k k K - Zakład Biochemii Fizycznej

Badanie kinetyki enzymatycznej stanów przejściowych metodą zatrzymanego
przepływu
Celem analizy kinetycznej w enzymologii jest:
1) poznanie ścieżki reakcji, identyfikacja związków przejściowych i określenie etapów,
które ograniczają szybkość przemiany.
2) ilościowe wyznaczenie energii wiązania dla specyficzności i katalizy
Uzasadnieniem dla kinetyki stanów przejściowych są ograniczenia kinetyki stanu
stacjonarnego. Zwykle analizę kinetyczną mechanizmu reakcji enzymatycznych rozpoczyna się
od badania kinetyki stanu stacjonarnego dlatego warto się zastanowić jakich informacji dostarcza
kinetyka stanu stacjonarnego i jak mogą być one wykorzystane do planowania eksperymentów
kinetyki stanów przejściowych. Dane uzyskiwane z analizy stanu stacjonarnego dostarczają
jedynie pośrednich informacji o ścieżce reakcji. Parametry stanu stacjonarnego kkat i Km są
skomplikowanymi wypadkowymi wszystkich reakcji zachodzących na powierzchni enzymu;
indywidualne etapy reakcji są uwikłane w tych parametrach i nie mogą być rozwiązane.
Ograniczenia te przezwycięża kinetyka stanów przejściowych, w której enzym jest traktowany
jako stechiometryczny reagent co umożliwia określenie ścieżki reakcji w sposób bezpośredni.
Nie znaczy to, że kinetyka stanu stacjonarnego jest bez znaczenia raczej te dwa podejścia się
wzajemnie uzupełniają.
Praktykujący kinetykę stanu stacjonarnego uważają, że mechanizm kinetyczny jest zdefiniowany
jeśli kolejność wiązania substratów i uwalniania produktów jest określona. Taka analiza definiuje
reagenty obecne w miejscu aktywnym enzymu podczas reakcji i pozwala na rozróżnienie
pomiędzy np. mechanizmem Ping-Pong czy mechanizmem sekwencyjnym. Jednakże żadne
informacje definiujące etapy, w których występującą związki enzymu lub które ograniczają
szybkość reakcji nie są dostępne. Mutacje enzymu, zmiana pH, zmiana substratu mogą spowolnić
szybkość chemicznej przemiany w produkty, tak że staje się ona etapem limitującym kinetykę
stanu stacjonarnego zaś przez badanie efektu izotopowego można zgłębić zakres, w jakim
przemiana ta zostaje ograniczona. Bezpośrednie pomiary w miejscu aktywnym enzymu są jednak
wymagane w celu ustalenia podstaw kinetyki i termodynamiki dla specyficzności i wydajności
enzymatycznej. Do udowodnienia mechanizmu reakcji konieczne są pomiary indywidualnych
reakcji w miejscu aktywnym enzymu w fizjologicznym pH i z naturalnym substratem.
Stałe kinetyczne kkat i Km są często mylnie interpretowane jako stała szybkości przekształcenia
chemicznego i stała dysocjacji substratu, Kd. Stała Km w rzeczywistości może być wyższa, niższa
lub równa stałej Kd. Stałe kinetyczne stanu stacjonarnego dostarczają informacji wystarczających
do opisu minimalnego schematu reakcji:
k1
k2
E + S ←⎯→
ES ⎯⎯→
E + P , gdzie
k −1
k + k2
k kat = k 2 i K m = −1
k1
Ten uproszczony model może wynikać z bardziej realistycznego mechanizmu:
k3
k1
k
E + S ←⎯→
ES ←⎯→
⎯2 EP ⎯⎯→
E + P , gdzie
k −1
k −2
k kat =
k 2 k3
k k + k −1k − 2 + k −1k 3
i Km= 2 3
k 2 + k − 2 + k3
k1 (k 2 + k − 2 + k 3 )
1
Ścieżka reakcyjna zawierająca o jeden związek przejściowy więcej:
k
k1
k
k
E + S ←⎯→
ES ←⎯→
⎯2 EX ←⎯3 → EP ←⎯→
⎯4 E + P
k −1
k −2
k −3
prowadzi do jeszcze bardziej złożonych wyrażeń:
k 2 k3k 4
k (k (k + k 4 ) + k 3 k 4 ) + k 2 k 3 k 4
k kat =
i K m = −1 − 2 − 3
(k 2 + k − 2 )(k − 3 + k 4 ) + k 2 k3 + k3k 4
k1 ((k 2 + k − 2 )(k − 3 + k 4 ) + k 2 k 3 + k 3 k 4 )
zatem kkat i Km są funkcjami wszystkich stałych szybkości będących na ścieżce reakcji i każde
upraszczające założenie dotyczące indywidualnych stałych szybkości może być niewłaściwe. Co
więcej przedstawione powyżej trzy schematy reakcji są nierozróżnialne dla kinetyki stanu
stacjonarnego. Nawet analiza inhibicyjna dostarczająca dowodów na istnienie stanu EP nie
pozwala na wyznaczenie stałych szybkości. Powodem nierozróżnialności jest ta sama forma
równania stanu stacjonarnego:
k [ E ][ S ]
,
ν = kat 0
K m + [S ]
a jedynie złożoność wyrażeń na kkat i Km jest inna dla tych mechanizmów.
Dwiema fundamentalnymi stałymi kinetycznymi stanu stacjonarnego są stała kkat
zdefiniowana jako maksymalna szybkość tworzenia produktu przy wysyceniu enzymu substratem
k
i stała oraz stała kat , pozorna stała szybkości II-rzędu dla wydajnego wiązania substratu. Stała
Km
Km powinna być rozpatrywana jedynie jako stosunek maksymalnej stałej szybkości rozpadu
kompleksu enzym–substrat podzielony przez pozorną stała szybkości wiązania substratu
k + k2
). Takie podejście ściślej odzwierciedla wartość Km jako stężenia substratu przy
( K m = −1
k1
którym szybkość wiązania substratu podczas przemiany w warunkach stanu stacjonarnego
substratu w produkt równa się sumie szybkości uwalniania substratu i produktu. Te dwie stałe
kinetyczne pochodzące z analizy stanu stacjonarnego stanowią dolny limit dla wewnętrznych
k kat
stałych szybkości reakcji enzymatycznej. Wartość
stanowi dolny limit dla szybkości
Km
wiązania substratu, zaś kkat ustala dolny limit dla wartości każdej stałej szybkości I-rzędu etapu
następującego po etapie wiązania substratu postępującego w kierunku uwalniania produktów.
Zbadanie szczegółowego mechanizmu reakcji enzymatycznej i pomiar stałych szybkości
etapów elementarnych wymaga prowadzenia eksperymentu przy wysokim stężeniu enzymu,
kiedy to stężenie kompleksów enzym-substrat zwanych stanami przejściowymi jest
wystarczająco wysokie i mierzalne. Ponieważ enzymy są wydajnymi katalizatorami często
badanie reakcji stanu przejściowego wymaga zastosowania specjalnej aparatury.
Podczas analizy skomplikowanych reakcji biochemicznych nasuwa się pytanie o liczbę równań
kinetycznych potrzebnych do opisu ich mechanizmu. Odpowiedź jest zwodniczo prosta: liczba
niezależnych równań różniczkowych jest równa liczbie niezależnych zmiennych stężeniowych.
Ta z kolei jest równa całkowitej liczbie zmiennych stężeniowych pomniejszonych o liczbę
zależności wynikających z prawa zachowania masy istniejących pomiędzy zmiennymi
2
stężeniowymi, wliczając tutaj zależności określone poprzez sytuacje stanu stacjonarnego
(wówczas zmiany stężenia w czasie mogą być równe zero).
Zasadniczo liczba równań różniczkowych, które charakteryzują mechanizm odpowiada liczbie
niezależnych etapów reakcji.
Projektowanie doświadczenia jest bardzo ważne ponieważ znaczące uproszczenia analizy mogą
być zastosowane pod warunkiem, że doświadczenie zostanie przeprowadzane we właściwy
sposób. Tak często jak to tylko możliwe eksperyment powinien być przeprowadzany w
warunkach reakcji I rzędu, co w praktyce oznacza zastosowania wysokich stężeń wszystkich
reagentów w stosunku do reagenta, którego zmiany w czasie są mierzone.
Najprostsze reakcje/etapy elementarne – rozwiązania analityczne
Reakcje jednocząsteczkowe
Najprostszą do pomyślenia reakcją jest nieodwracalna reakcja I rzędu. Przykładem może tu być
zmiana konformacyjna enzymu ze stanu E do stanu E’ wywołana np. zmianą pH i opisana stałą
szybkości k1.
k1
E ⎯⎯→
E'
Ten mechanizm jest oczywiście scharakteryzowany przez pojedyncze równanie różniczkowe:
d[E]
−
= k1[ E ]
dt
ponieważ są dwa reagenty (zmienne stężeniowe). Całkowite stężenie enzymu [E0] jest stałe i
określone przez prawo zachowania masy: [ E ] + [ E ' ] = [ E0 ]
Po scałkowaniu w następujących granicach: dla t = 0, [E] = [E0]
[ E ] = [ E0 ] exp − k 1t
Wyznaczenie stałej czasowej k1 polega na określenie nachylenia wykresu ln[E] od t lub na
bezpośrednim dopasowaniu powyższego równania matematycznego do zmierzonej krzywej
czasowej nieliniową metodą najmniejszych kwadratów.
Jeśli reakcja jest odwracalna:
k1
E ↔ E'
k −1
Kinetyczne równania różniczkowe przyjmują postać:
d[E ]
= −k1[ E ] + k −1[ E ' ] ,
dt
[1]
d[E' ]
= k1[ E ] − k −1[ E ' ]
dt
Jest to układ dwóch równań różniczkowych liniowych o stałych współczynnikach. Można je
rozwiązać zauważywszy że suma stężeń E i E’ nie zmienia się podczas reakcji:
[ E ] + [ E ' ] = [ E0 ] + [ E0' ] , gdzie [E0] i [E0' ] oznaczają stężenia początkowe E i E’.
Wstawiając do równania kinetycznego na [E] wzór:
3
[2]
[ E ' ] = [ E0 ] + [ E0' ] − [ E ]
otrzymujemy
d[E ]
= −(k1 + k −1 )[ E ] + k −1⎛⎜ [ E0 ] + [ E0' ] ⎞⎟
[3]
⎝
⎠
dt
Jest to równanie różniczkowe niejednorodne. W pierwszym etapie należy rozwiązać równanie
różniczkowe jednorodne (tzn. przyjąć prawy człon sumy – który jest niezależny od czasu - za
równy zero), przez rozdzielenie zmiennych:
d[E ]
= −(k1 + k −1 )t
[4]
[E]
[ E ] = C exp −(k1 + k −1 )t + D
[5]
Otrzymujemy proponowane rozwiązanie, w którym należy wyznaczyć współczynniki C i D.
W tym celu należy otrzymane wyrażenie [5] podstawić do prawej strony wyjściowego
niejednorodnego równania różniczkowego [3] oraz zróżniczkować otrzymane wyrażenie [5] i
różniczkę wstawić zamiast lewej strony wyjściowego niejednorodnego równania różniczkowego
[3]:
[6]
− (k1 + k −1 )C exp − (k1 + k −1 )t = −(k1 + k −1 )⎛⎜ C exp − (k1 + k −1 )t + D ⎞⎟ + k −1⎛⎜ [ E0 ] + [ E0' ] ⎞⎟
⎠
⎝
⎠
⎝
i wyznaczyć współczynnik D
− (k1 + k −1 )C exp − (k1 + k −1 )t = −(k1 + k −1 )C exp − (k1 + k −1 )t − (k1 + k −1 )D + k −1 ⎛⎜ [ E0 ] + [ E0' ] ⎞⎟
⎠
⎝
k −1 ⎛
'
D=
⎜ [ E 0 ] + [ E 0 ] ⎞⎟ zatem
[7]
⎠
k −1 + k1 ⎝
[ E ] = C exp − (k1 + k −1 )t +
k −1 ⎛
'
[8]
⎜ [ E0 ] + [ E0 ] ⎞⎟
⎝
⎠
k −1 + k1
Następnie należy wyznaczyć współczynnik C z warunków początkowych [E] = [E0] dla t = 0,
czyli
k −1 ⎛
'
[9]
[ E0 ] = C +
⎜ [ E0 ] + [ E0 ] ⎞⎟ , przy czym oznaczamy za
⎠
k −1 + k1 ⎝
k −1 ⎛
'
⎜ [ E0 ] + [ E0 ] ⎞⎟
⎠
k −1 + k1 ⎝
C = [ E0 ] − [ E równ ] ,
ostatecznie zmiany [E] w czasie opisane są równaniem:
[ E równ ] =
[ E ] = [ Erówn ] + ([ E0 ] − [ Erówn ]) exp −(k1 + k −1 )t
[10]
[11]
[12]
gdzie indeks „równ” oznacza stężenie w stanie równowagi (dla t = ∞, [E] = [Erówn]).
Analogicznie jak wyżej można je przedstawić w formie logarytmicznej:
⎛ [ E ] − [ E równ ] ⎞
⎟⎟ = −(k1 − k −1 )t
ln⎜⎜
⎝ [ E0 ] − [ E równ ] ⎠
4
Zależność ln([ E ] − [ E równ ]) od czasu jest liniowa, a nachylenie wyznacza − (k1 + k −1 ) . Jeśli stała
'
równowagi K1 = [ E równ
] /[ E równ ] = k1 / k −1 jest znana obydwie stałe szybkości mogą być
wyliczone.
Należy zauważyć, że czynnik eksponencjalny, kobs będący odwrotnością czasu relaksacji jest
1
równy: k obs = = k1 + k −1 , oznacza to, że stała szybkości potrzebna do osiągnięcia stanu
τ
równowagi dla reakcji odwracalnej jest większa niż dla każdej z indywidualnych reakcji (wprost
– k1 i odwrotnej – k-1).
Mechanizm reakcji enzymatycznej można uznać za zdefiniowany, kiedy zostaną
określone wszystkie stany przejściowe, kompleksy i stany konformacyjne enzymu, a także stałe
szybkości kolejnych etapów procesu. Z punktu widzenia kinetyki problem sprowadza się do
zidentyfikowania liczby i sekwencji stanów przejściowych, zdefiniowania ich natury (tzn. czy są
to kowalencyjne stany przejściowe czy też konformacyjne) oraz pomiaru wartości stałych
szybkości, a także określenia udziału grup kwasowych i zasadowych w oparciu o badanie
zależności pH.
Często mówi się, że kinetyka nie jest w stanie udowodnić mechanizmu reakcji, a jedynie
wyklucza pewne alternatywy. Jest to prawda w przypadku kinetyki stanu stacjonarnego (steady
state), gdzie mierzy się jedynie szybkość pojawiania się produktów lub ubytku substratów,
jednak nie jest to prawdą dla kinetyki stanu przedstacjonarnego. Jeśli stany przejściowe na
ścieżce reakcji są bezpośrednio obserwowane oraz szybkość ich tworzenia i rozpadu jest
mierzona wówczas szczegółowy mechanizm reakcji jest dowiedziony.
Istnienie stanu przejściowego uznaje się za udowodnione, jeśli spełnia on następujące kryteria:
- zostanie wyizolowany i scharakteryzowany
- tworzy się wystarczająco szybko żeby być na ścieżce reakcji
- reaguje wystarczająco szybko żeby być na ścieżce reakcji
Te kryteria wymagają zastosowania kinetyki stanu przedstacjonarnego w celu wyznaczenia
stałych szybkości tworzenia i rozkładu stanu przejściowego. Jednak pomiary szybkiej kinetyki
nie są wystarczające, ponieważ wartości stałych szybkości muszą być spójne z aktywnością
enzymu w warunkach stanu stacjonarnego.
Sposób analizy złożonych wieloetapowych reakcji enzymatycznych i wyznaczania stałych
kinetycznych poszczególnych etapów procesu najłatwiej przedstawić na przykładzie hydrolizy
amidów lub estrów przez proteazy serynowe:
k3
k1
k2
E + S ↔ ES → P1 + EP2 → E + P2
k −1
Stężenie H2O w roztworach wodnych jest stałe
Szybkość reakcji w warunkach steady state wyznacza się z zależności Michaelis’a-Menten’a:
5
⎛ k 2 k3 ⎞
⎟⎟[E ]t [S ]
⎜⎜
k
k
+
V =⎝ 2 3⎠
⎛
⎞
[S ] + ⎜⎜ K s k3 ⎟⎟
⎝ k 2 + k3 ⎠
k cat =
k 2 k3
k 2 + k3
KM =
K S k3
k 2 + k3
KS =
k −1
k1
(1)
(2)
(3)
(4)
Aby uzyskać indywidualne stałe kinetyczne kolejnych etapów reakcji należy zastosować
kinetykę stanu przedstacjonarnego.
Strategia polega na pomiarze stałych szybkości acylacji (k2) i deacylacji (k3) i wykazaniu,
że każda z nich jest większa lub równa wartości stałej kcat całej reakcji mierzonej w warunkach
steady state. Jednym ze sposobów pomiaru stałej szybkości acylacji jest doświadczenie w
warunkach tzw. pojedynczego obrotu enzymu (single-turnover). W praktyce polega to na
zmieszaniu nadmiaru substratu w stosunku do enzymu. W takich warunkach często obserwuje się
szybkie tworzenie się u pierwszego produktu (oraz acyloenzymu), zjawisko to określa się
mianem wybuchu (burst), gdyż stała szybkości jego tworzenia jest wyższa niż w warunkach
steady state. Burst wywołany jest nagromadzeniem pierwszego produktu w miejscu aktywnym
enzymu również acyloenzym kumuluje się i pozostaje w stałym stężeniu przez dłuższy okres
czasu, tzn. tak długo na ile wystarczy substratu by zapewnić acylację enzymu. W ten sposób
proces przekształcenia kompleksu ES w acyloenzym jest izolowany i nie zachodzi odzysk
enzymu jak to ma miejsce w warunkach steady state stąd określenie single turnover. Stała
szybkości acylacji może być wyznaczona przez pomiar szybkości pojawiania się barwnego
(pierwszego) produktu (np. nitrofenolu lub jego pochodnej). Po zmieszaniu substratu z enzymem
następuje faza szybkiego eksponencjalnego wzrostu absorbacji a za nią faza wzrostu liniowego.
Stałe szybkości acylacji i dysocjacji kompleksu enzym-substrat mogą być wyliczone z zależności
obserwowanej stałej szybkości dla fazy eksponencjalnej od stężenia barwnego produktu.
Obserwowana stała szybkości odpowiadająca liniowej fazie krzywej kinetycznej pozwala
wyznaczyć stałą szybkości deacylacji, ale są to już pomiary steady state.
Mechanizm kinetyki burst jest często opisywany przez dwa nieodwracalne etapy:
k3
k2
ES ⎯⎯→
EP ⎯⎯→
E+P
Równanie przedstawiające zależność tworzenia produktu w czasie jest następujące:
6
[P]obs
[E0 ]
= A0 (1 − e − kobst ) + k cat t ,
(5)
gdzie stałe szybkości i amplituda są zdefiniowane
k obs = k 2 + k 3
2
A0 = [k 2 / (k 2 + k 3 )]
k cat = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 )
(6)
(7)
(8)
Amp=[k2/(k2+k3)]2
[P1]
Nachylenie=k2k3/(k2+k3)
kobs=k2+k3
czas
Po wybuchu przedstacjonarnym następuje stacjonarne przekształcenie ze stałą szybkości równą
kcat. Faza eksponencjalna zanika po czasie t ok. 5 razy większym od τ = 1/kobs.
Obliczenie stałych szybkości z kinetyki steady state i określenie stechiometrii wiązania wymaga
znajomości stężenia aktywnych miejsc enzymu. W opisanych powyżej warunkach reakcji
pierwszy mol substratu reaguje szybko z enzymem tworząc stechiometryczną ilość związanego z
enzymem związku przejściowego i produktu, podczas gdy następcza reakcja jest wolna zależna
od powolnego rozpadu związku przejściowego i uwolnienia wolnego enzymu. A zatem
amplituda procesu burst jest równa lub mniejsza (patrz dalej) stężeniu miejsc aktywnych enzymu.
Ta metoda oznaczania absolutnego stężenia enzymu nosi nazwę miareczkowania miejsca
aktywnego.
Wartość amplitudy procesu burst można przewidzieć ze stałych szybkości burst i steady state.
Jednak przyjęty model bywa nieadekwatny co do założenia nieodwracalności reakcji
chemicznych. Ustalająca się równowaga wewnętrzna wynikająca z obecności reakcji biegnącej w
przeciwnym kierunku (k-2) obniża wartość amplitudy procesu burst do wartości niższej niż
przewidziana przez równanie (7).
Dla procesu obejmującego odwracalną reakcję chemiczną (chodzi o etap acylacji)
7
k2
k3
ES ⇔ EP ⎯⎯→
E+P
k− 2
zależność tworzenia produktu od czasu nadal pozostaje zgodna z równaniem (5), lecz stałe i
amplituda są zdefiniowane inaczej:
k obs = k 2 + k − 2 + k 3
(9)
A 0 = k 2 (k 2 + k − 2 ) / (k 2 + k − 2 + k 3 )
2
k cat = k 2 k 3 / (k 2 + k − 2 + k 3 )
(10)
(11)
W porównaniu z nieodwracalnym szlakiem reakcji tutaj obserwowana stała szybkości procesu
burst będzie wyższa zaś amplituda niższa z powodu zmniejszenia stężenia acyloenzymu EP.
Należy pamiętać, że szybkość przekształcenia steady state jest prostą funkcja stężenia [EP]ss tzn.
k cat = k 3 [ EP ]ss . Dlatego w pierwszym przybliżeniu wartość k3 można oszacować z nachylenia
krzywej kinetycznej podzielonego przez przecięcie otrzymane z ekstrapolacji liniowej fazy do osi
y. Jest to tylko przybliżenie, ponieważ punkt przecięcia z osią y definiujący amplitudę procesu
burst jest niższy niż faktyczne stężenie EP w procesie steady state: [EP ]ss = k 2 / (k 2 + k − 2 + k 3 ) .
Amplituda burst jest niższa niż rzeczywiste stężenie EP o czynnik (k 2 + k − 2 ) / (k 2 + k − 2 + k 3 ) .
Dlatego im wyższa jest stała szybkości uwalniania produktu, k3, w porównaniu z reakcją
chemiczną k 2 + k − 2 tym niższa amplituda procesu burst z ekstrapolacji. Amplituda procesu burst
zależy od stosunku pomiędzy od stałą szybkości tworzenia EP i stałymi szybkości: uwalniania P i
reakcji odwrotnej, czyli tworzenia ES.
- jeśli amplituda wynosi 1 na miejsce aktywne enzymu wówczas tworzenie produktu jest
dużo szybsze niż szybkość jego uwalniania (k2>>k3) i równowaga wewnętrzna
przesunięta jest na korzyść EP (k2>k-2).
- zredukowana amplituda czyli niższa niż [EP]ss wynika ze współzawodnictwa pomiędzy
stałą szybkości tworzenia produktu, k2 a jego uwalniania, k3. Jeśli k3 rośnie, reakcja jest
przesunięta w kierunku steady state wówczas amplituda maleje. Wartość amplitudy
zawiera się pomiędzy 0-1.
- niższa wartość amplitudy niż spodziewana na podstawie obserwowanej stałej szybkości
steady-state i stałej szybkości procesu burst oznacza równowagę wewnętrzną. Jeśli k-2
rośnie to amplituda burst maleje zaś stała szybkości burst, kobs, rośnie.
- brak procesu burst świadczy o tym, że etapem ograniczającym szybkość reakcji jest etap
acylacji bądź też poprzedzający go etap wiązania substratu. Ewentualnie równowaga wewnętrzna
przesunięta jest na korzyść substratu co raczej jest mniej prawdopodobne w miejscu aktywnym
enzymu niż w roztworze.
U podstaw powyższych rozważań leżą dwa ciche założenia. Po pierwsze stała szybkości wiązania
substratu jest wysoka a wysycenie miejsc aktywnych enzymu jest wydajne i zachodzi szybciej
niż sama kataliza. Po drugie uwalnianie produktów jest nieodwracalne a zatem stężenie produktu
w roztworze może być zaniedbane. W praktyce założenia te czasem okazują się być błędne i dane
eksperymentalne analizowane są numerycznie, zaś powyższe równania stanowią początkowe
dopasowania w metodzie regresji nieliniowej. Nawet w komputerowych symulacjach nadal
zakłada się że stała szybkości wiązania substratu musi być szybsza od katalizy jeśli celem
doświadczenia ma być badanie stałej szybkości reakcji chemicznej (acylacji).
8
Metoda zatrzymanego przepływu (stopped-flow) jest użyteczna w badaniach szybkiej
kinetyki stanów przejściowych, zawsze gdy zmiany mierzonego sygnału mogą być łatwo
powiązane ze stężeniem czyli w pomiarach czasowych takich parametrów fizykochemicznych
jak absorbancja, fluorescencja, rozproszenie światła, dychroizm kołowy, jądrowy rezonans
magnetyczny (NMR) czy przewodnictwo. Najczęściej stosowanymi parametrami są absorbancja i
fluorescencja. Zmiany absorbancji są stosunkowo łatwe do mierzenia ale zależą one od różnicy
we współczynnikach ekstynkcji między substratami i produktami i tak na przykład absorbancja
substratu uwalnianego do roztworu może ograniczać czułość metody jeśli celem jest
monitorowanie zmian w centrum aktywnym enzymu w warunkach nadmiaru substratu. Pomiary
fluorescencji maja tą zaletę nad pomiarami absorbancji, że stosunek sygnału do szumu jest
lepszy. Główną wadą metod fluorescencyjnych jest wymóg stosunkowo intensywnego źródła
światła i efektywnego odzysku światła emitowanego z próbki.
Instrument wyposażony jest w monochromator umożliwiający wybór fali wzbudzenia i filtry
interferencyjne służące do wyboru fali emisji. Istnieje szeroki wybór komercyjnie dostępnych
filtrów pasmowych (band-pass) i odcinających (cutoff), które mogą być stosowane w celu
optymalizacji monitorowanej długości fali.
Reakcja zostaje zapoczątkowana przez wypchniecie dwóch lub więcej roztworów,
utrzymywanych początkowo w osobnych strzykawkach, przez komorę mieszania do komory
obserwacyjnej. Przepływ jest stopowany (z punktu widzenia fotopowielacza przepływająca ciecz
zostaje gwałtownie zatrzymana w komorze pomiarowej) przez strzykawkę stopującą (stąd nazwa
metody stopped-flow) i dane spektralne są natychmiast po zatrzymaniu przepływu rejestrowane
przez komputer. Zadaniem strzykawki stopującej jest też ograniczenie objętości roztworów
potrzebnych do pomiaru. W starszych typach aparatów podczas wypełniania się strzykawki
stopującej przesuwający się tłok wyzwalał rejestrację danych poprzez naciśniecie
mikroprzełącznika. W nowszych aparatach stosowne są komputerowo sterowane silniki
wymuszające precyzyjne mieszanie i zatrzymywanie przepływu w komorze obserwacyjnej.
Tysiące punktów mogą być rejestrowane w ciągu milisekund od zmieszania zatem otrzymywane
dane są często wysokiej jakości i pozwalają na wyznaczenie stałych szybkości z dużą
dokładnością.
9
Metoda zatrzymanego przepływu posiada rozpiętość pięciu rzędów wielkości jeśli chodzi o skalę
czasową toteż ważne jest aby dane kinetyczne były zbierane we właściwym oknie czasowym.
Przyjmuje się zasadę monitorowania reakcji przez okres równoważny sześciu czasom
połowiczym (czas potrzebny na przetworzenie połowy początkowego stężenia reagentów
t1/2=ln2/kobs)
Maksymalna stała szybkości mierzalna w doświadczeniach zatrzymanego przepływu jest
ograniczona przez czas potrzebny do wymieszania reagentów i ich transport z komory mieszania
gdzie reakcja jest zapoczątkowana do punktu obserwacji. Czas ten zwany czasem martwym
(dead time) aparatu jest zależy od wydajności mieszania, szybkości przepływu i odległości
pomiędzy komorą mieszania a punktem obserwacyjnym. Czas martwy może być zmieniony
przez zmianę szybkości przepływu, jednak wysokie ciśnienie zastosowane jako siła wyciskająca
roztwory poprzez mikser może spowodować zniszczenie próbki biologicznej. W nowoczesnych
aparatach czas martwy wynosi ok. 0,5 ms. To ustala praktyczny górny limit dla obserwowanej
stałej szybkości I-rzędu na poziomie ok. 2000 s-1, ponieważ w czasie 0,5 ms połowa reagentów
będzie przetworzona do produktów dla takiej stałej szybkości ( [ E ] = [ E0 ] exp − k obs t ). Dla stałej
szybkości II-rzędu (lub wyższych) maksymalna obserwowana wartość stałej szybkości zależy od
stężenia reagentów. Na przykład obserwowana stała szybkości pseudo-I-rzędu dla prostej reakcji
asocjacji jest zależna od II-rzędowej stałej szybkości asocjacji, stężenia reagenta będącego w
nadmiarze i I-rzędowej stałej szybkości dysocjacji. Pomiar metodą zatrzymanego przepływu
można prowadzić nawet przez kilka minut. Objętość roztworów reagentów potrzebna do
wykonania pojedynczego pomiaru wynosi tylko 100 - 400 µL.
Drugim, obok czasu martwego, ograniczeniem spektroskopii zatrzymanego przepływu jest
robocze stężenie substratu, podyktowane przez współczynnik ekstynkcji i wydajność kwantową.
Zarówno stężenie enzymu jak i substratu, lub po prostu regentów jeśli badana reakcja nie jest
enzymatyczna, musi być wystarczająco wysokie żeby zaobserwować mierzalny sygnał, ale
całkowite stężenie próbki musi być na tyle niskie żeby nie zakłócać obserwowanego sygnału
fluorescencji i absorbancji (przez efekt filtra wewnętrznego czy odchylenia od prawa LambertBeer). Długość drogi optycznej w nowoczesnych aparatach jest zmienna w granicach 0,2 - 2,5 cm
co umożliwia pewną elastyczność w planowaniu doświadczeń. Ponadto uśrednianie kilku
przebiegów czasowych znacząco zwiększa stosunek sygnału do szumu. Chociaż często sygnał
fluorescencji jest bardziej czuły niż sygnał absorbancji ten pierwszy sposób pomiaru obciążony
jest wadą polegającą na trudnościach w uzyskaniu stechiometrycznych danych dla amplitudy.
Interpretacja sygnału optycznego może być trudna szczególnie w przypadku zmian fluorescencji
ponieważ współczynniki ekscytacji czy wydajności kwantowe dla związków przejściowych
zwykle są nieznane a obserwowane zmiany mogą być wynikiem wieloetapowych przemian
chemicznych.
Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia jest zbadanie kinetyki hydrolizy syntetycznego oligopeptydu przez
chymotrypsynę.
Wykonanie ćwiczenia:
Stężony 50mM roztwór substratu: N-bursztynylo-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroaniliny w DMSO
(dimetylosulfotleku) rozcieńczyć buforem do żądanego stężenia 25 µM. Przygotować 5 µM
roztwór chymotrypsyny w tym samym buforze.
10
Pomiar polega na rejestracji przyrostu absorbancji przy długości fali 410 nm w czasie
(uwalniający się pierwszy produkt reakcji ma żółtą barwę). Należy wykonać uśrednienie co
najmniej 8 przebiegów czasowych a następnie uśrednioną krzywą kinetyczną zanalizować.
Przeliczyć absorbancję na stężenie p-nitroaniliny, korzystając z prawa Lamberta-Beera. Molowy
współczynnik absorpcji przy 410 nm wynosi 8900 M-1cm-1, długości drogi optycznej 1.0 cm.
Wymagany materiał:
1. Szczegółowy mechanizm katalitycznego działania chymotrypsyny
2. Kinetyka reakcji chemicznych w tym definicja rzędu reakcji, postać funkcji dla reakcji
zerowego I i II rzędu.
3. Szczegółowo kinetyka enzymatyczna stanu stacjonarnego
4. Zasada pomiaru kinetyki szybkich reakcji za pomocą techniki zatrzymanego przepływu
(stopped-flow).
5. Rodzaje reakcji wielosubstratowych
6. Znajomość instrukcji
Literatura:
Biochemia Styer
Wykłady z biochemii fizycznej
Fersht A. 1999 Structure and mechanism in protein science. A guide to enzyme catalysis and
protein folding. W.H.Freedman and Company, New York
Wykonanie sprawozdania:
1.
2.
3.
4.
Opisać wykonanie ćwiczenia
Przedstawić dane pomiarowe w formie zależności [P1]/[E0] od czasu.
Do otrzymanej krzywej dopasować funkcję matematyczną (5)
Sprawdzić wartość amplitudy procesu burst i w zależności od wyniku wyznaczyć stałe
szybkość poszczególnych etapów reakcji
5. Zinterpretować uzyskane wyniki.
11
12