Zapisz jako PDF

Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary
fluorescencyjne (dr Anna Modrak-Wójcik)
Spis treści
1 Wstęp
2 Właściwości fluorescencyjne białek
3 Wymagania do kolokwium wstępnego
4 Przebieg ćwiczenia
5 Opis końcowy
6 Literatura
Wstęp
Badania procesów zwijania i rozwijania białek stanowią ważną grupę zagadnień biofizyki
molekularnej. W przypadku większości białek, przyjęcie prawidłowej (natywnej) struktury
przestrzennej jest konieczne dla pełnienia specyficznej funkcji biologicznej. Alternatywna
konformacja zwykle prowadzi do powstania cząsteczki o odmiennych właściwościach, która może
być toksyczna dla organizmu. U podłoża wielu chorób (np. mukowiscydozy czy chorób
neurodegeneracyjnych) leży zaburzenie procesu zwijania się białek, często prowadzące do
powstawania agregatów (włókna amyloidowe).
Denaturacja to proces prowadzący do zniszczenia struktury II, III- i IV-rzędowej białka natywnego i
utraty aktywności biologicznej makrocząsteczki. Sekwencja aminokwasowa jest zachowana, gdyż
czynniki denaturujące zaburzają oddziaływania stabilizujące strukturę przestrzenną białka –
wiązania wodorowe, mostki solne, oddziaływania hydrofobowe, wiązania disiarczkowe. Denaturację
mogą wywołać zarówno czynniki fizyczne (ogrzewanie, wytrząsanie, naświetlanie promieniowaniem
UV, jonizującym, rentgenowskim), jak i chemiczne (kwasy, zasady, jony metali ciężkich, mocznik,
chlorowodorek guanidyny). Mocznik oraz chlorowodorek guanidyny (Rys. Figure 1) należą do grupy
związków chaotropowych (ang. chaotrope — czyniący chaos). Powodują silne zaburzenie sieci wiązań
wodorowych, co skutkuje destabilizacją struktury białka i jego denaturacją. Obecność chlorowodorku
guanidyny o stężeniu 6 M niszczy trzeciorzędową i drugorzędową strukturę białek, a większość z
nich przybiera w tych warunkach formę kłębka statystycznego (random coil). Chlorowodorek
guanidyny jest najczęściej wykorzystywanym czynnikiem denaturującym w badaniach mechanizmu
zwijania się białek.
Struktura chlorowodorku guanidyny
Proces denaturacji białek może być obserwowany przy użyciu różnych technik eksperymentalnych,
takich jak spektroskopia absorpcyjna i emisyjna w zakresie UV/Vis, dichroizm kołowy czy NMR.
Pomiary fluorescencyjne wyróżniają się wysoką czułością i specyficznością.
Właściwości fluorescencyjne białek
Za absorpcję i fluorescencję białek w zakresie UV odpowiedzialne są aminokwasy aromatyczne:
tryptofan (Trp), tyrozyna (Tyr) i fenyloalanina (Phe). Związki te posiadają pierścienie ze sprzężonym
układem węglowych wiązań podwójnych typu π (Rys. Figure 2), co powoduje zmniejszenie różnicy
energetycznej między poziomami π i π* i wzrost prawdopodobieństwa przejść π→ π* i π*→ π.
tryptofan
tyrozyna
fenyloalanina
Figure 2: Wzory strukturalne aminokwasów aromatycznych
Maksimum absorpcji tryptofanu przypada w 278 nm (Rys. Figure 3, Rys. Figure 4). Położenie
maksimum emisji silnie zależy od polarności rozpuszczalnika, w roztworach wodnych wynosi ok. 355
nm, w solwentach niepolarnych przesuwa się w stronę krótszych fal. Tyrozyna posiada maksimum
absorpcyjne w 274 nm, a położenie pasma emisji (maksimum w 303 nm) nie zależy od polarności
otoczenia. Fenyloalanina charakteryzuje się najbardziej krótkofalowym widmem absorbcji i emisji, z
maksimum odpowiednio w 260 i 280 nm i najniższą wydajnością kwantową (Rys. Figure 3, Rys.
Figure 4). Spośród widm absorbcji aminokwasów aromatycznych, widmo absorpcji tryptofanu sięga
najdłuższych fal. Umożliwia to selektywne wzbudzanie fluorescencji reszt tryptofanowych w białkach
(dla wzbudzeń powyżej 295 nm).
Figure 3: Parametry spektralne aminokwasów aromatycznych w roztworze wodnym, pH 7,0
aminokwas absorpcja
Phe
258
[nm]
[M-1cm-1] emisja
200
282
[nm] wydajność kwantowa
0,02
Tyr
274
1400
303
0,14
Trp
278
5600
355
0,13
Absorpcja i fluorescencja białek jest zdominowana przez tryptofan. Po pierwsze, tryptofan posiada
najwyższy współczynnik ekstynkcji spośród trzech aminokwasów aromatycznych (Rys. Figure 3). Po
drugie, pomimo że wydajności kwantowe tyrozyny i tryptofanu w roztworze są podobne, w białkach
natywnych emisja pochodząca od tyrozyny jest często wygaszana, przede wszystkim w wyniku
bezpromienistego rezonansowego przeniesienia energii (FRET, ang. Förster resonance energy
transfer) między tyrozyną a tryptofanem.
Ze względu na mały współczynnik ekstynkcji i niską wydajność kwantową fenyloalaniny (w białku
dodatkowo obniżoną przez FRET między Phe i Tyr lub Trp), fluorescencja Phe jest obserwowana
praktycznie tylko w przypadku braku w sekwencji aminokwasowej białka pozostałych dwóch
aminokwasów aromatycznych.
Widma absorbcji i fluorescencji
aminokwasów aromatycznych: fenyloalaniny
(Phe), tyrozyny (Tyr) i tryptofanu (Trp) w
roztworach wodnych o pH 7,0. Widma
zostały unormowane do jedności w
maksimach.
FRET jest zjawiskiem przekazania energii między pierwotnie wzbudzonym donorem a
niewzbudzonym akceptorem. Przekazanie energii zachodzi bez emisji fotonu, na skutek
długozasięgowego oddziaływania dipol-dipol z udziałem donora i akceptora. Wydajność tego procesu
zależy między innymi od stopnia nakładania się widma emisji donora i absorpcji akceptora oraz od
odległości donor-akceptor. Odległości, które pozwalają na zajście FRET są porównywalne z
rozmiarami makrocząsteczek biologicznych (20-60 Å). Ze względu na częściowe przekrywanie się
widma fluorescencji fenyloalaniny z widmem absorpcji tyrozyny i tryptofanu oraz widma
fluorescencji tyrozyny z widmem absorpcji tryptofanu (Rys. Figure 4) w białkach często mamy do
czynienia z bezpromienistym przeniesieniem energii pomiędzy fenyloalanią a tyrozyną lub
tryptofanem oraz pomiędzy tyrozyną i tryptofanem.
Spektroskopia emisyjna jest doskonałym narzędziem do badania procesu denaturacji białek.
Emisyjne właściwości reszt tryptofanowych w białkach natywnych (położenie maksimum widma
emisji, wydajność kwantowa) silnie zależą od ich od lokalnego otoczenia. Białka posiadające reszty
tryptofanowe w otoczeniu hydrofilowym mają maksimum emisji zbliżone do maksimum emisji
tryptofanu w roztworze wodnym. Maksimum przesuwa się w kierunku fal krótszych wraz
odizolowaniem reszt od środowiska wodnego (do 330-340 nm). Różnorodność tę znosi denaturacja, w
wyniku której wszystkie reszty aminokwasowe mają kontakt z rozpuszczalnikiem (random coil).
Rozwinięcie białka prowadzi także do wzrostu odległości między resztami aminokwasowymi, między
którymi zachodziło bezpromieniste przeniesienie energii (FRET). W związku z tym, jeśli w sekwencji
aminokwasowej obecne są tyrozyny, w widmie emisji białek zdenaturowanych, oprócz piku
tryptofanowego, często pojawia się pasmo pochodzące od tyrozyn.
Struktura krystalograficzna
ludzkiej albuminy
Podczas ćwiczenia zbadasz proces rozwijania albuminy z krwi wołu (BSA) pod wpływem
chlorowodorku guanidyny. Albumina jest głównym białkiem występujący w osoczu krwi. Zawiera 583
aminokwasy, w tym 2 tryptofany i 20 tyrozyn. Jeden z tryptofanów znajduje się w otoczeniu silnie
hydrofobowym, drugi jest wyeksponowany do roztworu. Ponad 67% struktury drugorzędowej BSA to
α-helisy. Główną jej funkcją jest transport kwasów tłuszczowych i metabolitów. Rysunek Figure 5
przedstawia strukturę krystalograficzną ludzkiej albuminy, która przejawia 76% homologii z BSA.
Wymagania do kolokwium wstępnego
1. Zjawisko absorpcji i emisji promieniowania elektromagnetycznego.
2. Zasada pomiaru absorpcji i fluorescencji, widmo absorbcji, widma emisji i wzbudzenia
fluorescencji.
3. Budowa białek.
4. Oddziaływania stabilizujące strukturę przestrzenną białek.
5. Denaturacja białek.
6. Właściwości absorpcyjne i emisyjne aminokwasów (wolnych i w białkach), wpływ środowiska.
7. Försterowskie rezonansowe przeniesienie energii (FRET).
Przebieg ćwiczenia
Podczas ćwiczenia prześledzisz proces denaturacji albuminy z krwi wołu (BSA) pod wpływem
chlorowodorku guanidyny (GdnHCl). Wykonasz pomiary widm emisji fluorescencji BSA w funkcji
stężenia denaturanta dla dwóch różnych wartości fali wzbudzenia (280 i 295 nm) za pomocą
spektrofluorymetru Tau-3 (Horiba Jobin Yvon).
Masz do dyspozycji:
50 mM bufor Tris-HCl pH 7,2,
35 μM roztwór BSA w 50 mM buforze Tris-HCl pH 7,2,
6 M roztwór GdnHCl w 50 mM buforze Tris-HCl pH 7,2,
kwarcową kuwetę fluorescencyjną 0,4 x 1 cm.
1. Przygotuj roztwory GdnHCl w 50 mM buforze Tris-HCl pH 7,2 poprzez rozcieńczanie
stężonego roztworu chlorowodorku guanidyny (6 M) wg poniższego schematu:
1. M GdnHCl => 0,75 ml 6 M GdnHCl + 3,75 ml buforu
2. M GdnHCl => 1,5 ml 6 M GdnHCl + 3,0 ml buforu
3. M GdnHCl => 2,25 ml 6 M GdnHCl + 2,25 ml buforu
4. M GdnHCl => 3,0 ml 6 M GdnHCl + 1,5 ml buforu
5. M GdnHCl => 3,75 ml 6 M GdnHCl + 0,75 ml buforu
2. Przygotuj roztwory BSA w 50 mM buforze Tris-HCl pH 7,2 oraz w 50 mM buforze Tris-HCl pH
7,2 zawierającym różne stężenia GdnHCl (1, 2, 3 ,4, 5 i 6 M). Do 1,85 ml odpowiedniego buforu
dodaj po 150 μl stężonego BSA (35 μM) i wymieszaj. Pozostaw roztwory w temperaturze
pokojowej na około dwie godziny. Ile wynosi stężenie BSA po rozcieńczeniu?
3. Kuwetę fluorescencyjną napełnij 1,4 ml 50 mM buforu Tris-HCl pH 7,2. Zarejestruj widma
emisji fluorescencji dla wzbudzenia 280 i 295 nm w zakresie odpowiednio 285-500 i 300-500
nm. Szerokości spektralne szczeliny wzbudzającej i emisyjnej ustaw równe 4 nm, a czas
integracji 0,5 s/nm. Widma zarejestruj w modzie s/r (w ten sposób niwelujesz fluktuacje
natężenia lampy w czasie oraz różnice w intensywności świecenia lampy w różnych
długościach fali). W analogiczny sposób przeprowadź pomiary dla roztworów GdnHCl. W ten
sposób uzyskasz widma emisyjne tła.
4. Przeprowadź analogiczne pomiary dla roztworów BSA.
Opis końcowy
Opis końcowy powinien zawierać poszczególne elementy charakterystyczne dla raportu z przebiegu
eksperymentu (streszczenie, wstęp teoretyczny, opis układu doświadczalnego oraz wyniki i ich
dyskusję).
Wyniki należy opracować korzystając z programu ORIGIN lub PRISM (dostępne na komputerach w
Pracowniach Komputerowych w Zakładzie Biofizyki i w sali 112 w budynku dydaktycznym przy ul.
Pasteura 7) i udokumentować za pomocą czytelnych tabel i wykresów.
Opracowanie wyników powinno uwzględniać następujące zagadnienia:
1. Analizę i interpretację zależności widm emisji fluorescencji albuminy od stężenia
chlorowodorku guanidyny.
2. Wyznaczenie zależności położenia maksimum widma emisji BSA od stężenia GdnHCl.
3. Wyznaczenie zależności natężenia fluorescencji BSA w 300 i 350 nm (dla wzbudzenia w 280
nm) oraz w 305 i 350 nm (dla wzbudzenia w 295 nm) od stężenia GdnHCl.
Przy opracowywaniu danych pamiętaj o odjęciu tła pochodzącego od rozpuszczalnika.
Literatura
1.
2.
3.
4.
„Biofizyka. Wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami”, red. Z. Jóźwiak i G. Bartosz, PWN 2007
„Biochemia”, J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer, PWN 2009
„Podstawy spektroskopii molekularnej”, Z. Kęcki, PWN 1998
„Principles of fluorescence spectroscopy” J.R. Lakowicz