Laboratorium nr 10 - Wydział Chemii UJ

Oznaczanie metodą MS mieszaniny
pestycydów pozyskanych z materiału
roślinnego
Prowadzący: Dr Paweł Miśkowiec
Miejsce wykonywania ćwiczenia:
Ul. Gronostajowa 3 (III Kampus UJ), pok. 032, 033.
© Paweł Miśkowiec, ZCHŚ UJ
Wstęp
Spektrometria mas (MS) jest techniką analityczną, której zadaniem jest pomiar stosunku
masy do ładunku elektrycznego danego jonu. Zastosowanie spektrometrii mas ze względu na
jej uniwersalność oraz duŜy zakres analizowanych mas jest bardzo szerokie, od ochrony
środowiska, poprzez analizę składu, chemię sądową aŜ do szeroko pojętych badań
biologicznych, biochemicznych i medycznych.
Pierwszy spektrometr mas został zbudowany przez Josepha Johna Thompsona1 w 1911 roku.
Współcześnie istnieje szereg odmian tej techniki, z których kaŜda posiada inne zastosowanie
i wymaga stosowania spektrometrów o innej konstrukcji.
Podstawy metody i aparatura
Działanie tradycyjnego spektrometru mas opiera się na zjawisku rozdziału strumienia jonów
badanej substancji w polu elektrycznym lub/i magnetycznym. Strumień ten moŜe być
odchylany pod róŜnym kątem, bądź przyspieszany z przyspieszeniem zaleŜnym od stosunku
masy do ładunku. Wszystkie cząsteczki analizowane w spektrometrze mas muszą mieć zatem
ładunek elektryczny. Wewnątrz spektrometru mas panuje wysoka próŜnia, dzięki czemu ruch
jonów nie jest zakłócany przez zderzenia z cząsteczkami gazów.
Typowy spektrometr mas składa się z następujących części: układ wprowadzania próbki,
źródło jonów, analizator jonów, detektor oraz rejestrator danych.
NajwaŜniejszymi i decydującymi o parametrach (oraz cenie) spektrometru częściami są
jonizator oraz analizator.
Podział najpopularniejszych metod jonizacji próbki:
• jonizacja elektronami (EI),
• jonizacja chemiczna (CI),
• elektrorozpylanie (ESI),
• termorozpylanie (TE),
• bombardowanie szybkimi atomami (FAB),
• jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie (ICP),
• jonizacja/desorpcja laserowa wspomagana matrycą (MALDI).
Najczęściej wykorzystywanymi analizatorami z kolei są:
• analizator kwadrupolowy (Q),
• pułapka jonowa (IT),
• analizator czasu przelotu (TOF),
• sektor magnetyczny (B),
• Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (ICR),
• Orbitrap.
Detektorami w metodzie MS są:
• powielacz elektronowy,
• detektor mikrokanalikowy,
• fotopowielacz.
1
W 1906 r. J. J. Thompson otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki „w uznaniu zasług za teoretyczne
i eksperymentalne badania nad przewodnictwem elektrycznym gazów”, które doprowadziły do odkrycia elektronu
2
© Paweł Miśkowiec, ZCHŚ UJ
Zasada działania jonizatora typu elektrorozpylanie:
W powyŜszej metodzie jonizacji, próbka w stanie ciekłym rozpylana jest pod ciśnieniem
atmosferycznym w komorze nebulizującej. Jednocześnie pomiędzy igłą nebulizera, a wlotem
do spektrometru przyłoŜone jest napięcie rzędu 4kV. Dzięki temu na formujących się
kroplach ładunek elektryczny ulega uporządkowaniu. Jednocześnie pod wpływem gazu
osuszającego, którym najczęściej jest azot, rozpuszczalnik paruje z naładowanej kropli, aŜ do
osiągnięcia momentu, gdy siły napięcia powierzchniowego zostaną zrównowaŜone przez siły
odpychania kulombowskiego. W tym momencie kropla ulega tzw. eksplozji kulombowskiej,
która doprowadza do utworzenia wielu mniejszych, bardziej stabilnych kropelek. Nowe
kropelki ulegają dalszej desolwatacji i kolejnym eksplozjom kulombowskim.
Kolejny etap zaleŜy od natury analitu. Generalnie wyróŜniamy tu dwa warianty:
a) wariant „desorpcja jonu z kropli do fazy gazowej” w wyniku działania pola
elektrycznego,
b) wariant „odparowanie rozpuszczalnika do sucha” (mechanizm ten dotyczy duŜych,
polarnych cząsteczek).
Zasada działania pułapki jonowej:
Pułapka jonowa jest analizatorem działającym na podobnej zasadzie co jeden
z najpopularniejszych analizatorów – analizator kwadrupolowy. Pozwala jednak na
przetrzymywanie w jej wnętrzu jonów. Składa się ona z dwóch stoŜkowych pokryw, do
których przyłoŜone jest zmienne napięcie elektryczne oraz elektrody pierścieniowej do której
przyłoŜony jest zmienny prąd elektryczny o wysokiej częstości. Zmieniając parametry prądu
elektrycznego moŜna uwięzić w pułapce jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z)
lub jony o szerokim zakresie m/z. Wyrzucane jony trafiają bezpośrednio do detektora.
WaŜnym atutem pułapki jonowej jest moŜliwość izolacji jonów o określonym m/z. Wybrany
jon moŜe zostać poddany wówczas fragmentacji przez zderzenia z cząsteczkami helu. W ten
sposób pułapka jonowa moŜe zastąpić tandemowy spektrometr mas.
Rys. schemat pułapki jonowej (za zgodą Bruker Daltonics).
3
© Paweł Miśkowiec, ZCHŚ UJ
Pestycycdy jako przykłady niskocząsteczkowych związków aktywnych biologicznie
Pestycydy (łac. pestis – zaraza, pomór, caedo – zabijam) – ogół substancji pochodzenia
naturalnego lub uzyskanych na drodze syntezy, stosowanych do zwalczania niepoŜądanych
organizmów. UŜywane głównie w rolnictwie do ochrony roślin uprawnych, lasów,
zbiorników wodnych, ale równieŜ zwierząt, ludzi, czy produktów Ŝywnościowych, a takŜe do
niszczenia Ŝywych organizmów, uznanych za szkodliwe, w budynkach inwentarskich,
mieszkalnych, szpitalnych i magazynach.
Podział pestycydów w zaleŜności od kierunku zastosowania
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
Zoocydy - środki do zwalczania szkodników zwierzęcych:
1.
Insektycydy - środki owadobójcze (Karbaryl),
2.
Rodentycydy - środki gryzoniobójcze,
3.
Moluskocydy - środki mięczakobójcze,
4.
Nematocydy - środki nicieniobójcze,
5.
Larwicydy - środki larwobójcze,
6.
Aficydy - środki mszycobójcze,
7.
Akarycydy - środki roztoczobójcze,
8.
Owicydy - środki do niszczenia jaj owadów i roztoczy.
Fungicydy - środki grzybobójcze. (Nimrod, Topsin)
Herbicydy - środki chwastobójcze (Roundup).
Regulatory wzrostu - środki stymulujące lub hamujące procesy Ŝyciowe roślin:
Atraktanty - środki zwabiające.
Repelenty - środki odstraszające.
Podział pestycydów pod względem chemicznym
I.
II.
Pestycydy nieorganiczne – coraz rzadziej uŜywane:
1.
Insektycydy arsenowe: zieleń paryska Cu(CH3COO)2 .Cu3(AsO2)2, arsenian
ołowiu PbHAsO4,
2.
Insektycydy fluorkowe: kryolit Na3AlF6 , fluorek sodu NaF, fluorokrzemian
sodu Na2SiF6,
3.
Herbicydy nieorganiczne: amidosulfonian amonu H2NS(O2)ONH4, boraks
Na2B4O7, chloran sodu NaClO3 ,
4.
Fungicydy nieorganiczne: zasadowy chlorek miedzi(II) 3Cu(OH)2 .CuCl2
.H2O, ciecz bordoska 3Cu(OH)2 .CuSO4 .CaSO4 , siarka.
Pestycydy organiczne:
1.
Pestycydy chlororganiczne, np. HCH, DDT, metoksychlor,
2.
Pestycydy fosforoorganiczne, np. monokrotofos, chlorfenwinfos, fenitrotion,
3.
Karbaminiany, np. aminokarb, propoksur, karbaryl,
4.
Pochodne kwasu fenoksyoctowego, np. 2,4-D; 2,4-DB; 2,4,5-T,
5.
Benzoimidazole
6.
Pochodne triazynowe, np. symazyna, atrazyna, propazyna.
7.
Pochodne pirymidyny
SprzedaŜ poszczególnych rodzajów środków ochrony roślin w Polsce w 2012 roku
przedstawia tabela w załączniku do niniejszego ćwiczenia.
WaŜnymi ze względu na ochronę środowiska oraz zdrowia ludności jest przestrzeganie okresu
karencji i okresu prewencji.
4
© Paweł Miśkowiec, ZCHŚ UJ
Ćwiczenie
Oznaczanie pestycydów w owocach metodą spektrometrii mas
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest uzyskanie przez studenta umiejętności:
- zaplanowania oraz przeprowadzenia modelowania wypłukiwania pestycydów z materiału
roślinnego
- identyfikacji substancji czynnej danego środka ochrony roślin na bazie otrzymanych widm
masowych
- interpretacji uzyskanych wyników pod kątem róŜnic w wypłukiwaniu danych pestycydów
z materiału roślinnego.
Zakres materiału naukowego
- rodzaje pestycydów i ich wpływ na organizmy Ŝywe,
- okres karencji i okres prewencji pestycydów,
- pestycydy a łańcuch pokarmowy,
- zasada działania spektrometru mas z jonizacją typu elektrorozpylanie i analizatorem
w postaci pułapki jonowej,
- pojęcia: m/z, jon molekularny, jon pseudomolekularny, widmo masowe, chromatogram
masowy, rodzaje źródeł jonów, rodzaje analizatorów.
Literatura podstawowa
1. K. Małek, L. M. Proniewicz [red.] Wybrane metody spektroskopii i spektrometrii
molekularnej w analizie strukturalnej, Wyd. UJ, Kraków 2005, str. 185-204 3.
2. W. Szczepaniak Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 1996, str.
345-358, 376-383.
3. E. Szczepaniec-Cięciak [red] Chemia Środowiska cz. 2. Kraków 1999 str. 173-184.
4. Cygański A Metody spektroskopowe w chemii analitycznej Warszawa 2009str. 398-416..
5. E. Hoffmann Spektrometria mas, Warszawa 1998
Literatura uzupełniająca
1. M. Biziuk [red] Pestycydy - występowanie oznaczanie i unieszkodliwianie, ,
Wydawnictwo Naukowo – Techniczne, Warszawa 2001.
2. http://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/en/ Pesticide Properties DataBase - baza danych
większości pestycydów uŜywanych na Świecie.
3. L. RóŜański Przemiany pestycydów w organizmach Ŝywych i środowisku, wyd.
Agra-enviro Lab, Poznań 1998.
4. J.R. Dojlido - Chemia wód powierzchniowych, wyd. Ekonomia i Środowisko Białystok
1995 str 220-233.
5. http://www.minrol.gov.pl/pol/Informacje-branzowe/Produkcja-roslinna/Ochrona-roslin
strona internetowa Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi dotycząca m.in. dopuszczenia
środków ochrony roślin do obrotu w Polsce.
5
© Paweł Miśkowiec, ZCHŚ UJ
Przyrządy, materiały, odczynniki:
1. Spektrometr mas Bruker Amazon SL.
2. Próbka roslinna (owoc) spryskana przed ćwiczeniami mieszaniną analizowanych
fungicydów.
3. Woda dejonizowana, metanol.
4. Roztwory wodne pestycydów sporządzone wg instrukcji producenta.
Nimrod 25EC
Składnik czynny: Bupirymat
Topsin M 500 S.C.
Składnik czynny tiofanat metylowy
Score 250 EC
Składnik czynny difenokonazol
6
© Paweł Miśkowiec, ZCHŚ UJ
Wykonanie ćwiczenia:
1. Przygotowanie spektrometru do pracy poprzez nastrzyk metanolu.
2. Ustalenie i omówienie parametrów pomiarowych dla mieszaniny pestycydów,
będących przykładem niskocząsteczkowych związków chemicznych.
3. Przygotowanie preparatu roślinnego (owocu), oraz procedury modelowania
wypłukiwania pestycydu z próbki – ekstrakcja określoną ilością wody dejonizowanej
pestycydu z owocu przez z góry określony czas.
4. Przygotowanie mieszaniny woda z analitem: metanol w stosunku 50:50 (v/v) bez
dodatku oraz z dodatkiem donora protonów 1% HCOOH.
5. Bezpośredni nastrzyk tak przygotowanego roztworu do spektrometru mas.
6. Ponowna ekstrakcja pestycydów z owocu – przynajmniej dwukrotne powtórzenie
czynności z punktów 3 oraz 4.
7. Analiza jakościowa oraz quasi-ilościowa uzyskanych widm pod kątem róŜnic w
sposobie wypłukiwania obu pestycydów.
Opracowanie wyników
1. Porównanie róŜnic w intensywności sygnałów z dodatkiem i bez dodatku donora
protonów.
2. Interpretacja uzyskanych wyników poprzez analizę jakościową widm (sygnał od jonu
pseudomolekularnego oraz adduktów) pestycydów, jak równieŜ analizę quasiilościową względnej zmiany stęŜenia obu składników czynnych w kolejnych
ekstraktach.
3. Wyciągniecie wniosków odnośnie róŜnic w sposobie jonizacji składników czynnych
pestycydów z róŜnych grup (tworzenie adduktów) oraz róŜnic w sposobie ich
wypłukiwania z materiału roślinnego.
7
TABELA 1
SPRZEDAŻ I ZAPASY ŚRODKÓW OCHRONY ROŚLIN W POLSCE W ROKU 2012
/dane od producentów i importerów/
ETAP I - Agregacja według rodzajów środków ochrony roślin
Rodzaj środków
ochrony roślin
Kod
pozycji
Ogółem
Sprzedaż (bez eksportu)
Producenci
Importerzy
w kg
Zapas
Środki owadobójcze
I
4 247 356,55
190 276,59
4 057 079,96
364 232,67
Środki chwastobójcze
II
38 747 999,25
8 610 058,31
30 137 940,94
6 197 315,23
Regulatory wzrostu
III
2 841 960,40
1 090 956,83
1 751 003,57
870 838,56
Środki grzybobójcze
IV
14 474 090,39
2 517 101,13
11 956 989,26
3 413 135,06
Środki gryzoniobójcze
IV.a
85 595,80
24 000,00
61 595,80
23 340,20
Pozostałe
IV.b
1 407 706,99
551 230,39
856 476,60
124 067,40
61 804 709
12 983 623
48 821 086
10 992 929
Suma
TABELA 1
Strona 1 z 1