Ćw. M8 Zjawisko absorpcji i emisji światła w analityce. Pomiar widm

Katedra Fizyki i Biofizyki – instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku Lekarskiego
Ćw. M8
Zjawisko absorpcji i emisji światła w analityce. Pomiar widm absorpcji i
stężenia ryboflawiny w roztworach wodnych za pomocą spektrofotometru.
Wyznaczanie stężeń substancji w roztworze metodą fluorescencyjną.
Zagadnienia
Kwantowa teoria światła.
Struktura energetyczna cząsteczki.
Zjawisko absorpcji. Prawo Lamberta Beera.
Wielkości służące do ilościowego opisu zjawiska absorpcji.
Zjawisko fluorescencji. Prawa związane z tym zjawiskiem.
Wielkości służące do ilościowego opisu zjawiska fluorescencji.
Widma absorpcji i fluorescencji.
Wykorzystanie metod spektroskopowych w analizie ilościowej i jakościowej.
Opis ćwiczenia:
W ćwiczeniu mierzymy absorbancję i fluorescencję serii roztworów ryboflawiny. Na
podstawie zmierzonych widm analizujemy zależność absorpcji i fluorescencji światła od
stężenia substancji.
Należy sporządzić krzywą wzorcową, znaleźć jej równanie i na jego podstawie
wyznaczyć nieznane stężenie roztworu Cx, korzystając z danych uzyskanych zarówno z
pomiarów absorpcyjnych jak i fluorescencyjnych. .
Instrukcja
1.
Wykonaj serię roztworów ryboflawiny o stężeniach zadanych przez prowadzącego
ćwiczenia.
2.
Włącz komputer.
3.
Włącz spektrometr M42.
Oi
UV
M42
komora pomiarowa (otwierać
podnosząc do góry)
włącznik
1
Katedra Fizyki i Biofizyki – instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku Lekarskiego
4.
Włącz oprogramowanie AspectPlus (ikona na pulpicie).
5.
Znajdź na pasku zadań Measurement, rozwiń, wybierz Init Device i poczekaj, aż
zainicjuje się połączenie z aparatem.
6.
W tym samym Menu wybierz: Set parameters i upewnij się, że ustawienia są takie same
jak w podanym niżej przykładzie. Jeśli nie - na rozwiniętym pasku wybierz:
1 D:\MEDYCYNA\RFL.PAR i ponownie sprawdź ustawienia parametrów pomiarowych
(Set parameters). Ustawione tu
będzie m.in. w jakim zakresie
długości fal, z jaką dokładnością i
szybkością
będzie
prowadzony
pomiar.
2
Katedra Fizyki i Biofizyki – instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku Lekarskiego
7.
Wstaw do komory pomiarowej (klapkę podnosi się do góry) dwie kuwety: jedną z wodą
destylowaną, drugą z roztworem mierzonym (najlepiej zacząć od roztworu najmniej
stężonego i skończyć na roztworze wyjściowym).
kuweta z roztworem
referencyjnym (z tyłu)
kuweta z roztworem
pomiarowym (z przodu)
8.
W menu Measurement wybierz Measuere. Rozpocznie się pomiar widma absorpcji
danego roztworu. W trakcie pomiaru dostępne będą polecenia: Stop i Scale. Można wejść
w Scale i dostosować sobie podziałkę na osi absorbancji. Wszelkie komunikaty jakie
pojawią się po zmierzeniu widma akceptuj przez kliknięcie OK.
9.
Po skończonym pomiarze należy odczytać przy jakiej długości fali pojawia się
maksimum absorbancji. W tym celu trzeba wejść w polecenie Data Handing a następnie
Analysis i Peak. Po wybraniu pojawi się komunikat dotyczący parametrów wybieranego
piku. Ważne aby było zaznaczone, że poszukujemy maksimum. Po wybraniu OK pojawi
się informacja o wartości absorbancji w maksimum oraz o długości fali przy jakiej to
maksimum występuje. Informacje te należy spisać do tabeli, nie zapominając o wartości
stężenia jakie miała mierzona ryboflawina.
3
Katedra Fizyki i Biofizyki – instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku Lekarskiego
10. Następnie należy wymienić mierzony roztwór i powtórzyć operację od punktu 8.
4
Katedra Fizyki i Biofizyki – instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku Lekarskiego
11. Przejdź na stanowisko do pomiaru fluorescencji i zmierz fluorescencję badanych
roztworów przy długości fali równej
max
absorpcji.
12. Uzyskane wyniki opracuj w programie GraphPad Prism według podanej instrukcji.
13. Znając równanie prostej policz Cx (stężenie nieznane roztworu ryboflawiny)z pomiarów
absorpcyjnych i fluorescencyjnych. Oszacuj niepewność uzyskanych wyniku.
14. Poproś prowadzącego o wydrukowanie wykresów
max =
Lp.
……….
stężenie
A
max
I
max
( A)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
cx
5