pobierz

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 1, str. 85–93
PRACA ORYGINALNA – Original Article
PATRYCJA ŁOPACZ1, AGNIESZKA WRÓBEL1, JADWIGA SAK-BUDZISZ1,
ELŻBIETA LACHERT2, KRYSTYNA MAŚLANKA1, EWA BROJER1
Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α
α i sCD40L w przechowywanych
koncentratach erytrocytarnych i płytkowych
Evaluation of the concentration of IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α
α and sCD40L cytokines
in stored erythrocyte and platelet concentrates
1
Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologiczej IHiT w Warszawie
Kierownik: Prof. dr hab.n.med. Ewa Brojer
2
Zakład Zapewnienia Jakości i Organizacji Służby Krwi IHiT w Warszawie
Kierownik: Dr Elżbieta Lachert
STRESZCZENIE
Głównym źródłem cytokin biorących udział w powstawaniu gorączkowych niehemolitycznych odczynów poprzetoczeniowych są leukocyty.
W obecnej pracy oceniono stężenia cytokin: IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i sCD40L w supernatantach otrzymanych
z przechowywanych: koncentratów krwinek czerwonych (KKCz), ubogoleukocytarnych koncentratów krwinek czerwonych (UKKCz), koncentratów krwinek płytkowych z aferezy (KKP-Af.), w świeżo mrożonym osoczu (FFP) oraz
w osoczu zdrowych osób (kontrola/norma). Cytokiny badano we wszystkich składnikach krwi: w dniu ich preparatyki (dzień 0), a następnie w KKCz i UKKCz – raz w tygodniu, aż do 42 dnia, a w KKP-Af. – każdego dnia, aż do 6
dnia ich przechowywania. KKCz i UKKCz przechowywano w temperaturze 4oC, a KKP w temperaturze 20–22oC.
W osoczu zdrowych osób, w dniu pobrania krwi, stwierdzono następujące stężenia badanych cytokin: sCD40L –
645,9 pg/ml, IL-8 – 9,1 pg/ml, a IL-1β – 1,0 pg/ml. W dniu preparatyki poszczególnych składników krwi stężenia
tych cytokin mieściły się w granicach normy. W ostatnim dniu ważności składników krwi, w porównaniu do stężenia
badanych cytokin w dniu pobrania krwi stwierdzono:
a) w KKCz – 10-krotny wzrost stężenia IL-1β (p=0,006), 2,5-krotny wzrost sCD40L (p=0,295) i prawie 3-krotny
wzrost IL-8 (p=0,002), b) w KKP-Af. - 5-krotny wzrost stężenia sCD40L (p=0,002) i 3-krotny wzrost IL-8
(p=0,002). W UKKCz i FFP stężenia IL-1β, IL-8 i sCD40L przez cały okres przechowywania były w granicach normy. U żadnej z osób zdrowych ani w żadnym z przechowywanych składników krwi nie wykryto IL-6 i TNFα, a dodatkowo w KKP-Af. nie wykrywano także IL-1β.
Podwyższone stężenia niektórych cytokin w długo przechowywanych składnikach krwi mogą być rozważane jako
potencjalna przyczyna niehemolitycznych odczynów poprzetoczeniowych.
SŁOWA KLUCZOWE: IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, sCD40L – Przechowywane składniki krwi
SUMMARY
Leukocytes are the main source of cytokines responsible for febrile non-haemolytic transfusion reactions.
The aim of our study was evaluation of the concentration of cytokines: IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α and sCD40L in
stored blood components.
Cytokines were measured in the supernatants from stored: packed red blood cells (RBCs), leucoreduced RBCs (LRBCs), apheresis platelet concentrates (PCs Aph.) and in fresh frozen plasma (FFP). Plasma samples from random
donors were used as a control. The samples from all the units were analysed on collection day (Day 0) and next in
RBCs and L-RBCs once a week until Day 42 and in PCs Aph. every day until Day 6. RBCs components were stored
at 4oC and platelet concentrates at 20-22oC.
On the day of collection the concentrations of cytokines in control donor plasma samples were as follows: sCD40L –
645.9 pg/ml, IL-8 – 9.1 pg/ml, a IL-1β – 1.0 pg/ml. On the Day 0 the concentrations of those cytokines in blood components were within the limits for control plasma. On the last day of storage the following concentrations were determined comparing to storage Day 0: a) for RBCs – a 10 fold higher concentration of IL-1β (p=0,006), a 2.5 fold
86
P. ŁOPACZ i wsp.
higher concentration of sCD40L (p=0,295), a 3 fold higher concentration of IL-8 (p=0,002), b) for PCsAph. – a 5 fold
higher concentration of sCD40L (p=0,002) and a 3 fold higher concentration of IL-8 (p=0,002). For stored L-RBCs
the IL-1β, IL-8 and sCD40L cytokine concentrations were within the limits for control plasma. No IL-6 and TNF-α
were found in any of donor samples and in any of stored blood components. Additionally, IL-1β in PCs Aph. was
also not found.
The higher concentrations of some cytokines in stored blood components may be considered a likely cause of nonhaemolytic transfusion reactions.
KEY WORDS: IL-1β – IL-6 – IL-8 – TNF-α – sCD40L – Stored blood components
WPROWADZENIE
Udział rozpuszczalnych bioaktywnych związków, takich jak cytokiny, w powstawaniu gorączkowych niehemolitycznych odczynów po przetoczeniu składników krwi jest dobrze znany [1, 2, 3, 4].
Głównym źródłem prozapalnych cytokin, między innymi interleukin (IL) IL-1α, IL-1β, IL-6, czynnika
martwicy nowotworu – TNF-α (ang. Tumor Necrosis Factor) są zaktywowane leukocyty, a zwłaszcza
monocyty. Cytokiny mogą być uwalniane zarówno przez leukocyty biorcy, jak i przez leukocyty dawcy
obecne w przetaczanej krwi. Świadczą o tym między innymi badania Shanwell i wsp. [5], którzy wykazali, że przechowywanie ubogoleukocytarnych składników krwi znacznie ogranicza ilość uwalnianych
cytokin.
W ostatnich latach problem obecności cytokin w przetaczanych składnikach krwi znalazł się w centrum zainteresowania w związku z badaniami dotyczącymi wyjaśnienia patogenezy TRALI (ang.
Transfusion Related Acute Lung Injury). Wykazano, że istotną rolę w patogenezie tego odczynu odgrywają nie tylko przeciwciała antyleukocytarne obecne w przetaczanej krwi lub w krążeniu chorego,
ale też bioaktywne lipidy i cytokiny [6]. Bardzo ważny jest stan kliniczny chorego, ponieważ zaobserwowano, że odczyny przebiegające z dusznością, w tym TRALI występują częściej u chorych w stanie
krytycznym [7].
Obecnie wiadomo, że w patogenezie TRALI, głównymi komórkami efektorowymi są neutrofile.
Stąd zainteresowanie badaczy nie tylko cytokinami prozapalnymi, ale także chemokinami takimi jak
IL-8, które ułatwiają przemieszczanie się neutrofili do śródbłonka naczyń włosowatych płuc [8]. Badania in vitro Sillimana i wsp. [9] wykazały pobudzenie neutrofili i ich aktywację, która prowadzi do produkcji reaktywnych form tlenu uszkadzających naczynia włosowate płuc, co w efekcie przecieku płynów ustrojowych może powodować obrzęk płuc – główny objaw kliniczny zespołu TRALI.
Przypuszcza się, że w patogenezie TRALI istotną rolę może odgrywać glikoproteina CD40 obecna
na powierzchni komórek śródbłonka, monocytów i makrofagów. Ligand dla tej glikoproteiny (CD40L),
pochodzący z płytek krwi, jest czynnikiem prozapalnym i znajduje się w przetaczanych składnikach
krwi w formie rozpuszczalnej (sCD40L) [10].
W piśmiennictwie spotyka się prace, które podają różne stężenia cytokin takich jak IL-1β, IL-6, IL8, TNF-α i sCD40L w przechowywanych składnikach krwi [11, 12, 13, 14, 15, 16]. Celem obecnej
pracy była analiza stężeń w/w cytokin w koncentratach krwinek czerwonych i płytkowych, otrzymanych i przechowywanych zgodnie z obowiązującymi w Polsce przepisami [17, 18].
MATERIAŁ
Badania stężenia cytokin przeprowadzono w następujących składnikach krwi:
a) 3 koncentratach krwinek czerwonych (KKCz) z kożuszkiem leukocytarno-płytkowym, otrzymanych
metodą manualną z pełnej krwi, pobranej do pojemnika z roztworem konserwującym CPDA-1,
b) 3 ubogoleukocytarnych koncentratach krwinek czerwonych (UKKCz), otrzymanych metodą automatyczną w systemie Atreus i przechowywanych w roztworze wzbogacającym SAGM,
c) 3 koncentratach krwinek płytkowych otrzymanych metodą aferezy (KKP-Af.) (Cobe Trima),
Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i sCD40L
87
d) 10 jednostkach świeżo mrożonego osocza (FFP – ang. fresh frozen plasma) uzyskanego po odwirowaniu krwi pełnej i usunięciu kożuszka leukocytarno-płytkowego,
e) w osoczu 21 zdrowych osób (badanie kontrolne/norma).
Badane składniki krwi pochodziły od zdrowych dawców krwi i były otrzymane zgodnie z obowiązującymi w Polsce procedurami [17, 18]. Liczba leukocytów i krwinek płytkowych w składnikach krwi
była oceniana w analizatorze hematologicznym Sysmex K-4500.
Wszystkie składniki krwi były badane w dniu pobrania krwi (dzień 0) i przez cały okres ich ważności. Próbki krwi z KKCZ i UKKCz badano co tydzień aż do 42 dnia, a KKP codziennie, aż do 6 dnia.
KKCz i UKKCz przechowywano w temperaturze 4oC, a KKP w temperaturze 20–22oC w inkubatorze
do przechowywania płytek z ciągłym mieszaniem.
METODY
Badania cytokin, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i sCD40L, wykonano w supernatantach otrzymanych
poprzez odwirowanie 2 ml danego składnika krwi przy 600 g przez 30 min.
Stężenia cytokin badano techniką ELISA przy użyciu gotowych zestawów firmowych (Bender
MedSystems GmbH, Wiedeń, Austria).
Ogólna zasada metody. Badania wykonywano na 96-dołkowej płytce plastikowej, opłaszczonej
przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko oznaczanej ludzkiej cytokinie. Po dodaniu
badanej próbki (lub standardu danej cytokiny), powstawał kompleks oznaczanej cytokiny z wiążącym
ją przeciwciałem monoklonalnym. Następnie dodawano kolejne przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko badanej cytokinie, sprzężone z biotyną. Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej dodawano streptawidynę sprzężoną z enzymem peroksydazą chrzanową – HRP (ang. horse radish
peroxidase), inkubowano 60 minut w temperaturze pokojowej i dodawano substrat dla HRP (TMB –
ang. tetramethyl-benzidine). Po 15-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej reakcję enzymatyczną zatrzymywano poprzez dodanie 1M kwasu fosforowego. Ekstynkcję próbki mierzono w spektrofotometrze przy długości fali 450 nm i referencyjnej 620 nm. Wyniki badań opracowywano przy użyciu
programu komputerowego GEN 5 (BioTek), który wykreślał krzywe standardowe na podstawie 7 rozcieńczeń standardów oznaczanej cytokiny. Stężenia cytokin w pg/ml odczytywano z wykreślonej krzywej.
OBLICZENIA STATYSTYCZNE
Dane wyrażono jako wartości średnie wyliczone z pomiarów dokonanych w 3 jednostkach KKCz,
UKKCz i KKP-Af. w poszczególnych dniach badania. Różnicę statystyczną pomiędzy stężeniami cytokin w dniu pobrania krwi i ostatnim dniem przechowywania danego składnika krwi oceniono obliczając
współczynnik regresji liniowej. Wartości p < 0,05 uznano za istotne statystycznie.
WYNIKI
Średnie stężenia poszczególnych cytokin w osoczu zdrowych osób (Tabela 1) przyjęto jako badanie
kontrolne/normę. Stanowiły one podstawę do porównania ze stężeniem cytokin w przechowywanych
składnikach krwi. W osoczu zdrowych osób najwyższe było stężenie sCD40L – 645,9 pg/ml. Średnie
stężenie IL-8 wynosiło 9,1 pg/ml, a IL-1β – 1,0 pg/ml. U żadnej z badanych osób nie wykryto IL-6
i TNF-α. W świeżo mrożonym osoczu (Tabela 2) stężenia IL-1β, IL-8 i sCD40L nie różniły się
od stężenia tych cytokin w osoczu kontrolnym. Nie wykryto w nim też IL-6 i TNF-α. Obu tych cytokin
nie wykrywano także w żadnym badanym składniku krwi w ciągu całego okresu przechowywania.
P. ŁOPACZ i wsp.
88
Tabela 1. Poziom cytokin w osoczu zdrowych dawców krwi.
Table 1. Cytokine level in healthy donors’ plasma.
Cytokina
IL-1β
IL-6
IL-8
TNF-α
sCD40L
Stężenie cytokiny (pg/ml)
średnia ± odchylenie standardowe
1,0 ± 0,9
0
9,1 ± 2,5
0
645,9 ± 659,9
Zakres wartości (pg/ml)
minimalna/maksymalna
0 / 2,4
0
2,3 / 14,3
0
0 / 2464,0
Tabela 2. Poziom cytokin w osoczu świeżo mrożonym (FFP).
Table 2. Cytokine level in fresh frozen plasma.
Cytokina
IL-1β
IL-6
IL-8
TNF-α
SCD40L
Ilość cytokiny (pg/ml)
Średnia ± odchylenie standardowe
0,6 ± 0,8
0
9,1 ± 1,9
0
495,3 ± 576,9
Zakres wartości (pg/ml)
minimalna/maksymalna
0 / 1,8
0
5,5 / 11,3
0
0 / 1654,0
12
IL-1beta (pg/ml)
10
8
KKCz
6
UKKCz
4
2
0
0
7
14
21
28
35
42
dni
Ryc. 1. Średnie stężenie IL-1β (pg/ml) w przechowywanych składnikach krwi
Fig. 1. Average concentration of IL-1β (pg/ml) in stored blood components
(linią przerywaną jest zaznaczony zakres stężeń tej cytokiny w osoczu zdrowych osób)
Na rycinie 1 przedstawiono średnie stężenie IL-1β w obu rodzajach KKCz. W dniu pobrania KKCz
i UKKCz nie wykrywano tej cytokiny, ale po 7 dniach przechowywania tych składników krwi stężenie
IL-1β zaczęło wzrastać i osiągnęło poziom podobny jak w osoczu kontrolnym. W UKKCz stężenie
IL-1β pozostawało na poziomie kontroli do końca przechowywania. W KKCz natomiast od 28 dnia
przechowywania obserwowano gwałtowny wzrost stężenia IL-1β, a w 42 dniu badania stężenie tej cytokiny było 10-krotnie wyższe (9,7 pg/ml) niż w dniu 0 (p=0,006). W KKP-Af. nie wykrywano IL-1β
w ciągu całego okresu przechowywania.
Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i sCD40L
89
70
60
IL-8 (pg/ml)
50
KKCZ
40
UKKCZ
KKP-Af.
30
20
10
0
0
7
14
21
28
35
42
dni
Ryc. 2. Średnie stężenie IL-8 (pg/ml) w przechowywanych składnikach krwi
Fig. 2. Average concentration of IL-8 (pg/ml) in stored blood components
(linią przerywaną jest zaznaczony zakres stężeń tej cytokiny w osoczu zdrowych osób)
Poziom IL-8 w badanych składnikach krwi w kolejnych dniach ich przechowywania przedstawiono
na Rycinie 2. Jej stężenie w dniu pobrania krwi było najwyższe w KKCz (średnio 23,1 pg/ml). Od 21
dnia przechowywania KKCz stężenie tej cytokiny zaczęło wzrastać (30,5 pg/ml), a w ostatnim dniu
ważności tego składnika osiągnęło 3-krotnie wyższą wartość (średnio 64,3 pg/ml), w porównaniu ze
stężeniem w dniu pobrania (p=0,002). Średnie stężenie IL-8 w UKKCz w ciągu całego okresu przechowywania było na poziomie stężenia tej cytokiny u zdrowych osób. W koncentratach płytkowych
w dniu aferezy stężenie IL-8 było w granicach normy (średnia 5,8 pg/ml). W 6 dniu przechowywania
KKP-Af. stężenie tej cytokiny było 3-krotnie wyższe (średnia 15,6 pg/ml) niż w dniu pobrania krwi
(p=0,002), ale nadal kształtowało się w górnych granicach normy.
Średnie stężenie sCD40L w badanych składnikach krwi przedstawiono na Rycinie 3. W KKCz stężenie tej cytokiny w dniu pobrania krwi było prawie 4-krotnie wyższe (8134 pg/ml) niż w osoczu kontrolnym, natomiast w UKKCz i KKP-Af. było w granicach normy. W trakcie przechowywania KKCz
poziom sCD40L nadal wzrastał i po 14 dniach osiągnął najwyższe stężenie 27 192 pg/ml, po czym stężenie nieznacznie spadało i w 42 dniu wynosiło średnio 19 565 pg/ml (2,5 razy wyższe niż w dniu 0,
p=0,295). W przechowywanych UKKCz poziom sCD40L nie zmieniał się i pozostawał w granicach
badań kontrolnych (od 243–477 pg/ml). W KKP-Af. w 6 dniu badania stężenie sCD40L było już prawie 5-krotnie wyższe (średnio 12 553 pg/ml) w porównaniu do stężeń tej cytokiny w dniu aferezy
(p=0,002).
Liczba leukocytów w KKCz w dniu 0 wynosiła średnio 9,3×103/µl, a w czasie przechowywania
ulegała stopniowemu zmniejszaniu i w 42 dniu była już 3-krotnie niższa (średnio 3,5×103/µl). W pozostałych składnikach krwi: UKKCz, KKP-Af. oraz FFP liczba leukocytów w ciągu całego okresu badań
kształtowała się < 1×103/µl (Rycina 4).
P. ŁOPACZ i wsp.
90
30000
25000
sCD40L (pg/ml)
20000
KKCZ
15000
UKKCZ
KKP-Af.
10000
5000
0
0
7
14
21
28
35
42
dni
Ryc. 3. Średnie stężenie sCD40L(pg/ml) w przechowywanych składnikach krwi
Fig. 3. Average concentration of CD40L (pg/ml) in stored blood components
(linią przerywaną jest zaznaczony zakres stężeń tej cytokiny w osoczu zdrowych osób)
10
9
Liczba WBC (x 103/ul)
8
7
6
KKCz
5
UKKCz
4
KKP-Af.
3
2
1
0
0
7
14
21
28
35
42
dni
Ryc. 4. Średnia liczba leukocytów w przechowywanych składnikach krwi
Fig. 4. Average number of leucocytes in stored blood components
DYSKUSJA
Ocena stężenia cytokin w przechowywanych składnikach krwi jest interesująca z punktu widzenia
bezpieczeństwa przetoczeń krwi, ponieważ wiadomo, że niehemolityczne gorączkowe odczyny poprzetoczeniowe mogą być wynikiem nie tylko interakcji przeciwciał antyleukocytarnych chorego z leukocy-
Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i sCD40L
91
tami obecnymi w przetaczanej krwi, ale także przetoczenia krwi z wysokim poziomem takich cytokin
prozapalnych jak IL-1β, IL-6 czy TNF-α [2,3,4,11,16]. Natomiast w odczynach poprzetoczeniowych
przebiegających z dusznością zaczęto zwracać uwagę na IL-8 oraz sCD40L [10, 16].
W Polsce do celów klinicznych stosowane są zarówno koncentraty krwinek czerwonych nie poddawane leukoredukcji jak i ubogoleukocytarne. Autorzy pracy zbadali stężenia w/w cytokin w obu
rodzajach koncentratów krwinek czerwonych oraz w koncentratach krwinek płytkowych z aferezy.
Zgodnie z zaleceniami zawartymi w „Medycznych zasadach przetaczania krwi” [17,18], opracowanymi
na podstawie wytycznych dyrektyw WE i Rady Europy, liczba leukocytów w ubogoleukocytarnych
składnikach krwi była niższa niż 1×106. Natomiast w KKCz, który uzyskano po usunięciu osocza bez
usuwania kożuszka leukocytarnego, liczba leukocytów była prawie 9-krotnie wyższa. Fakt ten miał
prawdopodobnie wpływ na zwiększone stężenie cytokin w KKCz, co będzie omawiane poniżej.
Najczęściej stosowaną metodą oznaczania cytokin są techniki enzymatyczne (ELISA), a ostatnio
unowocześniona ich wersja z użyciem biotyny i streptawidyny, zastosowana przez autorów niniejszej
pracy.
Grupą kontrolną dla badanych cytokin było oznaczenie ich stężenia w osoczu zdrowych dawców
krwi. Stężenia IL-1β, IL-8 i sCD40L w osoczu kontrolnym obserwowane w naszych badaniach mieściły się w granicach stężeń tych cytokin podanych przez producenta testu. W osoczu dawców, ani w żadnym ze składników krwi, w czasie całego okresu przechowywania nie wykryliśmy IL-6 i TNF-α. Analogiczne dane w odniesieniu do osocza zdrowych osób prezentują Lin i wsp.[3]. Natomiast Fujihara
i wsp. [19] i Shanwell i wsp. [5] stosując ilościowe testy ELISA o zwiększonej czułości (R&D) wykrywali bardzo niskie stężenia IL-6 i TNF-α w 42-dniowych KKCz. Inni badacze [cyt. wg 2] wykrywali
także niskie stężenia IL-6 i TNF-α w 5-dniowych KKP. W obecnej pracy poddaliśmy analizie ograniczoną liczbę składników krwi, jest więc możliwe, że przebadanie większej ich ilości pozwoliłoby wykazać, że w niektórych z nich poziom IL-6 i TNF-α jest wyższy od przeciętnej. Przy pomocy stosowanych przez nas testów wykrywaliśmy bowiem obie te cytokiny w niektórych składnikach krwi, po których wystąpiły niehemolityczne odczyny gorączkowe. Podobnie jak Muylle i wsp. [11] wykrywaliśmy
także obie te cytokiny w znacznych stężeniach w osoczu chorych, u których po przetoczeniach krwi
wystąpiły odczyny gorączkowe. IL-6 i TNF-α, a także omawiana niżej IL-1β należą do grupy endogennych pirogenów, które indukują gorączkę poprzez zwiększenie stężenia prostaglandyny E2 w podwzgórzu mózgowym [20].
Stężenie IL-1β i IL-8 w UKKCz utrzymywało się przez cały okres przechowywania w granicach
normy, natomiast w KKCz w końcowym okresie ważności tego składnika stężenie IL-1β wzrosło 10krotnie. Stężenie IL-8 w KKCz było już w pierwszych 3 tygodniach przechowywania 2-krotnie wyższe
niż poziom tej cytokiny w osoczu kontrolnym, a w ostatnim tygodniu badania wzrosło jeszcze 3krotnie. W KKP-Af. nie wykrywaliśmy IL-1β, natomiast stężenie IL-8 chociaż wzrosło w porównaniu
z dniem aferezy, to nadal utrzymywało się w górnych granicach normy.
Podobne do naszych obserwacje dotyczące stężenia IL-1β w KKCz i UKKCz przedstawiają Shanwell i wsp.[5] oraz Stack i wsp. [12]. W KKP-Af. Wadhwa i wsp. [14] także nie wykrywali IL-1β, natomiast inni badacze [cyt. wg 2] stwierdzali bardzo niskie stężenia tej interleukiny. W przypadku IL-8,
podobnie jak w naszych badaniach, cytowani już wyżej badacze [5, 12] stwierdzali w KKCz jej zwiększone stężenie w 42 dniu przechowywania krwi. W KKP-Af. zwiększone stężenie IL-8 w 5 dniu ich
przechowywania potwierdzają także Fujihara i wsp.[19] oraz Wadhwa i wsp.[14]. Cytowani badacze
oceniali stężenia cytokin przy użyciu zestawów ELISA firmy Quantikine, R&D Systems. W chwili
obecnej brak jest obserwacji, czy i jakie stężenia IL-8 w przetoczonych składnikach krwi mogą wywoływać odczyny poprzetoczeniowe przebiegające z dusznością, w tym TRALI.
Obserwowany wzrost stężenia wyżej opisanych cytokin może być spowodowany nie tylko aktywacją leukocytów, ale także ich rozpadem. Potwierdzeniem tego faktu może być obserwowany przez nas
spadek liczby leukocytów w czasie przechowywania KKCz, który koreluje ze wzrostem stężenia IL-1β
i IL-8. Podobne obserwacje, ale dotyczące zlewanych KKP, przedstawiają Aye i wsp. [13], którzy przy
P. ŁOPACZ i wsp.
92
użyciu ilościowych testów ELISA (R&D) stwierdzali w 5-dniowych niefiltrowanych KKP znacznie
wyższe stężenia tych cytokin w porównaniu do filtrowanych KKP. Ponadto w niefiltrowanych zlewanych KKP wykrywali oni IL-6 i TNF-α, które nie były przez nas stwierdzane w KKP z aferezy.
Spośród badanych w obecnej pracy cytokin, zarówno w osoczu jak i w przechowywanych
KKCz i KKP-Af., w najwyższym stężeniu występowała cytokina sCD40L. W KKCz już w dniu pobrania krwi stężenie tej cytokiny było 4-krotnie wyższe niż w osoczu zdrowych osób, a w trakcie przechowywania wzrosło jeszcze 2-krotnie. Było to związane prawdopodobnie z dużą liczbą płytek krwi
(ok.3x105/µl) obecnych w KKCz. Pięciokrotny wzrost stężenia tej cytokiny był także obserwowany
w KKP-Af., w 6 dniu przechowywania płytek. W trakcie przechowywania UKKCz poziom sCD40L nie
zmieniał się i pozostawał w granicach normy. Jak wiadomo, w czasie preparatyki UKKCz, w systemie
Atreus usuwane są leukocyty i większość płytek krwi.
Khan i wsp. [10] podobnie jak my wykazali wyższe stężenie sCD40L w 42-dniowych KKCz i 5dniowych KKP-Af., w porównaniu do dnia pobrania tych składników. Interesujące jest także spostrzeżenie tych autorów, że KKP z aferezy zawierają wyższe stężenia sCD40L aniżeli KKP przygotowane
z pełnej krwi. Cytowani autorzy wysuwają hipotezę, że sCD40L, które kumuluje się w czasie przechowywania składników krwi może aktywować ludzkie neutrofile wykazujące ekspresję CD40 i indukować ich cytotoksyczną aktywność, czego efektem jest niszczenie śródbłonka naczyń włosowatych płuc
i możliwość wystąpienia TRALI u predysponowanych chorych.
Ponadto Khan i wsp.[10] wykazali, że chorzy, u których wystąpił odczyn TRALI otrzymali po przetoczeniu KKP dwukrotnie więcej sCD40L niż chorzy, u których odczyn nie wystąpił. Udowodnili więc,
że wysokie stężenie tej cytokiny w niektórych przetaczanych składnikach krwi może być jednym
z czynników prowadzących do wystąpienia TRALI. Wyniki te w sposób istotny uzupełniają dotychczasową wiedzę o udziale cytokin w tym powikłaniu, tym niemniej dalsze badania nad tym zagadnieniem
są konieczne. Nasza praca, w której także podjęliśmy się oznaczania stężeń sCD40L w składnikach
krwi podczas przechowywania, wydaje się być istotnym kierunkiem badań i powinna być kontynuowana na większym materiale. Obecnie w przygotowaniu jest praca dotycząca stężenia IL-1β, IL-6, IL-8
i sCD40L w KKCz i KKP, po których wystąpiły odczyny poprzetoczeniowe przebiegające z dusznością, w tym TRALI.
Praca wykonana w ramach projektu badawczego własnego finansowanego przez Ministerstwo
Nauki i Szkolnictwa Wyższego (nr NN 401 215734).
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Brand A Passenger leukocytes, cytokines, and transfusion reactions. Engl J Med 1994; 331: 670-671.
Heddle NM Pathophysiology of febrile nonhemolytic transfusion reactions. Curr Opin Hematol 1999; 6: 420-426.
Lin JS, Tzeng CH, Hu HY i wsp. Cytokine release in febrile non-haemolytic red cell transfusion reactions. Vox Sang
2002; 82: 156-160.
Heddle N The role of cytokines in acute reactions to platelet transfusions. In. Compendium of American Association of
Blood Bank, 1998; 4: 268-272.
Shanwell A, Kristiansson M, Remberger M, Ringden O Generation of cytokines in red cell concentrates during storage is
prevented by prestorage white cell reduction. Transfusion 1997; 37: 678-684.
Silliman CC, Fung YL, Ball JB, Khan SY Transfusion related acute lung injury (TRALI: current concept and misconceptions. Blood Rev 2009; 23: 235-255.
Rana R, Fernandez-Perez ER, Khan SA i wsp. Risk factors and outcome of transfusion-related acute lung injury in the
critically ill: a retrospective study. Transfusion 2006; 46: 1478-1483.
Fung YL, Silliman CC The role of neutrophils in the pathogenesis of transfusion-related acute lung injury. Tranf.Med.
Rev 2009; 23: 266-283.
Silliman CC, Bjornsen AJ, Wyman TH i wsp. Plasma and lipids from stored platelets cause acute lung injury in an animal
model. Transfusion 2003; 43: 633-640.
Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i sCD40L
93
10. Khan SY, Kelher RM, Heal JM i wsp. Soluble CD40 ligand accumulates in stored blood components, primes neutrophils
through CD40 and is a potention cofactor in the development of transfusion-related acute lung injury.Blood 2006; 108:
2455-2462.
11. Muylle L, Joos M, Wouters E, De Bock R, Peetermans ME. Increase tumor plasma of stored platelet concentrates: relationship between TNFα and IL-6 levels and febrile transfusion reactions. Transfusion 1993; 33: 195-199.
12. Stack G, Baril L, Napychank P, Snyder EL. Cytokine generation in stored, white cell-reduced, and bacterially contaminated units of red cells. Transfusion 1995; 35: 199-203.
13. Aye MT, Palmer DS, Giulivi A, Hashemi S. Effect of filtration of platelet concentrates on the accumulation of cytokines
and platelet release factors during storage. Transfusion 1995; 35: 117-124.
14. Wadhwa M, Seghatchian MJ, Lubenko A i wsp. Cytokine levels in platelet concentrates: quantitation by bioassays and
immunoassays. British Journal of Haematology 1996; 93: 225-234.
15. Glenister KM, Sparrow LL Level of platelet-derived cytokines in leukoreduced red blood cells is influenced by the processing method and type of leukoreduction filter. Transfusion 2010; 50: 185-189.
16. Shaiegan M, Poufatollah AA, Namiri M, Babaee G. Generation of IL-8 and TNF-alpha in platelet concentrates during
storage. Arch.Iran Med., 2006; 9: 51-64.
17. Rosiek A Pobieranie krwi i zabiegi aferezy, w: Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania, obowiazujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi. Red. Łętowska M, IHiT, Warszawa 2010, 4-1–
4-4.
18. Antoniewicz-Papis J, Dzieciątkowska A Preparatyka krwi i jej składników w: Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania, obowiazujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi. Red. Łętowska
M, IHiT, Warszawa 2010, 6-1–6-102.
19. Fujihara M, Takahashi TA, Ogiso C, Hosoda M, Ikebuchi K, Sekiguchi S Generation of interleukin 8 in stored apheresis
platelet concentrates and the preventive effect of prestorage ultraviolet B radiation. Transfusion 1997; 37: 468-475.
20. Gołąb J, Jakóbisiak M, Zagożdżon R, Obłąkowski P. Cytokiny w: Immunologia Red. Gołąb J, PWN, Warszawa 2002,
198-244.
Praca wpłynęła do Redakcji 01.02.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 24.03.2011 r.
Adres Autorów:
Patrycja Łopacz
Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej
Ul. Chocimska 5
00-975 Warszawa
e-mail: [email protected]