pobierz
Transkrypt
pobierz
Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 2, str. 225–234 PRACA ORYGINALNA – Original Article WŁODZIMIERZ ŁUCZYŃSKI1, ANNA STASIAK-BARMUTA2, JAROSŁAW PISZCZ3, ELśBIETA IŁENDO4, OKSANA KOWALCZUK5, MARYNA 1 KRAWCZUK-RYBAK , JANUSZ KŁOCZKO3, LECH CHYCZEWSKI4, ADAM PARFIEŃCZYK6, DOROTA HARASIUK5, BERNADETTA BLECHARCZYK7, MARZENNA GALAR3, ELIZA BLUSIEWICZ3 Reakcja allogenicznych limfocytów T na komórki dendrytyczne uzyskane z komórek przewlekłej białaczki limfocytowej Reaction of allogeneic T-cells in response to chronic lymphocytic leukemia-derived dendritic cells 1 Klinika Onkologii Dziecięcej Kierownik: Prof. dr hab. med. Maryna Krawczuk-Rybak 2 Pracownia Cytometrii Przepływowej Kierownik: Dr hab. med. Anna Stasiak-Barmuta 3 Klinika Hematologii Kierownik: Prof. dr hab. med. Janusz Kłoczko 4 Pracownia Cytogenetyki Zakładu Pediatrycznej Diagnostyki Laboratoryjnej Kierownik: Prof. dr hab. med. Jolanta Wysocka 5 Zakład Klinicznej Biologii Molekularnej Kierownik: Prof. dr hab. med. Lecz Chyczewski 6 Zakład Medycyny Nuklearnej Kierownik: Prof. dr hab. med. Franciszek Rogowski 7 Studenckie Koło Naukowe przy Klinice Onkologii Dziecięcej, A.M. w Białymstoku STRESZCZENIE Przewlekła białaczka limfocytowa (B-CLL) jest najczęstszą białaczką w populacji dorosłych. Z powodu przewlekłego przebiegu, braku efektywności konwencjonalnego leczenia oraz dostępności komórek nowotworowych we krwi obwodowej pacjentów, B-CLL stanowi idealny cel immunoterapii. Ostatnio czynione są próby przekształcenia komórek CLL w komórki dendrytyczne prezentujące antygeny białaczkowe limfocytom T gospodarza. Uzyskana w ten sposób szczepionka przeciwnowotworowa miałaby prowadzić do eliminacji nieprawidłowego klonu komórek i wyleczenia pacjenta. Celem niniejszej pracy była ocena odpowiedzi limfocytów T na komórki dendrytyczne uzyskane z komórek przewlekłej białaczki limfocytowej za pomocą stymulacji CD40L. Materiał stanowiło 25 pacjentów z B-CLL, komórki białaczkowe hodowano z obecnością lub bez CD40L i IL-4. Następnie z ten sposób uzyskane komórki wprowadzano do mieszanej reakcji z allogenicznymi limfocytami T zdrowego dawcy. Ekspresję cząsteczek kostymulujących i adhezyjnych na powierzchni komórek nowotworowych oraz elementów świadczących o aktywacji limfocytów T przed i po hodowli oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Wyniki: 1) potwierdzono moŜliwość nabywania fenotypu komórek dendrytycznych przez komórki CLL po stymulacji CD40L/IL-4 2) limfocyty T hodowane z komórkami dendry- 226 W. ŁUCZYŃSKI i wsp. tycznymi uzyskanymi z komórek białaczkowych wykazywały cechy aktywacji. Uzyskane wyniki świadczą o celowości prowadzenia dalszych w tym klinicznych badań nad szczepionką przeciwbiałaczkową opartą o system stymulacji CD40L. SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka limfocytowa – Immunoterapia – Komórki dendrytyczne – Limfocyty T SUMMARY Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent leukemia in adult population. Because of chronic course, lack of effectiveness of conventional treatment and availability of neoplasmatic cells in the peripheral blood, CLL can be an ideal target for immunotherapy. Lately, turning CLL cells into dendritic cells presenting leukemic antigens to the host T-cells has been undengang tests. Anticancer vaccine prepared in this manner could lead to the elimination of neoplasmatic clone and complete cure of the patient. The aim of the present study was to assess the response of T-cells against CLL-derived dendritic cells (received with the use of CD40L and IL-4 stimulation). The material consisted of 25 patients with CLL, the leukemic cells were cultured with the presence or absence of CD40L and IL-4. Then leukemic cells were cultured with allogeneic T-cells obtained from the healthy donor. The expression of costimulatory and adhesion molecules on the surface of leukemic cells and activation molecules on T-cells before and after the culture was assessed with flow cytometry. Results: 1) we confirmed the ability of leukemic cells to differentiate into dendritic cells after CD40L/IL-4 stimulation 2) T-cells cultured with leukemia derived dendritic-cells showed the markers of activation. Our results testify that immunotherapeutic experiments and trials in cancer vaccines based on CD40L stimulation should continue to be performed. KEY WORDS: Chronic lymphocytic leukaemia – Lmmunotherapy – Dendritic cells – T-cells WSTĘP Przewlekła białaczka limfocytowa (B-CLL) jest najczęstszą białaczką w populacji dorosłych. Jej patogeneza polega na kumulacji limfocytów B o fenotypie CD5+CD19+ w szpiku i krwi obwodowej. Od kilku lat trwają badania dotyczące interakcji pomiędzy białaczkowymi komórkami B a limfocytami T u pacjentów z B-CLL. Wydaje się, Ŝe limfocyty T pacjentów z CLL, być moŜe w wyniku immunosupresyjnego działania komórek białaczkowych nie mogą rozpocząć, utrzymać i zakończyć odpowiedzi przeciwnowotworowej, a ich dysfunkcja moŜe być jednym z czynników patogenetycznych białaczki [1]. W większości limfocyty T pacjentów z B-CLL nie posiadają aktywności przeciwbiałaczkowej, spotanicznie pojawiające się komórki T skierowane przeciwko komórkom B-CLL są jedynie wykrywane we wczesnych stadiach choroby. Czynność komórek T u pacjentów z CLL ulega pogorszeniu w miarę rozwoju i progresji choroby [2]. W warunkach prawidłowych aktywacja limfocytów T wymaga obecności komórek prezentujących antygeny. Komórkami najsilniej stymulującymi prezentację antygenów są komórki dendrytyczne. Do aktywacji limfocytów T potrzebne są dwa sygnały: specyficzne rozpoznanie peptydów w kontekście HLA oraz – niezaleŜna od antygenu – kostymulacja. Komórki białaczkowe posiadają na swojej powierzchni antygeny HLA, ale wykazują słabą ekspresję cząsteczek biorących udział w kostymulacji [3]. Rekonstrukcja funkcji kostymulującej oraz aktywacja limfocytów T gospodarza przeciwko Reakcja alogenicznych limfocytów T 227 komórkom białaczkowym mogłaby być efektywnym narzędziem terapeutycznym w eliminacji klonu nowotworowego. Do najwaŜniejszych cząsteczek kostymulujących naleŜy rodzina B-7 (CD80, CD86) ulegająca ekspresji na komórkach prezentujących antygeny. Natomiast cząsteczki CD28 i CD152 (CTLA-4) na limfocytach T funkcjonują jako receptory dla cząsteczek rodziny B-7. Na limfocytach T pacjentów z B-CLL obserwuje się zmniejszenie ekspresji cząsteczek aktywacyjnych CD28 oraz wzrost ekspresji CD152 – odgrywającej rolę hamującą w odpowiedzi immunologicznej – zmiany te mogą odpowiadać za brak odpowiedzi przeciwbiałaczkowej w tej jednostce chorobowej [4]. Wg innych autorów limfocyty T krwi obwodowej pacjentów ze złośliwymi chorobami hematologicznymi (w tym CLL) wykazują wzrost wskaźników aktywacji w tym: CD69, HLA-DR, CD71, CD57 oraz zmniejszenie ekspresji CD62L i CD28 (co równieŜ moŜe być interpretowane jako aktywacja limfocytów T) [5]. Natomiast obserwuje się dominację limfocytów bez cech aktywacji o profilu immunosupresyjnym Th2 [6]. Z punktu widzenia klinicznego do waŜnych cząsteczek ulegających ekspresji na limfocytach T naleŜą: CD25, CD69, CD71, CD95 (Fas), HLA-DR, CD45RA, CD45RO [7]. Z powodu przewlekłego przebiegu, braku efektywności konwencjonalnego leczenia oraz dostępności komórek nowotworowych we krwi obwodowej pacjentów, B-CLL stanowi idealny cel immunoterapii. Ostatnio próbuje się przekształcić komórki CLL w komórki dendrytyczne prezentujące antygeny białaczkowe limfocytom T gospodarza. Uzyskana w ten sposób szczepionka przeciwnowotworowa miałaby prowadzić do eliminacji nieprawidłowego klonu komórek i wyleczenia pacjenta. Najbardziej zaawansowane prace badawcze i kliniczne dotyczą uŜycia do tego celu substancji CD40L – uznanego stymulatora dojrzewania, proliferacji i prezentacji antygenów przez prawidłowe limfocyty B [8]. Celem niniejszej pracy była ocena odpowiedzi limfocytów T na komórki dendrytyczne uzyskane z komórek przewlekłej białaczki limfocytowej za pomocą stymulacji CD40L. MATERIAŁ I METODY Materiał badawczy stanowiła krew obwodowa 25 pacjentów z rozpoznaną przewlekłą białaczką limfocytową (B-CLL). Przed pobraniem krwi pacjenci nie otrzymywali Ŝadnego leczenia, średni wiek badanych wynosił 64.5 lat, większość stanowili męŜczyźni (14=56%), średnia leukocytoza krwi obwodowej wynosiła 108 tys/mm3. Limfocyty T wyizolowano od jednego zdrowego dawcy. Eksperyment został zaakceptowany przez Komisję Bioetyczną Akademii Medycznej w Białymstoku, w kaŜdym przypadku uzyskano świadomą zgodę pacjenta na pobranie krwi do badań. Z krwi obwodowej pacjentów separowano komórki jednojądrzaste, następnie zamraŜano je powoli do temperatury –800C. Po odmroŜeniu, komórki CLL były hodowane w stęŜeniu 1×105/ml przez 96 godzin w medium w temperaturze 370C, w atmosferze 5% CO2. Do hodowli dodawano (lub nie) mieszaniny CD40L (3µg/ml, Amgen, USA) i IL-4 (80 ng/ml, Sigma-Aldrich, USA). Przed i po hodowli pobierano część 228 W. ŁUCZYŃSKI i wsp. komórek na badania w cytometrze przepływowym. Po hodowli z lub bez CD40L/IL-4 komórki CLL naświetlano dawką 30 Gy i umieszczano w mieszanej reakcji z allogenicznymi limfocytami T zdrowego dawcy w stosunku 1:3. Limfocyty T hodowano z: komórkami CLL zmienionymi za pomocą CD40L/IL-4 (komórki dendrytyczne uzyskane z komórek CLL), niezmienionymi komórkami CLL oraz konkawaliną A (jako kontrolnym stymulatorem). Mieszaną hodowlę limfocytów T prowadzono przez 96 godzin, następnie pobierano komórki na badania w cytometrze przepływowym. Ocenę ekspresji antygenów powierzchniowych na komórkach wykonywano za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki B-CLL były analizowane przed i po hodowli z uŜyciem następujących przeciwciał: CD1a, CD11c, CD23, CD40, CD42a, CD54, CD58, CD80, CD83, CD86, CD137, CD137L, CD209, HLA klasy I, HLA-DR. CD5, CD19 i CD23 są uwaŜane za markery CLL, ich ekspresja potwierdza białaczkowe pochodzenie komórek dendrytycznych uzyskanych po stymulacji CD40L/IL-4. Pozostałe antygeny to cząsteczki kostymulujące, adhezyjne, aktywacyjne oraz markery komórek dendrytycznych. Limfocyty T były oceniane przed i po mieszanej hodowli z uŜyciem następujących przeciwciał: CD25, CD28, CD62L, CD69, CD71, CD45RA, CD45RO, CD95, CD134, CD137, CD152, CD154, HLA-DR. Wymienione cząsteczki są wskaźnikami aktywacji komórek T. ANALIZA STATYSTYCZNA: Uzyskane dane wprowadzano do programu Statistica 6.0 dla Windows. Rozkład wyników nie był normalny, w związku z czym stosowano nieparametryczne testy statystyczne do analizy danych. UŜyto testów Wilcoxona dla prób zaleŜnych i Manna-Whitneya dla prób niezaleŜnych. P < 0.05 uznano za statystycznie istotne. WYNIKI 1) komórki B-CLL nabierają cech fenotypowych komórek dendrytycznych Przed i po hodowli komórki CD5+CD19+CD23+ stanowiły >90% co potwierdza ich nowotworowe pochodzenie. Po hodowli z CD40L/IL-4 obserwowano wzrost odsetka komórek B-CLL z ekspresją najwaŜniejszych cząsteczek kostymulujących i adhezyjnych. Po hodowli z medium równieŜ zanotowano wzrost odsetka niektórych populacji komórek, jednak nie był on tak znaczny jak po stymulacji CD40L/IL-4 – odsetek komórek B-CLL z ekspresją CD11c, CD54, CD80, CD86, CD123 wynosił odpowiednio (podano wartości średnie): przed hodowlą 0.25%, 6.63%, 0.18%, 9.37%, 0.22%, po hodowli z CD40L/IL-4: 2.36%, 49.76%, 6.42%, 33.87%, 2.48%. RóŜnice te były istotne statystycznie zarówno w odniesieniu do danych sprzed hodowli, jak i po hodowli z samym medium. 2) komórki dendrytyczne uzyskane z komórek B-CLL stymulują aktywację limfocytów T Dane uzyskane z cytometrii przepływowej dotyczące limfocytów T przedstawione są w tabeli 1. W rozdziale tym omówiono wyłącznie róŜnice istotne statystycznie pomiędzy ocenianymi subpopulacjami limfocytów T. Reakcja alogenicznych limfocytów T 229 Tabela 1. Subpopulacje limfocytów T przed i po mieszanej hodowli z komórkami dendrytycznymi uzyskanymi z komórek przewlekłej białaczki limfocytowej Table 1. T-cell subpopulations before and after mixed culture with chroniclymphocytic leukemia-derived dendritic cells Grupa badana Subpopulacja limfocytów T przed hodowlą CD4+CD25+ CD4+CD69+ (1) 11.55 4.98 po hodowli z komórkami B-CLL-DC (2) 11.14 18.92 po hodowli z komórkami B-CLL (3) 8.83 18.14 po hodowli z konkawaliną A (4) 20.11 19.82 CD4+CD45RA+ 58.10 46.64 53.71 45.88 CD4+CD45RO+ 29.20 24.11 12.21 19.12 CD4+CD28+ CD4+CD152+ CD4+CD134+ 57.70 2.61 3.65 44.21 2.59 33.71 51.42 4.38 16.50 49.35 4.40 32.17 CD4+CD62L+ CD4+CD95+ 28.25 5.22 33.08 21.35 34.15 13.37 40.82 25.58 CD4+CD154+ 1.63 11.72 11.77 23.35 CD4+CD71+ CD4+HLA-DR+ 4.13 5.43 7.72 19.85 6.25 10.57 12.09 23.76 CD8+CD69+ 3.94 20.07 15.92 23.64 CD8+CD45RA+ CD8+CD45RO+ 40.90 35.40 41.15 14.16 44.07 17.42 50.23 17.07 CD8+CD28+ 22.05 37.15 40.14 43.35 Statystyka 1 vs 4 p=0.01 1 vs 2 p=0.007, 1 vs 3 p=0.01, 1 vs 4 p=0.001 1 vs 2 p=0.01, 1 vs 3 p=0.01, 1 v 4 p=0.01 1 vs 3 p=0.02, 1 vs 4 p=0.03, 2 vs 4 p=0.03 2 vs 3 p=0.04 (–) (–) 1 vs 2 p=0.0005, 1 vs 3 p=0.01, 1 vs 4 p=0.0001, 2 vs 3 p=0.02, 3 vs 4 p=0.01 1 vs 4 p=0.01 1 vs 2 p=0.003, 1 vs 3 p=0.04, 1 vs 4 p=0.0001 1 vs 2 p=0.01, 1 vs 3 p=0.01, 1 vs 4 p=0.0006 1 vs 4 p=0.01 1 vs 2 p=0.0005, 1 vs 3 p=0.02, 1 vs 4 p=0.0001, 2 vs 3 p=0.02, 2vs 4 p=0.04, 3 vs 4 p=0.003 1 vs 2 p=0.001, 1 vs 3 p=0.0005, 1 vs 4 p=0.003 2 vs 4 p=0.03 1 vs 2 p=0.04, 1 vs 3 p=0.006 1 vs 2 p=0.02, 1 vs 3 p=0.005, 230 W. ŁUCZYŃSKI i wsp. CD8+CD152+ 1.49 4.56 6.62 2.47 CD8+CD134+ 5.29 22.83 15.30 28.52 CD8+CD137+ 0.16 3.28 2.51 7.62 CD8+CD62L+ CD8+CD95+ 30.74 3.74 24.73 17.18 25.45 17.21 29.13 14.82 CD8+CD154+ 1.18 5.96 9.12 15.11 CD8+CD71+ 0.85 5.72 5.45 7.74 CD8+HLA-DR+ 8.28 15.96 11.42 19.92 1 vs 4 p=0.0001, 2 vs 4 p0.02 1 vs 2 p=0.02, 1 vs 3 p=0.04, 1 vs 4 p=0.01, 3 vs 4 p=0.03 1 vs 2 p=0.001, 1 vs 3 p=0.0008, 1 vs 4 p=0.01, 2 vs 3 p=0.04, 3 vs 4 p=0.04, 1 vs 2 p=0.01, 1 vs 3 p=0.04, 1 vs 4 p=0.002 (–) 1 vs 2 p=0.01, 1 vs 3 p=0.002, 1 vs 4 p=0.0005 1 vs 2 p=0.02, 1 vs 3 p=0.02, 1 vs 4 p=0.0001 1 vs 2 p=0.02, 1 vs 3 p=0.01, 1 vs 4 p=0.002 1 vs 2 p=0.009, 1 vs 4 p=0.01 2 vs 3 p=0.04, 3 vs 4 p=0.02 Po hodowli limfocytów T z kontrolnym stymulatorem tj. konkawaliną A zanotowano wzrost następujących subpopulacji limfocytów T pomocniczych: CD4+CD25+, CD4+CD69+, CD4+CD134+, CD4+CD62L+, CD4+CD95+, CD4+CD154+, CD4+CD71+, CD4+HLA-DR+ oraz limfocytów T cytotoksyczno-supresorowych: CD8+CD69+, CD8+CD28+, CD8+CD134+, CD8+CD137+, CD8+CD95+, CD8+CD154+, CD8+CD71+, CD8+HLA-DR+. Wyniki te świadczą o silnej stymulacji limfocytów T konkawaliną A, potwierdzają poprawność wykonanego eksperymentu oraz stanowią odniesienie do hodowli ze zmienionymi lub niezmienionymi komórkami białaczkowymi. Po hodowli limfocytów T z komórkami białaczkowymi (zarówno stymulowanymi CD40L/IL-4 jak i bez stymulacji) tj. w porównaniu do oceny przed hodowlą obserwowano wzrost subpopulacji limfocytów: CD4+CD69+, CD4+CD45RA+, CD4+CD95+, CD4+CD154+, CD8+CD69+, CD8+CD28+, CD8+CD152+, CD8+CD137+, CD8+CD95+, CD8+CD154+, CD8+CD71+. Wyniki te wskazują na stymulację limfocytów T przez komórki białaczkowe w mieszanej hodowli. Jednak w zakresie w/w subpoplacji nie zanotowano róŜnic istotnych statystycznie pomiędzy limfocytami T stymulowanymi komórkami dendrytycznymi uzyskanymi z komórek białaczkowych i niezmienionymi komórkami białaczkowymi. Obserwowano natomiast wyŜszy odsetek subpopulacji CD4+CD134+, CD4+HLA-DR+, CD8+CD134+, CD8+HLA-DR+ w grupie limfocytów T Reakcja alogenicznych limfocytów T 231 hodowanych z komórkami dendrytycznymi w porównaniu do limfocytów T hodowanych z niezmienionymi komórkami białaczkowymi. Wyniki te świadczą o silniejszej stymulacji limfocytów T przez zmienione komórki białaczkowe. OMÓWIENIE WYNIKÓW W naszym doświadczeniu potwierdziliśmy moŜliwość nabycia przez komórki CLL cech fenotypowych komórek dendrytycznych – wskazuje na to istotny wzrost ekspresji cząsteczek kostymulujących i adhezyjnych na ich powierzchni po hodowli z CD40L/IL-4. Jeśli limfocyty T mają być uŜyte jako broń przeciwko tak zmienionym komórkom białaczkowym powinny mieć własności krąŜenia, migracji przez endotelium, dostawania się do szpiku kostnego, ale przede wszystkim do lizy komórek nowotworowych – stąd konieczna jest ocena ich funkcji. Mimo istnienia wielu badań, dotychczasowe dane dotyczące odpowiedzi limfocytów T na komórki dendrytyczne uzyskane z komórek białaczkowych są rozbieŜne. Z jednej strony analizuje się profil cytokin produkowanych przez stymulowane limfocyty T (Th1/Th2), z drugiej – ekspresję cząsteczek aktywacyjnych na ich powierzchni. Ocena profilu wydzielanych cytokin przez komórki T będzie przedmiotem następnej naszej pracy, w tym miejscu naleŜy jedynie przytoczyć kilka opinii innych autorów. Wg Mohty i wsp. limfocyty T te prezentują profil cytokinowy typu 1 (produkcja IFN-γ, a nie IL-4 i IL-10) [9]. MoŜe to mieć pozytywny efekt w przyszłej immunoterapii, gdyŜ właśnie limfocyty Th1 uwaŜa się za znaczące w odpowiedzi przeciwnowotworowej. W eksperymencie badano jednak tylko reakcję limfocytów T CD4+CD45RA+ tzw. naiwnych. Podobnie, stymulacja komórkami dendrytycznymi uzyskanymi z blastów ostrej białaczki szpikowej (za pomocą CD40L) powodowała aktywację profilu Th1 a nie Th2, natomiast proliferacja dotyczyła zarówno subpopulacji limfocytów CD4+ jak i CD8+ [10]. Odpowiedź na pytanie, która subpopulacja limfocytów T odgrywa główną rolę w reakcji przeciwbiałaczkowej do dziś nie jest poznana. Badania Buhmann i wsp. w podobnych do naszych eksperymentach, do reakcji z komórkami dendrytycznymi uzyskanymi z komórek białaczkowych uŜywali zarówno limfocytów T autologicznych jak i allogenicznych [11]. Stwierdzili, Ŝe w reakcji autologicznej, komórkami odpowiedzialnymi za odpowiedź przeciwbiałaczkową były limfocyty CD4+, zaś w allogenicznej – CD8+. Wyniki te potwierdzają tezę, Ŝe anergia limfocytów T u pacjentów z B-CLL moŜe zostać odwrócona, jednak charakter odpowiedzi zaleŜy od klasy antygenów HLA w kontekście których prezentowane są antygeny nowotworowe. Z kolei w innym badaniu, w celu eliminacji reakcji allogenicznej klonów CD4+ niezgodnych w układzie HLA II klasy, badano wyłącznie reakcję limfocytów cytotoksycznych CD8+, limfocyty te wykazywały wzrost proliferacji po stymulacji komórkami B-CLL aktywowanymi CD40L [12]. Nasze wyniki wskazują na silną aktywację limfocytów hodowanych w mieszanej reakcji z komórkami białaczkowymi zarówno zmienionymi jak i niezmienionymi (patrz Tabela 1). Jednak istotne róŜnice pomiędzy tymi dwiema grupa komórek w stymulacji limfocytów T zanotowano wyłącznie w zakresie subpopulacji HLA-DR+ 232 W. ŁUCZYŃSKI i wsp. i OX40+, zarówno w zakresie komórek CD4+ jak i CD8+. Cząsteczki HLA-DR i OX40 są istotnymi wskaźnikami aktywacji limfocytów T. OX40(CD134) i 4-1BB(CD137) naleŜą do rodziny receptora TNF i reprezentują najwaŜniejsze receptory kostymulujące ulegające ekspresji na aktywowanych limfocytach T [13]. Cząsteczka 4-1BB posiada szybszą i trwalszą kinetykę ekspresji na limfocytach T CD8+ niŜ OX40 [14]. Stymulacja OX40-OX40L prowadzi do generacji limfocytów T pomocniczych pamięci (CD4+). W jednym z doświadczeń do komórek B-CLL wprowadzono geny CD40L oraz OX40L [15]. Limfocyty T reagujące na zmienione w ten sposób komórki białaczkowe były mieszaniną komórek CD4+ i CD8+, z przewagą CD4+, więcej było komórek CD45RO+, nie zmieniała się równieŜ ekspresja CD62L oraz CCR7 – podobnie jak w naszych badaniach. Podobnie równieŜ jak w naszym eksperymencie wzrastała ekspresja OX40 na limfocytach T CD4+, nie wykryto jej jednak na limfocytach CD8+. Wg autorów opracowania to właśnie komórki CD45RO mogą być efektorowymi komórkami przeciwbiałaczkowymi. Podobną aktywację limfocytów T z koekspresją CD134 i CD25 zarówno na limfocytach CD4+ jak i CD8+ obserwowano w przewlekłej chorobie przeszczep-przeciwko-gospodarzowi po allogenicznej transplantacji komórek hematopoetycznych [16, 17]. W ocenie immunohistochemicznej limfocyty T naciekające guzy jajnika w większości charakteryzowały się ekspresją cząsteczek HLA-DR [18]. Być moŜe aktywacja limfocytów T poprzez wzrost ekspresji OX40 i HLA-DR będzie prowadziła do przełamania tolerancji komórek białaczkowych i ich eliminacji przez układ immunologiczny pacjenta. Nie wszystkie dane dotyczące zastosowania szczepionki przeciwko B-CLL opartej na CD40L są zachęcające, np. Biagi i wsp. obserwowali tylko przejściową odpowiedź limfocytów T gospodarza na szczepionkę [19]. Okazało się, Ŝe dochodziło do wzrostu odsetka limfocytów T regulatorowych o profilu CD4+/CD25+/Lag-3+/FoxP-3+, które najprawdopodobniej hamowały odpowiedź przeciwciałaczkową. Autorzy tego opracowania sugerują usunięcie tej subpopulacji limfocytów in vivo, co miałoby poprawić odpowiedź na szczepionkę. W naszym badaniu nie obserwowaliśmy wzrostu subpopulacji limfocytów CD4+CD25+, jednak były to warunki in vitro i czas hodowli był krótki (4 dni). Zdaniem niektórych autorów immunosupresja w białaczkach jest zbyt głęboka by szczepionka mogła zadziałać – tym niemniej badania prowadzące to takich wniosków były przeprowadzone po intensywnej chemioterapii, która w CLL praktycznie nie jest stosowana [20]. Z punktu widzenia metodologicznego istotny jest równieŜ sposób zwiększenia immunogenności komórek B-CLL: wg niektórych autorów transdukcja CD40L za pomocą wektorów wirusowych jest skuteczniejsza niŜ stymulacja za pomocą CD40L zastosowana w naszym doświadczeniu [21]. Zakładając, Ŝe to komórki białaczkowe wywołują anergię limfocytów T pacjentów z B-CLL moŜna podjąć próbę nieco innego rozwiązania problemu braku odpowiedzi przeciwnowotworowej, jak to dokonał Romano i wsp., tj. wyseparować limfocyty T z krwi obwodowej chorych, a następnie zaktywować je in vitro za pomocą standardowych stymulatorów PMA i ionomycyny [22]. Po takiej stymulacji komórki T wykazywały ekspresję cząsteczek aktywacyjnych CD69 i CD40L. W ten sposób uzyskane limfocyty T hodowane z autologicznymi komórkami B-CLL powodowały wzrost eks- Reakcja alogenicznych limfocytów T 233 presji cząsteczek kostymulujących na powierzchni komórek białaczkowych, pobudzenie prezentacji antygenów przez nie oraz wzbudzenie w nich procesów apoptozy. W jednym z pierwszych badań klinicznych z uŜyciem szczepionki przeciwbiałaczkowej opartej na komórkach nowotworowych z ekspresją CD40L i IL-2 wykazano jej wysokie bezpieczeństwo oraz skuteczność: wśród 10 pacjentów z ostrymi białaczkami 8 pozostaje w remisji z okresem obserwacji od 27 do 62 miesięcy [23]. W krwi pacjentów szczepionych odnotowano reakcję zarówno ze strony odpowiedzi komórkowej (profil limfocytów Th1 i Th2) oraz humoralnej (przeciwciała przeciwbiałaczkowe). Limfocyty T wykazywały aktywację w tym wzrost ekspresji HLA-DR, podobnie jak w naszym badaniu. Autorzy (podobnie jak my) nie obserwowali wzrostu liczby komórek immunoregulatorowych Treg o profilu CD4+CD25+. MoŜe to równieŜ wskazywać na korzystny efekt szczepionek opartych na stymulacji CD40L. Wydaje się, Ŝe immunoterapia oparta na szczepionkach na razie nie zastąpi konwencjonalnych metod leczenia nowotworów. Wg większości autorów, podobnie zresztą naszym zdaniem, ze szczepionek przeciwbiałaczkowych będą mogli skorzystać głównie pacjenci z chorobą mało zaawansowaną lub z tzw. chorobą resztkową po transplantacji komórek hematopoetycznych. Być moŜe terapia komórkowa oparta na limfocytach T będzie stosowana we wczesnych stadiach choroby, lub teŜ łączona z chemioterapią lub leczeniem przeciwciałami [24]. Podsumowując, wykazano aktywację limfocytów T w odpowiedzi na komórki dendrytyczne uzyskane z komórek przewlekłej białaczki szpikowej. Skuteczność uzyskanej w ten sposób szczepionki powinna być oceniona w próbach klinicznych. Praca dotowana przez grant KBN nr 2P05A 166 29 PIŚMIENNICTWO 1. Scrivener S, Goddard RV, Kaminski ER, Prentice AG: Abnormal T-cell function in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Leuk Lymphoma, 2003, 44: 383-389. 2. Scrivener S, Kaminski ER, Demaine A, Prentice AG: Analysis of the expression of critical activation/interaction markers on peripheral blood T cells in B-cell chronic lymphocytic leukaemia: evidence of immune dysregulation. Br J Haematol, 2001, 112: 959-964. 3. Luczynski W, Stasiak-Barmuta A, Ilendo E i wsp.: Low expression of costimulatory molecules and mRNA for cytokines are important mechanisms of immunosuppression in acute lymphoblastic leukemia in children ? Neoplasma, 2006, 53: 301-304. 4. Frydecka I, Kosmaczewska A, Bocko D i wsp.: Alterations of the expression of T-cell-related costimulatory CD28 and downregulatory CD152 (CTLA-4) molecules in patients with B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Br J Cancer, 2004, 90: 2042-2048. 5. Van den Hove LE, Vandenberghe P, Van Gool SW, i wsp.: Peripheral blood lymphocyte subset shift in patientswith untreated hematological tumors: evidence for systemic activation of the T cell compartment. Leuk Res, 1998, 22: 175-184. 6. Porakishvili N, Roschupkina T, Kalber T, i wsp.: Expansion of CD4+ T cells with a cytotoxic phenotype in patients with B-chronic lymphocytic leukaemia (B-CLL). Clin Exp Immunol, 2001, 126: 29-36. 7. Contreras JAV: Leucocyte activation markers in clinical practice. Clin Chem Lab Med, 1999, 607-622. 8. von Bergwelt-Baildon M, Maecker B, Schultze J, Gribben JG: CD40 activation: potential for specific immunotherapy in B-CLL. Ann Oncol, 2004, 15: 853-857. 234 W. ŁUCZYŃSKI i wsp. 9. Mohty M, Isnardon D, Charbonnier A, i wsp.: Generation of potent Th1 responses from patients with lymphoid malignancies after differentiation of B lymphocytes into dendritic-like cells. Int Immunol, 2002, 14: 741-750. 10. Cignetti A, Vallario A, Roato I, i wsp.: Leukemia-derived immature dendritic cells differentiate into functionally competent mature dendritic cells that efficiently stimulate T cell responses. J Immunol, 2004, 173: 2855-2865. 11. Buhmann R, Nolte A, Westhaus D, Emmerich B, Hallek M: CD40-activated B-cell chronic lymphocytic leukemia cells for tumor immunotherapy: stimulation of allogeneic versus autologous T cells generates different types of effector cells. Blood, 1999, 93: 1992-2002. 12. Hoogendoorn M, Wolbers JO, Smit WM, i wsp.: Generation of B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL)-reactive T-cell lines and clones from HLA class I-matched donors using modified B-CLL cells as stimulators: implications for adoptive immunotherapy. Leukemia, 2004, 18: 1278-1287. 13. Ma BY, Mikolajczak SA, Danesh A, i wsp.: The expression and the regulatory role of OX40 and 4-1BB heterodimer in activated human T cells. Blood, 2005, 106: 2002-2010. 14. Lee SW, Park Y, Song A, i wsp.: Functional dichotomy between OX40 and 4-1BB in modulating effector CD8 T cell responses. J Immunol, 2006, 177: 4464-4472. 15. Biagi E, Dotti G, Yvon E, i wsp.: Molecular transfer of CD40 and OX40 ligands to leukemic human B-cells induces expansion of autologous tumor-reactive cytotoxic T-lymphocytes. Blood, 2005, 105: 2436-2442. 16. Paz-Morante M, Briones J, Canto E, i wsp.: Activation-associated phenotype of CD3 T cells in acute graft-versus-host disease. Clin Ex Immunol, 2006, 145: 36-43. 17. Sanchez J, Casano J, Alvarez MA, i wsp.: Kinetic of regulatory CD25high and activated CD134+ (OX40) T lymphocytes during acute and chronic graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation. Br J Haematol, 2004, 126: 697-703. 18. Melichar B, Nash MA, Lenzi R, Platsoucas CD, Freedman RS: Expression of costimulatory molecules CD80 and CD86 and their receptors CD28, CTLA-4 on malignant ascites CD3+ tumourinfiltrating lymphocytes (TIL) from patients with ovarian and other types of peritoneal carcinomatosis. Clin Exp Immunol, 2000, 119: 19-27. 19. Biagi E, Rousseau R, Yvon E, i wsp.: Responses to human CD40 ligand/human interleukin-2 autologouscell vaccine in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia. Clin Cancer Res, 2005, 11 (19 Pt 1): 6916-6923. 20. Haining WN, Cardoso AA, Keczkemethy HL, i wsp.: Failure to define window of time for autologous tumor vaccination in patients with newly diagnosed or relapsed acute lymphoblastic leukemia. Exp Hematol, 2005, 33: 286-294. 21. Mayr C, Kofler DM, Buning H, i wsp.: Transduction of CLL cells by CD40 ligand enhances an antigen-specific immune recognition by autologous T cells. Blood, 2005, 106: 3223-3226. 22. Romano C, DeFanis U, Sellitto A, i wsp.: Effects of preactivated autologous T lymphocytes on CD80, CD86 and CD95 expression by chronic lymphocytic leukemia B cells. Leuk Lymphoma, 2003, 44: 1963-1971. 23. Rousseau RF, Biagi E, Dutour A, i wsp.: Immunotherapy of high-risk acute leukemia with a recipient (autologous) vaccine expressing transgenic human CD40L and IL-2 after chemotherapy and allogeneic stem cell transplantation. Blood, 2006, 107: 1332-1341. 24. Bruserud O, McCormack E, Gjertsen B: Immunotherapy in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother, 2006, 55: 185-187. Praca wpłynęła do Redakcji 27.12.2006 r. i została zakwalifikowana do druku 2.04.2007 r. Adres do korespondencji: Klinika Onkologii Dziecięcej ul. Waszyngtona 17, 15-274 Białystok