ, Shugar D (1952) Absorption spectra and structure of barbituric
acid derivatives as a function of pH. Bull Soc Chim Belge 61: 44-63
10.Fox JJ, Shugar D (1952) Absorption Spectra and Structure of 2-Tiouracil Derivatives as a Function of pH. Bull Soc Chim Belge 61: 293-309
11.Tsuboi M (1969) Application of infrared spectroscopy to structure studies of nucleic acids. Applied Spectroscopy Rev (Marcel Dekker) 3:
45-90
12.Kyogoku Y, Lord RC, Rich A (1967) An infrared study of hydrogen
bonding between adenine and uracil derivatives in chloroform solutions. J Am Chem Soc 89: 497-504
13.Kyogoku Y, Lord RC. Rich A (1967) The Effect of Substituents on the
Hydrogen Bonding of Adenine and Uracil Derivatives. Proc Nat Acad
Sci USA 57: 250-257
14.Katritzky AR, Lagowski JM (1963) Adv Heterocycl Chem 1: 312
15.Lowdin PO (1963) Effects on Proton Tunneling in DNA on Genetic Information and Problem of Mutation, Aging and Tumors. Biopolymers
Symp. (M. Wiessbluth, red., Interscience Publishers 1: 161-181
16.Beak P (1977) Energies and alkylation of tautomeric heterocyclic compounds: old problems — new answers. Acc Chem Res 10: 186
17.Kwiatkowski JS, Pullman A (1975) Tautomerism and electronic structure of biological pyrimidines. Adv Heterocyclic Chem. (Katritzky
AR, red) 18: 199
18.Wierzchowski KL, Litońska E, Shugar D (1965) Infrared and ultraviolet studies on the tautomeric equilibria in aqueous medium between monoanionic species of uracil, thymine, 5-fluorouracil and other
2,4-diketo-pyrimidines. J Am Chem Soc 87: 4621-4629
19.Psoda A, Kazimierczuk Z, Shugar D (1974) Structure and tautomerism
of the neutral and monoanionic forms of 4-thiouracil derivatives. J Am
Chem Soc 96: 6832-6839
309
20.Horak M, Gut J (1961) Nucleic acids components and their analogues.
XI. Infrared spectroscopy of uracil, 6-azauracil and their derivatives in
the carbonyl group streching vibration region. Collection Czechoslov
Chem Commun 26: 1680-1693
21.Olobry E (1973) Zastosowanie spektroskopii różniczkowej do badań
widm absorpcji w nadfiolecie pochodnych pirymidyn. Praca magisterska, Zakład Biofizyki, Instytut Fizyki Doświadczalnej, Uniwersytet Warszawski
22.Psoda A, Shugar D (1979) Structure and tautomerism of the neutral
and monoanionic forms of 2-thiouracil, 2,4-dithiouracil, their nucleosides, and some related derivatives. Acta Biochim Polon 26: 55-72
23.Macalska K (1973) Badanie form tautomerycznych 4-tiouracylu i jego
pochodnych metodą spektroskopii w podczerwieni i spektroskopii
ramanowskiej. Praca magisterska, Zakład Biofizyki, Instytut Fizyki
Doświadczalnej, Uniwersytet Warszawski
24.Geller M, Pohorille A, Jaworski A (1973) Electronic structure of thiouracils and their interactions with adenine. Biochim Biophys Acta 331:
1-8
25.Smith WF, Svehla G, Zuman P (1970) Polarography of some sulphur
containing compounds. XV. Polarographic and spectral investigation
of acid-base equilibria in aqueous solution of substituted 2-thiobarbiturates. Anal Chim Acta 51: 463-482
26.Kazimierczuk Z, Psoda A, Shugar D (1973) Ultraviolet and Infrared
Spectral Studies on the Structure and Tautomeric Forms of 2-Tiobarbituric Acids and 2-Thiobarbitals. Acta Biochim Polon 20: 83-100
27.Janion C, Shugar D (1965) Reaction of hydroxylamine with 5-substituted cytosines. Biochem Biophys Res Commun 18: 617-622
28.Janion C (1972) Hydroxylamine mutagenesis: ultraviolet absorption
spectra and tautomeric forms of N4-hydroxy, N4-metoxy and N4-methyl, N4-hydroxy derivatives of cytosine and 5- and 6-methylcytosines. Acta Biochim Polon 19: 261-275
29.Shugar D, Huber CP, Birnbaum GI (1976) Mechanism of hydroxylamine mutagenesis. Crystal structure and conformation of 1,5-dimethyl-N4-hydroxycytosine. Biochim Biophys Acta 447: 274-284
30.Kulikowski T, Shugar D (1979) Methylation and tautomerism of 1-substituted 5-fluorocytosines. Acta Biochim Polon 26: 145-160
31.Kulińska K, Psoda A, Shugar D (1980) Mechanism of hydroxylamine
mutagenesis: an infrared study of the association in non-polar solutions of 5-methyl-N4-hydroxycytosines. Acta Biochim Polon 27: 57-65
32.Kulińska K (1975) Badania w podczerwieni asocjacji pochodnych
5-metylo-N4-hydroksylocytozyny. Praca magisterska, Zakład Biofizyki, Instytut Fizyki Doświadczalnej, Uniwersytet Warszawski
33.Kierdaszuk B, Shugar B (1983) Structure of the planar complex of N4-methoxycytosine with adenine, and its relevance to the mechanism of
hydroxylamine mutagenesis. Biophys Chem 17: 285-295
34.Jaworski A (1990) Infrared spectra and tautomerism of 5-fluorocytosine, 5-brmocytosine and 5-iodocytosine. Matrix isolation and theoretical ab initio studies. J Mol Struct 223: 63-92
with adenine, and its relevance to the mechanism of hydroxylamine
mutagenesis. Int J Quantum Chem 20: 543-549
36.Kierdaszuk B (1979) Oddziaływania międzycząsteczkowe pochodnych zasad purynowych i pirymidynowych badane metodą spektroskopii oscylacyjnej i teoretycznie. Praca magisterska, Zakład Biofizyki,
Instytut Fizyki Doświadczalnej, Uniwersytet Warszawski
37.Sepiol J, Kazimierczuk Z, Shugar D (1976) Tautomerism of isoguanosine and solvent -induced keto-enol equilibrium. Z Naturforsch C 31:
8892
38.Banerjee A, Saenger W, Lesyng B, Kazimierczuk Z, Shugar D (1978)
9-Methylisoguanine hydrochloride dihydrates crystal structure and
charge densities. Acta Crystallogr Sect B 34: 2472-2477
39.Psoda A, Shugar D (1971) Spectral studies on tautomeric forms of inosine. Biochim Biophys Acta 240: 507-513
40.Miles HT (1959) Infrared spectra and tautomeric structure of polyinosinic and policytidylic acids in D2O solution. Biochim Biophys Acta
35: 274-275
41.Kwiatkowski JS (1969) SCF MO CI calculations for hypoxanthine and
guanine tautomers. Acta Phys Polon 36: 1081-1091
42.Wolfenden RV (1969) Tautomeric equilibria in inosine and adenosine.
J Mol Biol 40: 307-310
43.Medeiros GC, Thomas GJ, Jr (1971) On the tautomeric structure of inosine. Biochim Biophys Acta 238: 1
44.Hahn-Mendoza G (1972) Badania form tautomerycznych ksantyny i
jej metylowanych pochodnych metodą spektroskopii w podczerwieni.
Praca magisterska, Instytut Fizyki Doświadczalnej, Uniwersytet Warszawski
45.Peng CS, Fedeles BI, Sigh V, Li D, Amariuta T, Essigmann JM, Tokmakoff A (2015) Two-dimensional IR spectroscopy of the anti-HIV
KP1212 reveals protonated and neutral tautomers that influence pH-dependent mutagenicicty. Proc Natl Acad Sci USA 112: 3229-3234
46.Brovarets OO, Hovorun DM (2014) Why the tautomerization of the G
center dot C Watson-Crick base pair via the DPT does not cause point
mutations during DNA replication? QM and QTAIM comprehensive
analysis. J Biomol Struct Dyn 23: 1474-1499
47.Kimsey IJ, Petzold K, Sathyamoorthy B, Stein ZW, Sathyamoorthy B
(2015) Visualizing transient Watson-Crick-like mispairs in DNA and
RNA duplexes. Nature 519: 315-320
48.Kimsey IJ, Zhou H, Alvey H, Al-Hashimi HM (2015) Role of dynamic
base pair polymorphism in the central dogma of molecular biology. J
Biomol Struct Dyn Suppl 1: 75-76
49.Zhou H, Hintze BJ, Kimsey IJ, Sathyamoorthy B, Yang S, Richardson
JS, Al-Hashimi HM (2015) New insight into Hoogsteen base pairs in
DNA duplexes from a structure-based survey. Nucleic Acids Res 43:
3420-3433
50.Singh V, Fedeles BI, Essigmann JM (2015) Role of tautomerism in RNA
biochemistry. RNA 21: 1-13
35.Psoda A, Kierdaszuk B, Pohorille A, Geller M, Kuśmierek JT, Shugar
D (1981) Interaction of the mutagenic base analogs O6-methylguanine
Tautomerism of purine and pyrimidyne bases
Anna Psoda*
Interdysciplinary Centre for Mathematical and Computational Modelling, University of Warsaw, 69 Prosta Str., 00-838 Warsaw, Poland
*
e-mail: [email protected]
Key words: tautomerism of nucleic acids bases, tautomeric equilibrium, mutagenesis, infrared spectroscopy, stretching vibrations, carbonyl
frequencies
ABSTRACT
In this paper, I am presenting the background and a short outline of the research on the neutral and ionic tautomeric forms of pyrimidines,
purines and their derivatives, carried out in the late 1960s under the guidance of professor David Shugar, in the Biophysics Department of
Warsaw University.
310
www.postepybiochemii.pl