FULL TEXT - Ortopedia Traumatologia Rehabilitacja

Transkrypt

ed
.
tio
np
roh
ibit
Concentration of Platelet Derived-Growth
Factors in Concentrates Used to Regenerate Injured
Bone Tissue
dis
tr
ibu
Jolanta Korsak1(A,D,E,F), A. Rzeszotarska1(B,C,D,F), Wojciech Marczyński2(A,D,E),
Iwona Jabłońska2(B,C,F), Jerzy Białecki2(B,C,F), Piotr Walczak2(B,C,F)
1
Zakład Transfuzjologii Klinicznej Wojskowego Instytutu Medycznego w Warszawie, Polska
Klinika Ortopedii Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego, Samodzielny Publiczny Szpital Kliniczny
im. Prof. A. Grucy w Otwocku, Polska
1
Division of Clinical Transfusiology, Military Institute of Medicine, Warsaw, Poland
2
Department of Orthopedic Surgery, Postgraduate Medical Education Center, Prof. A. Gruca Independent Public Teaching Hospital in Otwock, Poland
ly -
2
STRESZCZENIE
pe
rso
na
lu
se
on
Wstęp. Powszechny problem leczenia złożonych złamań stanowią zaburzenia zrostu różnego typu, zarówno pochodzenia biologicznego jak i jatrogennego. Upośledzenie procesu regeneracji tkanki kostnej bywa następstwem braku potencjału biologicznego gojenia i stymulacji osteogenezy w miejscu ubytku kostnego. Metodą stosowaną w stymulacji zrostu kostnego jest miejscowe
podanie koncentratu płytkopochodnych czynników wzrostu. Celem pracy była ocena stężenia płytkopochodnych czynników
wzrostu w ich koncentracie przed i po aktywacji mieszaniną trombiny i chlorku wapnia.
Materiał i metody. Badaniami objęto 30 próbek pochodzących z koncentratu płytkopochodnych czynników wzrostu. Płytki krwi
aktywowano dodając CaCl2 i 20 j. m. trombiny. Powstały skrzep inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 min. i ponownie odwirowano. W każdej próbce oznaczano liczbę krwinek płytkowych, stężenie PDGF AB, TGF-β1, VEGF i IGF-1. Badania wykonano zgodnie z zalecanymi procedurami. W przypadku oznaczenia PDGF AB dokonano własnej modyfikacji procedury, polegającej na zmianie
rozcieńczenia badanej próbki. Analizę statystyczną przeprowadzono testem nieparametrycznym, korelację rang Spearmana.
Wyniki. W badaniach własnych uzyskano 6,27-krotny wzrost liczby płytek krwi w koncentratach płytkopochodnych czynników wzrostu w porównaniu z liczbą krwinek płytkowych w krwi pełnej. Stwierdzono 5,6-krotny wzrost stężenia PDGF AB
w koncentratach po aktywacji. Stężenie pozostałych badanych czynników wzrostu po aktywacji CaCl2 i trombiną wzrosło 1,2-2krotnie w porównaniu ze stężeniem w krwi pełnej. W badaniach własnych nie wykazano statystycznie znamiennych korelacji pomiędzy liczbą płytek a stężeniem poszczególnych czynników wzrostu.
Wnioski. Uzyskane wyniki wskazują, że zastosowana metoda otrzymywania koncentratu płytkopochodnych czynników wzrostu
może być metodą skuteczną w uzyskaniu preparatu o wysokiej liczbie krwinek płytkowych oraz pozwala otrzymać mieszaninę
płytkopochodnych czynników wzrostu o stężeniu kilkakrotnie przewyższającym stężenie w krwi pełnej.
Słowa kluczowe: płytki krwi, czynniki wzrostu, walidacja, zrost kostny, stymulacja gojenia
SUMMARY
is c
op
y is
for
Background. Bone union disorders of various kinds, of both iatrogenic and biological origin, are a common problem in the
treatment of compound fractures. Impairment of bone regeneration often results from lack of biological potential for healing and
lack of stimulation of osteogenesis at the site of bone loss. Bone union is stimulated by topical administration of a concentrate of
platelet-derived growth factors. The aim of the study was to assess the concentration of platelet-derived growth factors in a concentrate before and after activation with a mixture of thrombin and calcium chloride.
Material and methods: The study comprised 30 samples of platelet-derived growth factor concentrates. Platelets were
activated with CaCl2 and 20 IU of thrombin. The resultant clot was incubated for 30 min at 37°C and then centrifuged again. The
platelet count and PDGF AB, TGF-ß1, VEGF and IGF-1 concentrations were determined in each sample. The measurements were
performed in accordance with recommended procedures. In the case of PDGF AB, the procedure was modified by changing the
number of dilutions. A nonparametric test (Spearman rank correlation) was used for the statistical analysis.
Results. The study showed that the platelet count in a PDGF concentrate was 6.27 times higher than in whole blood. PDGF
AB concentration in the PDGF concentrate in our study increased 5–6 times after activation. Concentrations of other growth
factors increased 1.2- to 2-fold after CaCl2 – and thrombin-induced activation in comparison to whole blood levels. There were
no statistically significant correlations between the platelet count and the concentration of particular growth factors.
Conclusions. The study’s findings showed that the method of obtaining a platelet-derived growth factor concentrate may be
an effective method of obtaining a platelet-rich preparation with a high platelet count. The concentrations of the measured plateletderived growth factors in the concentrate were several times higher than in whole blood samples.
Th
This copy is for personal use only - distribution prohibited.
-
Ocena stężenia czynników wzrostu pochodzenia
płytkowego w koncentracie stosowanym w celu
regeneracji uszkodzonej tkanki kostnej
Key words: blood platelets, growth factors, validation, bone union, stimulation of healing
-
O r t o p e d i a Traumatologia Rehabilitacja
© MEDSPORTPRESS, 2013; 5(6); Vol. 15, 379-388
ARTYKUŁ ORYGINALNY / ORIGINAL ARTICLE
379
is c
op
y is
for
pe
rso
na
lu
se
on
ly -
dis
tr
ibu
tio
np
roh
ibit
ed
.
BACKGROUND
Musculoskeletal injuries are the most common
cause of disability and pain and considerably affect
the quality of life [1]. Almost half of these injuries
are bone fractures, and bone union disorders of various kinds, of both iatrogenic and biological origin,
are a common therapeutic problem [2,3]. Another
important group of orthopaedic diseases contributing
to high skeletal disability rates comprises disorders
whose mechanism results from lack of stimulation of
osteogenesis at the site of bone loss [4]. These statistics have drawn attention to the potential of the blood
and possibilities for harnessing this potential.
Blood does not transport only oxygen and nutrients; it also contains cells and proteins which are
responsible for haemostasis, controlling infections,
regeneration of bone tissue and also contribute to
wound healing [4]. This role is played by growth
factors released from platelets. They are believed to
stimulate connective tissue repositioning and accelerate epithelization and angiogenesis [1,5,6].
Normal bone tissue repair relies on the so-called
Lynch triad. The first element of the triad is the
carrier, which can be bony material of autogenous
origin. Signaling molecules of the healing process
are the next element, and cells which respond to
growth factors are the third element of the triad. They
include undifferentiated and partly committed cells
such as preosteoblasts, fibroblasts, chondroblasts;
and differentiated cells such as fibrocytes and osteocytes [7-9]. Platelet-derived growth factors are two
elements of the Lynch triad: they constitute a matrix
and have osteoinductive properties [10]. Table 1 presents the types of platelet-derived growth factors and
their functions.
Numerous published studies have shown that
platelet-derived growth factors can be used in many
complex surgical procedures involving both soft and
bone tissue [3,13,14]. Menetrey et al demonstrated
that FGF and IGF-1 accelerate the healing of muscle
tissue [15]. Similar results were reported by Anitua et
al. [3,16].
Platelet-derived growth factors are obtained from
autologous blood. A PDGF concentrate also contains
around 95% platelets, 5% red blood cells and less
than 1% white blood cells. PDGFs are released from
both dense and alpha granules of thrombocytes after
activation. Platelets can be activated via their adhesion to subendothelial connective tissue and when exposed to thrombin, collagen, platelet activating factor;
they may also be activated by the very process of isolation during whole blood centrifuging [17]. A concentrate of platelet-derived growth factors is activa-
Th
-
WSTĘP
Uszkodzenie układu mięśniowo-szkieletowego
jest najpowszechniejszą przyczyną inwalidztwa i bólu, znacznie obniżające jakość życia [1]. Prawie połowę tych uszkodzeń stanowią obrażenia tkanki kostnej, w leczeniu których problemem są zaburzenia
zrostu kostnego zarówno pochodzenia biologicznego,
jak i jatrogennego [2,3]. Kolejną znaczną grupę inwalidztwa pochodzenia szkieletowego stanowią choroby ortopedyczne, których istotą jest brak stymulacji osteogenezy w miejscu ubytku kostnego [4]. Te statystyki zwróciły uwagę na potencjał tkwiący w krwi
i możliwości jego wykorzystania. Krew przenosi nie
tylko tlen i składniki odżywcze, ale również zawiera
komórki i białka, które odpowiadają za hemostazę,
zwalczają zakażenia, regenerują tkankę kostną i przyczyniają się do gojenia ran [4]. Rolę tę wypełniają
czynniki wzrostu uwalniane z płytek krwi. Uważa się,
że stymulują one repozycję tkanki łącznej, przyśpieszają epitelizację oraz przyśpieszają angiogenezę
[1,5,6]. Do prawidłowego procesu naprawczego
tkanki kostnej konieczna jest tzw. triada Lyncha.
Pierwszym elementem triady jest nośnik, którym
może być materiał kostny pochodzenia autogennego.
Kolejnym elementem są cząsteczki sygnałowe procesu gojenia, a trzeci stanowią komórki, na które oddziaływają czynniki wzrostu. Są nimi komórki niezróżnicowane i częściowo zdeterminowane, np.: preosteoblasty, fibroblasty, chondroblasty oraz komórki
zróżnicowane, takie jak fibrocyty i osteocyty [7-9].
Płytkopochodne czynniki wzrostu są dwoma elementami triady Lyncha, stanowią rusztowanie i mają właściwości osteoindukcyjne [10]. W Tabeli 1 przedstawiono rodzaje płytkowych czynników wzrostu i ich
funkcje.
W wielu opublikowanych wynikach badań wykazano, że płytkopochodne czynniki wzrostu można
wykorzystać w wielu skomplikowanych operacjach
zarówno tkanek miękkich, jak i kostnych [3,13,14].
Menetrey i wsp. dowiedli, że FGF (fibroblastic growth
factor – fibroblastyczny czynnik wzrostu) i IGF-1
(insulin-like growth factor – insulinopodobny czynnik wzrostu) przyśpieszają proces gojenia się tkanki
mięśniowej [15]. Podobne wyniki uzyskali Aniuta
i wsp. [3,16].
Płytkopochodne czynniki wzrostu otrzymuje się
z krwi pełnej autologicznej. Koncentrat płytkopochodnych czynników wzrostu zawiera ponadto ok. 95%
płytek krwi, 5% krwinek czerwonych i poniżej 1%
krwinek białych. Płytkopochodne czynniki wzrostu
uwalniane są z ziarnistości gęstych i z ziarnistości
α krwinek płytkowych po ich aktywacji. Do aktywacji płytek krwi może dochodzić w wyniku ich adhe-
-
Korsak J. i wsp., Metody regeneracji uszkodzonej tkanki kostnej
380
-
tio
np
roh
ibit
ibu
ly -
dis
tr
op
y is
for
pe
rso
na
lu
se
on
ted with a mixture of calcium chloride and bovine
thrombin. The use of thrombin, however, may be
associated with a risk for allergic reactions. Reported
complications primarily include anaphylactic complications with the formation of antibodies to Factor
V, hypotension and coagulopathy [18].
Consequently, the need has arisen in clinical practice of developing a method of preparing and administering a platelet growth factor concentrate without
having to pre-activate it with exogenous thrombin.
Platelet activation would take place through endogenous thrombin after administration of the preparation, which was the basis for formulating the aim
of the present study.
The aim of the study was thus to assess the concentration of platelet-derived growth factors in platelet-rich plasma before and after platelet activation
with a mixture of calcium chloride and thrombin;
and to validate the method.
MATERIAL AND METHODS
We analysed 30 samples of concentrates of platelet-derived growth factors. The concentrates were
prepared at the MIM Division of Clinical Transfusiology according to a method of preparation developed
is c
MATERIAŁ I METODY
Badaniami objęto 30 próbek pochodzących z koncentratu płytkopochodnych czynników wzrostu. Każdy koncentrat przygotowywany był z krwi pełnej
w Zakładzie Transfuzjologii Klinicznej WIM według
Th
-
zji do podsródbłonkowej tkanki łącznej oraz pod
wpływem działania trombiny, kolagenu, czynnika aktywującego płytki, ale może je również aktywować
sam proces izolacji poprzez wirowanie krwi pełnej
[17]. W procedurach preparatyki koncentrat płytkopochodnych czynników wzrostu poddaje się aktywacji mieszaniną chlorku wapnia i trombiny wołowej.
Stosowanie trombiny może jednak wiązać się z ryzykiem wystąpienia powikłań alergicznych. Opisywane powikłania to przede wszystkim powikłania anafilaktyczne, z wytworzeniem przeciwciał do czynnika V, występowanie hipotensji i koagulopatii [18].
Wobec tego w praktyce klinicznej pojawił się problem wyboru metody preparatyki koncentratu płytkopochodnych czynników wzrostu i stosowania go bez
wcześniejszej aktywacji egzogenną trombiną. Aktywacja płytek krwi zachodziłaby po aplikacji preparatu pod wpływem trombiny endogennej, co było podstawą celu pracy.
Celem prezentowanej pracy była ocena stężenia
czynników wzrostu w osoczu bogatopłytkowym przed
i po aktywacji mieszaniną chlorku wapnia i trombiny
oraz walidacja metody.
-
ed
.
Tab. 1. Płytkowe czynniki wzrostu uwalniane z krwinek płytkowych i ich funkcje [11,12]
Tab. 1. Platelet growth factors released from platelets and their functions [11,12]
-
Korsak J. et al., Methods of regenerate injured bone tissue
381
se
on
ly -
dis
tr
ibu
tio
np
roh
ibit
ed
.
at the Division. Once a patient’s consent had been
obtained, 30 ml of blood was collected from a vein in
the elbow pit into a test tube containing ACD fluid in
a ACD-to-whole blood ratio of 1 ml : 9 ml.. The contents of test tubes were centrifuged twice. The first
centrifugation was carried out for 9 min at 900 rpm
and produced platelet-rich plasma, which was centrifuged again for 16 min at 3,000 rpm. This process
yielded 1.5 ml of concentrate. Platelets were then
activated by adding CaCl2 and 20 IU of thrombin.
The resultant clot was incubated for 30 min at 37°C
and then centrifuged again for 15 min at 14,000 rpm.
Test samples were taken from the concentrated
platelet preparation before and after platelet activation, and stored at -80°C (samples tested for TGF-β1)
and -25°C (samples tested for PDGF-AB, VEGF, IGF-1
concentrations).
The platelet count and PDGF-AB, TGF-ß1, VEGF
and IGF-1 concentrations were determined in each
sample.
Platelet counts were determined with a BeckmanCoulter hematology analyzer. Growth factor concentrations were measured with Quantikine kits (R&D
Systems Inc. Minneapolis, MN, USA). TGF-ß1, VEGF
and IGF-1 levels were measured according to procedures recommended by the manufacturers. In the
case of PDGF-AB, the procedure was modified by
changing the number of dilutions: the samples were
diluted 100 times before activation and 350 times
after activation.
A nonparametric test (Spearman rank correlation)
was used for the statistical analysis because the data
did not follow a normal distribution.
lu
rso
na
pe
for
WYNIKI
is c
op
y is
1. Porównanie liczby płytek krwi
w koncentracie płytkopochodnych czynników
wzrostu i krwi pełnej
Porównując liczbę płytek krwi w koncentracie
płytkopochodnych czynników wzrostu i krwi pełnej
wykazano, że wartość badanego parametru różni się
w obu badanych materiałach. Wyniki przedstawiono
w Tabeli 2.
Na ich podstawie można stwierdzić, że liczba
krwinek płytkowych w koncentracie płytkopochodnych czynników wzrostu była 6,27 razy wyższa niż
w krwi pełnej. Wykazano istotną statystycznie różnicę pomiędzy badanymi parametrami (p< 0,05).
Th
-
własnej metody preparatyki. Po uzyskaniu zgody pacjenta z żyły zgięcia łokciowego pobierano 30 ml
krwi do probówek zawierających płyn ACD w proporcji ACD/krew pełna 1 ml: 9 ml. Następnie probówki z krwią dwukrotnie odwirowywano: pierwsze
wirowanie 9 min. przy obrotach 900 obr./min. W wyniku wirowania uzyskiwano osocze bogatopłytkowe,
które poddawano kolejnemu wirowaniu przez 16 min.,
obroty 3 000/min. Otrzymano zagęszczony do 1,5 ml
preparat płytek krwi. Płytki krwi aktywowano dodając CaCl2 (końcowe stężenie 23 mmol/l) i 20 jm. trombiny. Powstały skrzep inkubowano w temperaturze
37°C przez 30 min. delikatnie mieszając i ponownie
odwirowano przez 15 min. przy 14 tach/min.
Próbki do badań pobierano z zagęszczonego preparatu płytek krwi przed i po aktywacji, a następnie
przechowywano w temperaturze -80°C (próbki,
w których badano stężenie TGF-β1) oraz -25°C (próbki,
w których badano stężenie PDGF-AB, VEGF, IGF-1).
W każdej próbce oznaczano liczbę krwinek płytkowych, stężenie PDGF AB, TGF-ß1, VEGF i IGF-1.
Liczbę płytek krwi badano przy użyciu analizatora hematologicznego Beckman-Coulter. Oznaczenia
stężenia czynników wzrostu wykonywano metodą
immunoenzymatyczną przy użyciu zestawów Quantikine (R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, USA).
Oznaczenia TGF-ß1, VEGF i IGF-1 wykonano zgodnie z zalecaną przez producenta procedurą. W przypadku oznaczenia PDGF AB dokonano własnej modyfikacji procedury polegającej na zmianie wielokrotności rozcieńczeń: próbkę pobraną przed aktywacją rozcieńczano 100-krotnie, a po aktywacji dokonano 350-krotnego rozcieńczenia.
Do przeprowadzenia analizy statystycznej zastosowano test nieparametryczny – korelację rang Spearmana z uwagi na niespełnienie warunku normalności danych.
-
382
RESULTS
1. Comparison of platelet count
in platelet-derived growth factor concentrate
vs. whole blood
A comparison of the platelet count in the platelet
growth factor concentrate and whole blood revealed
differences in platelet count (see Table 2).
The table shows that platelet count in the platelet
growth factor concentrate was 6.27 times higher than
in whole blood. The difference between the parameters was statistically significant (p<0.05).
-
ed
.
tio
np
roh
ibit
ibu
dis
tr
ly -
on
se
pe
rso
na
Tab. 3. Ocena stężenia PDGF AB w koncentracie płytkopochodnych czynników wzrostu przed i 30 minut po aktywacji mieszaniną trombiny i chlorku wapnia
Tab. 3. PDGF-AB concentration in platelet-derived growth factor concentrate before and 30 minutes after activation with a mixture of thrombin and calcium chloride
y is
Th
is c
op
Tab. 4. Ocena stężenia IGF-1 w koncentracie płytkopochodnych czynników wzrostu przed i 30 minut po aktywacji mieszaniną
trombiny i chlorku wapnia
Tab. 4. IGF-1 concentration in platelet-derived growth factor concentrate before and 30 minutes after activation with a mixture of
thrombin and calcium chloride
-
2. Comparison of the concentrations
of platelet-derived growth factors in the
concentrate before and after platelet activation
A comparison of the concentrations of plateletderived growth factors in the concentrate before and
after platelet activation in a mixture of thrombin and
calcium chloride showed high individual variability
of the concentrations of particular growth factors.
The results obtained for PDGF AB, IGF-1, VEGF,
TGF-β1 in the concentrate before activation and at
30 minutes after activation are presented in the following Tables.
The concentrations of the platelet-derived growth
factors tested in the concentrate after activation in
a mixture of thrombin and calcium chloride were higher than the concentrations of these factors in the concentrate before activation. Differences between these
parameters were statistically significant (p<0.05)
lu
2. Porównanie stężeń badanych
płytkopochodnych czynników wzrostu
w koncentracie przed i po aktywacji
Porównując stężenia płytkopochodnych czynników wzrostu w koncentracie przed i po aktywacji mieszaniną trombiny i chlorku wapnia, otrzymano wysoką
indywidualną zmienność poszczególnych czynników
wzrostu. Wyniki oceny stężeń PDGF AB, IGF-1, VEGF,
TGF-β1 w ich koncentracie przed i 30 minut po aktywacji przedstawiono w kolejnych Tabelach.
Stężenia badanych płytkopochodnych czynników
wzrostu w koncentracie poddanym aktywacji mieszaniną trombiny i chlorku wapnia były wyższe w porównaniu ze stężeniami tych czynników w koncentracie
przed aktywacją. Wykazano istotną statystycznie różnicę pomiędzy badanymi parametrami (p<0,05).
W badaniach własnych uzyskano 5-6 krotny wzrost
stężenia PDGF AB w koncentracie płytkopochodnych
czynników wzrostu po aktywacji w porównaniu ze
for
-
Tab. 2. Porównanie liczby krwinek płytkowych w koncentracie płytkopochodnych czynników wzrostu i krwi pełnej
Tab. 2. Comparison of the number of platelets in platelet-derived growth factor concentrate and in whole blood
-
383
tio
np
roh
ibit
ed
.
Tab. 5. Ocena stężenia VEGF w koncentracie płytkopochodnych czynników wzrostu przed i 30 minut po aktywacji mieszaniną
Tab. 5. VEGF concentration in platelet-derived growth factor concentrate before and 30 minutes after activation with a mixture
of thrombin and calcium chloride
se
In our study, PDGF concentration in platelet-derived growth factor concentrate was 5–6 times higher after
activation than before activation. The other growth factors’ concentrations increased between 1.2- and 2-fold.
lu
stężeniem we krwi pełnej. Stopień koncentracji pozostałych badanych czynników wzrostu zawierał się
w granicach 1,2-2 krotnego ich wzrostu.
on
ly -
dis
tr
ibu
Tab. 6. Ocena stężenia TGF-ß1 w koncentracie płytkopochodnych czynników wzrostu przed i 30 minut po aktywacji mieszaniną
Tab. 6. TGF-β1 concentration in platelet-derived growth factor concentrate before and 30 minutes after activation with a mixture
of thrombin and calcium chloride
op
y is
for
pe
rso
na
3. Związek pomiędzy liczbą krwinek
płytkowych a stężeniem płytkopochodnych
czynników wzrostu przed i po aktywacji
mieszaniną trombiny i chlorku wapnia
Porównując liczbę krwinek płytkowych i stężenia płytkopochodnych czynników wzrostu w ich koncentracie przed i po aktywacji nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic. Uzyskane wyniki dla badanych czynników wzrostu przedstawiono w Tabeli 7.
Analiza statystyczna ujawniła ujemną korelację
pomiędzy liczbą płytek krwi a stężeniem badanych
czynników wzrostu pochodzenia płytkowego. Wykazano, że istotny wpływ na stężenie czynników wzrostu ma aktywacja płytek krwi, liczba płytek krwi zależy tylko od ich zagęszczenia w preparacie.
3. Comparison of platelet count and plateletderived growth factor concentrations before
and after activation in a mixture of thrombin
and calcium chloride
A comparison of the platelet count and plateletderived growth factor concentrations before and after
activation revealed no statistically significant differences.
The results obtained for individual growth factors
are presented in Table 7.
The statistical analysis showed a negative correlation between the platelet count and the concentrations of platelet-derived growth factors. Platelet activation was found to significantly influence the concentration of growth factors; the platelet count depended only on their concentration in the preparation.
DISCUSSION
Obrażenia tkanki kostnej stanowią ok. 45% wszystkich uszkodzeń układu mięśniowo-szkieletowego.
Promowana w ostatnich latach aktywność fizyczna
spowodowała niemalże epidemię tych uszkodzeń.
Dodatkowo nowoczesne metody diagnostyki obrazo-
Bone tissue injuries account for approx. 45% of
all musculoskeletal injuries. Physical activity, so
heavily promoted in recent years, has resulted in a near
epidemic of these injuries. Moreover, the modern modalities of diagnostic imaging provide detailed
Th
is c
DYSKUSJA
-
-
-
-
384
-
tio
np
roh
ibit
ed
.
Tab. 7. Porównanie liczby krwinek płytkowych i stężenia badanych płytkopochodnych czynników wzrostu w koncentracie przed
i po aktywacji trombiną i chlorkiem wapnia
Tab. 7. Comparison of the number of platelets and the concentrations of the studied platelet-derived growth factors concentrate
before and after activation with a mixture of thrombin and calcium chloride
se
lu
rso
na
pe
Th
is c
op
y is
for
wej dostarczają szczegółowej wiedzy o patofizjologii obrażeń [2,3]. Powikłaniem złamań mogą być zaburzenia zrostu kostnego. Współczesna ortopedia
i traumatologia narządu ruchu coraz częściej wykorzystuje płytkopochodne czynniki wzrostu w leczeniu,
w sytuacjach gdzie istnieją wskazania do regeneracji
tkanek miękkich i tkanki kostnej. Koncentraty płytkopochodnych czynników wzrostu mogą być otrzymywane metodami automatycznymi i manualnymi.
Ich skuteczność zależy głównie od stężenia czynników wzrostu, które uwalniane są z ziarnistości płytkowych po ich aktywacji. Fizjologicznie aktywacja
płytek zachodzi w wyniku ich adhezji do śródbłonka
naczyń oraz pod wpływem różnorodnych substancji.
W przypadku laboratoryjnego otrzymywania koncentratu czynników wzrostu pochodzenia płytkowe-
information on the pathophysiology of injury [2,3].
Abnormal bone union may be a complication of
a fracture. Contemporary orthopedics and musculoskeletal traumatology are increasingly using plateletderived growth factors in therapy where the regeneration of soft and bone tissues is advisable. Plateletderived growth factor concentrates can be obtained
automatically or manually. Their effectiveness depends primarily on the concentration of growth factors
which are released from platelet granules following
activation. Physiologically, platelets become activated
when they adhere to the vascular endothelium and
also by being stimulated by various substances.
When a platelet-derived growth factor concentrate is
produced in the laboratory, platelets are activated
with bovine thrombin mixed with calcium chloride.
-
-
-
on
ly -
dis
tr
ibu
-
385
se
on
ly -
dis
tr
ibu
tio
np
roh
ibit
ed
.
The administration of an alien protein to a patient
may result in allergic complications that are sometimes severe [18]. The theoretic background to the
study was the use of platelet-derived growth factor
concentrate without pre-activation with exogenous
thrombin. Platelets would undergo activation due to
endogenous thrombin. That is why the aim of the
study was to assess the concentrations of PDGF-AB,
IGF-1, VEGF and TGF-ß1 in manually obtained platelet-derived growth factor concentrates (produced
according to a method developed at the Division of
Clinical Transfusiology of MIM) before and after
activation with thrombin and calcium chloride.
In our study, VEGF and IGF-1 concentrations doubled (1049.52 ng/ml and 113.10 ng/ml, respectively) at
30 minutes after platelet activation in a mixture of
thrombin and calcium chloride compared to the preactivation concentrations of these factors (524.22
ng/ml and 75.70 ng/ml, respectively). A particularly
dynamic increase (almost 6 times) was seen in the
case of PDGF AB, with its levels rising from 70.00
ng/ml to 392.00 ng/ml. A significantly small increase
in concentration was noted for IGF-1, whose levels
rose from 73.70 before activation with thrombin and
calcium chloride to 86.45 ng/ml at 30 minutes following activation. Although the concentrations of particular factors varied at 30 minutes after the plateletderived growth factor concentrate was produced,
a general trend could be detected of instant release of
such factors as PDGF AB, TGF-ß1 and VEGF and
delayed release of IGF-1.
Su Chen Y et al. also studied the kinetics of growth
factor concentration increase after preparing a platelet-derived growth factor concentrate at 5 to 300 minutes relative to activation with a mixture of thrombin
and calcium ions [19,20]. PDGF AB, TGF-ß1, EGF
and VEGF levels increased to 76.0, 114.0, 3.7 and
0.8 ng/ml, respectively, in comparison with 30.4,
38.14, 0.29 and 0.3 ng/ml, respectively, in preparations where thrombin was not used. The growth factors were released gradually and rather quickly, except
for IGF-1, whose concentration remained constant at
about 80 ng/ml, regardless of thrombin volume. These
findings may suggest a non-platelet origin for this
factor [19].
The platelet count in the platelet-derived growth
factor concentrate increased 6 times (statistically
significant) in comparison with the platelet count in
whole blood (1,225.7x10^3/µl vs. 195.37x10^3/µl).
Similar results were reported by Marx et al., whose
study revealed the mean platelet count to be 3.38
times higher in the concentrate than in peripheral
blood. The authors believed that bone regeneration
could be initiated with approx. 5 ml of platelet con-
lu
rso
na
pe
for
y is
op
is c
Th
-
go do aktywacji płytek krwi wykorzystuje się trombinę pochodzenia wołowego zmieszaną z chlorkiem
wapnia. Podanie obcego białka chorym może się wiązać z powikłaniami alergicznymi, nawet o ciężkim przebiegu [18]. Teoretyczną podstawą pracy było stosowanie koncentratu płytkopochodnych czynników wzrostu bez wcześniejszej aktywacji egzogenną trombiną. Aktywacja płytek zachodziłaby pod wpływem
trombiny endogennej. Dlatego też, celem pracy była
ocena stężenia PDGF AB, IGF-1, VEGF i TGF-ß1
w koncentracie płytkopochodnych czynników wzrostu
otrzymanych metodą manualną opracowaną w Zakładzie Transfuzjologii Klinicznej WIM przed i po aktywacji mieszaniną trombiny i chlorku wapnia.
W badaniach własnych uzyskano 2-krotny wzrost
stężenia VEGF oraz IGF-1 (odpowiednio 1049,52 ng/
ml, 113,10 ng/ml) 30 min. po aktywacji mieszaniną
chlorku wapnia i trombiny w porównaniu ze stężeniami
tych czynników przed aktywacją, odpowiednio 524,22
ng/ml i 75,70 ng/ml. Szczególną kinetykę wzrostu stężenia, prawie 6-krotny wzrost, stwierdzono w przypadku PDGF AB z 70,00 ng/ml do 392,00 ng/ml. Znamiennie niską dynamikę wzrostu stężenia obserwowano
w stężeniu IGF-1: przed aktywacją 73,70 ng/ml, po aktywacji trombiną i chlorkiem wapnia w czasie 30 min
86,45 ng/ml. Pomimo różnic w stężeniach poszczególnych czynników w ciągu 30 min. od powstania koncentratu płytkopochodnych czynników wzrostu, uchwycono ogólny schemat mówiący o natychmiastowym uwalnianiu takich czynników jak: PDGF AB, TGF-ß1 oraz
VEGF i opóźnionym uwalnianiu IGF-1.
Su Chen Y. i wsp. również badali kinetykę zwiększenia stężeń czynników wzrostu po przygotowaniu
koncentratu płytkopochodnych czynników wzrostu
w czasie od 5 do 300 minut w zależności od aktywacji mieszaniną trombiny i jonów wapnia [19,20]. Uzyskali wzrost PDGF-AB, TGF-ß1, EGF i VEGF do odpowiednio 76,0, 114,0, 3,7 i 0,8 ng/ml w porównaniu
do odpowiednio 30,4, 38,14, 0,29 i 0,3 ng/ml w preparatach, w których nie stosowano trombiny. Obserwowano stopniowe i dosyć szybkie uwalnianie wyżej wymienionych czynników wzrostu z wyjątkiem
IGF-1, którego stężenie niezależnie od objętości trombiny utrzymywało się na stałym poziomie około 80
ng/ml. Wyniki te mogą wskazywać na inne niż płytkowe pochodzenie tego czynnika [19].
Badając liczbę krwinek płytkowych w koncentracie płytkopochodnych czynników wzrostu stwierdzono ich 6-krotny, znamienny statystycznie, wzrost
w porównaniu z liczbą płytek krwi w krwi pełnej
(1 225,7 tys./µl vs. 195,37 tys./µl). Z piśmiennictwa
wynika, że podobne wyniki uzyskał Marx i wsp.,
liczba krwinek płytkowych była średnio około 3,38
razy wyższa w koncentracie niż we krwi obwodowej
-
386
-
CONCLUSIONS
op
y is
for
pe
rso
na
lu
se
on
ly -
dis
tr
ibu
tio
np
roh
ibit
ed
.
centrate at 1,000,000 platelets/µl [14]. At the same
time, Mazzucco et al. used a preparation containing
4–5 times more platelets than their baseline count in
peripheral blood to obtain a therapeutic effect [21].
Our study compared the platelet count and growth
factor concentrations in platelet-derived growth factor
concentrates. We did not find any statistically significant correlations between the platelet count and
the concentrations of platelet-derived growth factors.
It may indicate a considerable individual variability
of platelet count in peripheral blood, platelet response to activation and the degree of release of particular growth factors during this process.
Weibrich et al. investigated the platelet count and
PDGF-AB, TGF-ß1, IGF-1 concentrations in concentrates of platelet-derived growth factors obtained
with two different methods [22,23]. In their study,
platelet counts ranged from 1 to even 2 million/μl,
with concentrations of PDGF-AB ranging between
251.8 and 314.1 ng/μl, TGF-ß1 levels ranging from
79.7 to 467.1 ng/μl and IGF-1 levels ranging between 69.5 and 91.0 ng/μl, depending on the method
used. The authors did not find any significant correlations between the platelet count and the concentrations of particular growth factors in preparations
obtained according to both methods [22,23].
The findings of our study indicate that the method
of obtaining platelet-derived growth factor concentrate used in the study is an effective method for obtaining a preparation containing a high platelet count
and high concentrations of platelet-derived growth
factors. The statistical analysis showed greater increases in the concentration of growth factors when
platelets were activated with bovine thrombin and
calcium chloride. One must bear in mind, though,
that the application of the concentrate at the site of
action is associated with a risk for adverse reactions
to an alien protein.
WNIOSKI
1. Platelet activation with thrombin and calcium
chloride results in a statistically significant increase in platelet-derived growth factor concentrations in a concentrate.
2. The platelet count in growth factor concentrates
does not significantly influence the concentrations of these factors.
is c
1. Aktywacja krwinek płytkowych chlorkiem wapnia i trombiną powoduje statystycznie znamienny
wzrost stężeń płytkopochodnych czynników wzrostu w ich koncentratach.
2. Liczba krwinek płytkowych w koncentratach czynników wzrostu nie ma istotnego wpływu na stężenia tych czynników.
Th
-
i stwierdził, że do zapoczątkowania procesów regeneracyjnych kości było niezbędne około 5 ml koncentratu krwinek płytkowych przy ich liczbie około
1 000 000 płytek krwi/ul [14]. Z kolei, Mazzucco
i wsp. w celu osiągnięcia odpowiednich efektów terapeutycznych stosowali preparaty zawierające liczbę krwinek płytkowych 4-5 razy większą od ich liczby wyjściowej we krwi obwodowej [21].
W badaniach własnych oceniono zależność liczby krwinek płytkowych oraz stężeń poszczególnych
płytkopochodnych czynników wzrostu w ich koncentratach. Nie stwierdzono istotnych statystycznie
zależności pomiędzy liczbą płytek krwi a stężeniem
czynników wzrostu. Może to świadczyć o dużej zmienności osobniczej dotyczącej zarówno liczby płytek krwi
obwodowej jak również ich podatności na aktywację
i stopień uwalniania poszczególnych czynników wzrostu podczas tego procesu.
Korelację liczby krwinek płytkowych oraz stężenie PDGF-AB, TGF-ß1, IGF-1 w koncentratach płytkopochodnych czynników wzrostu oceniali również
Weibrich i wsp.; ocena ta prowadzona była w preparatach otrzymanych dwoma różnymi metodami [22,
23]. Uzyskali oni liczbę płytek krwi od 1 do nawet 2
milionów / ul oraz stężenie PDGF-AB w zależności
od metody pomiędzy 251,8-314,1 ng/ul, TGF-ß1 pomiędzy 79,7-467,1 ng/ul oraz IGF-1 69,5-91,0 ng/ul.
Badacze nie wykazali żadnych statystycznych korelacji pomiędzy liczbą płytek krwi a stężeniem poszczególnych czynników wzrostu w preparatach otrzymanych przy użyciu obu metod [22,23].
Przedstawione wyniki badań wskazują, że zastosowana metoda otrzymywania koncentratu płytkopochodnych czynników wzrostu jest skuteczną w uzyskaniu preparatu o wysokiej liczbie płytek krwi i wysokim stężeniu płytkopochodnych czynników wzrostu. Na podstawie porównań statystycznych stwierdzono, że uzyskane wyniki wzrostu stężenia czynników są wyższe w przypadku preparatów aktywowanych przy zastosowaniu chlorku wapnia i trombiny
wołowej. Należy jednak, przy aplikacji koncentratu
w miejsce jego działania, rozważyć możliwość wystąpienia niepożądanych reakcji związanych ze stosowaniem obcego białka.
-
387
pe
rso
na
lu
se
on
ly -
dis
tr
ibu
tio
np
roh
ibit
ed
.
1. Woolf AD, Pfleyer B. Burden of major musculoskeletal conditions. Bull World Health Organ 2003;81:646-656.
2. Sampson S, Gerhardt M, Mandelbaum B. Platelet rich plasma injection grafts for musculoskeletal injuries: a review. Curr Rev
Musculoskelet Med 2008;1:165-174.
3. Anitua M, Sanchez E, Nurden A, et al. New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends
Biotechnol 2006;24:227-234.
4. Jurk K, Kehrel BE. Platelets physiology and biochemistry. Semin Thromb Hemost 2005;31:281-392.
5. Mishra A, Pavelko T. Treatment of chronic elbow tendinosis with buffered platelet-rich plasma. Am J Sports Med 2006.
6. Barret S, Erredge S. Growth factors for chronic plantar fasciitis. Pediatry Today 2004;17:37-42.
7. Tate KS, Crane DM. Platelet Rich Plasma Grafts in Musculoskeletal Medicine. J Prolotherapy 2010;2:371-376.
8. Rožman P, Bolta Z. Use of platelet growth factors in treating wounds and soft-tissue injuries. Acta Dermatoven APA 2007;
16:156-165.
9. Cieślik-Bielecka A, Bielecki T, Gaździk TSz, Cieślik T. Czynniki wzrostu zawarte w osoczu bogatopłytkowym jako autogennym
materiał stymulującym procesy gojenia tkanki kostnej. Czas Stomatol 2006;7:510-517.
10. Jiang Di, Dziak R, Lynch SE, Stephan EB. Modification of an osteoconductive anorganic bovine bone mineral matrix with
growth factors. J Periodontol 1999;70:834-839.
11. Barzini P, Mazzucco L. Tissue regeneration and in loco administration of platelet derivatives: Clinical outcome, heterogeneous
products, and heterogeneity of the effector mechanisms. Transfusion 2005;45:1759-1767.
12. Sanchez M, et al. Comparison of surgically repaired Achilles tendon tears using platelet-rich fibrin matrices. Am J Sp Med 2007.
13. Hee, et al. Do autologous growth factors enhance transforaminal lumbar interbody fusion? Eur Spine J 2003;12:400-407.
14. Marx RE, Carlson E, Eichstaedt RM et al. Platelet-Rich Plasma: Growth factors enhancement for bone grafts. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1998;85:638-646.
15. Menetrey J, Kasmkijwattana C, Day CS, et al. Growth facrors improve muscle healing in vivo. J Bone Joint Surg Br 2000;
82:131-137.
16. Antitua E, Andia I, Sanchez M, et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF
and HGF productions by human tendon cells in culture. J Orthop Res 2005;23:281-286.
17. Plow EF, Ginsberg MH. The molecular basis for platelet function. W: Hoffman R, Benz EJ, Shattil SJ, et al (ed). Hematology.
Basic principles and practice. Chuchill Livigstone 2000:1741-1752.
18. Mazzucco L, Medici D, Serra M, et al. The use of autologous platelet gel to treat difficult-to-heal wounds: a pilot study.
Transfusion 2004;44:1013-1018.
19. Su Chen Y, Kuo YP, Lin YC, et al. Quantitative assessment of the kinetics of growth factors release from platelet gel.
Transfusion 2008;48:2414-2420.
20. Su Chen Y, Kuo YP, Lin YC, et al. A virally inactivated functional growth factor preparation from human platelet concentrates.
Vox Sang 2009;97:119-128.
21. Mazzucco L, Balbo V, Cattana E, et al. Not every PRP-gel is born equal evaluation of growth factor availability for tissues
through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure. Vox Sang 2009;97:110-118.
22. Weibrich G, Hansen T, Kleis W, Buch R, Hitzler WE. Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on Peri-implant
bone regeneration. Bone 2004;34:665-671.
23. Weibrich G, Kleis W, Hafner G. Growth factor levels in the platelet-rich plasma produced by 2 different methods: Curasantype PRP Kit versus PCCS PRP System. Intern J Oral and Maxill Implants 2002;17:184-190.
for
-
PIŚMIENNICTWO / REFERENCES
y is
op
is c
Liczba słów/Word count: 5269
Tabele/Tables: 7
Ryciny/Figures: 0
Th
Adres do korespondencji / Address for correspondence
Jolanta Korsak
Zakład Transfuzjologii Klinicznej Wojskowego Instytutu Medycznego
04-141 Warszawa, ul. Saszerów 128, tel/fax: (22) 681-72-06, e-mail: [email protected]
-
-
388
Piśmiennictwo/References: 23
Otrzymano / Received
Zaakceptowano / Accepted
23.02.2013 r.
14.06.2013 r.

FULL TEXT - Ortopedia Traumatologia Rehabilitacja

Transkrypt

Podobne dokumenty

Inicjatywa Mission for Growth

CONTROL AND CYBERNETICS

Szkoła letnia: International school of synthesis of

FULL TEXT - Medycyna Sportowa

This copy is for personal use only

Growth hacking podstawą sukcesu w e

Youth Return ROSA ® - ampułka 12 ml lub 30 szt. „naturalnych

Przelicznik wagowy - E

Biochemiczne markery przebudowy kości, aktywności płytki