Monoclonal Mouse

MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human CD41/FITC
Anti-Human CD34/RPE
Anti-Human CD61/APC
Nr kat. TC687
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Odczynnik TC687 przeznaczony jest do stosowania w cytometrii przepływowej. Odczynnik służy do identyfikacji
płytek krwi wykazujących ekspresję CD41, CD61 i CD34.
CD41 i CD61 to wybiórcze markery płytek i prekursorów płytek krwi, mogące mieć znaczenie w
immunofenotypowaniu białaczek megakarioblastycznych (1, 2). Kompleks CD41/CD61 pojawia się na
wczesnym etapie dojrzewania megakariocytów (3). Aktywny kompleks CD41/CD61 jest receptorem czynnika
von Willebranda, rozpuszczalnego fibrynogenu i fibronektyny i pełni kluczową rolę w aktywacji i agregacji płytek
krwi (1, 2, 4).
Antygen CD34 występuje w ludzkich prekursorach komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym i krwi. Dla
kontrastu, antygen CD34 normalnie nie jest wykrywany w leukocytach i płytkach krwi obwodowej (5). Ekspresja
CD34 zachodzi w około 60% ostrych białaczek limfoidalnych limfocytów B, 40% ostrych białaczek szpikowych i
w 1% do 5% ostrych białaczek limfoidalnych limfocytów T (5). Stwierdzono, że chroniczne białaczki limfoidalne,
chłoniaki i szpiczaki mnogie nie wykazują ekspresji CD34 (5, 6).
Interpretacji wyniku — z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz wyników innych metod diagnostycznych —
powinien dokonać wykwalifikowany patolog.
Dostarczany odczynnik
TC687 składa się z trzech specjalnie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych:
Monoclonal Mouse Anti-Human CD41, klon 5B12, sprzężone z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD34, klon BIRMA-K3, sprzężone z R-fikoerytryną (RPE).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD61, Platelet Glycoprotein IIIa, klon Y2/51, sprzężone z allofikocyjaniną
(APC).
Trzy koniugaty wchodzące w skład odczynnika TC687 zostały wytworzone z oczyszczonych monoklonalnych
przeciwciał mysich należących do izotypów IgG1, kappa (anty-CD41), IgG1, kappa (anty-CD34) i IgG1, kappa
(anty-CD61). Odczynnik TC687 dostarczany jest w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy
surowicy wołowej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Każda fiolka zawiera koniugat na 50 testów (20 µL
koniugatu dla leukocytów, w ilości do 106, z prawidłowej ludzkiej krwi obwodowej).
Swoistość
Przeciwciała Anti-CD41, 5B12 opisano podczas warsztatów Fifth International Workshop and Conference on
Human Leucocyte Differentiation Antigens (5. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów
różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD41 została potwierdzona przez wiele laboratoriów.
Klon błędnie opisano jako SB12 (7).
Przeciwciała anty-CD34, BIRMA-K3, opisano podczas warsztatów Sixth International Workshop and
Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (6. międzynarodowe warsztaty i konferencja na
temat antygenów różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD34 i epitopem klasy III została
potwierdzona przez różne laboratoria (8). W cytometrii przepływowej przeciwciało znakuje komórki KG-1a
(prymitywna linia białaczki szpikowej wykazująca ekspresję CD34) (9).
Przeciwciała anty-CD61, Y2/51, opisano podczas warsztatów Fourth International Workshop and Conference
on Human Leucocyte Differentiation Antigens (4. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów
różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD61 została potwierdzona przez wiele laboratoriów
(10).
Przeciwciała anty-CD61 umożliwiają wykrycie płytek w krwi obwodowej i szpiku kostnym a także reagują z
megakariocytami (11).
Środki ostrożności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z
ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć
gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
Przechowywanie
(113760-002)
Przechowywać w ciemności, w temperaturze 2–8 °C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na
opakowaniu. Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na ulotce dołączanej do
opakowania, Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o
niestabilności tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów należy
wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie
można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z odczynnikiem, należy
się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
TC687/PL/SSA/22.08.05 str. 1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Wykonanie odczynu
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej o
wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 20 µL TC687 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
3.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub przez 15–30 minut w
temperaturze pokojowej (20–25 °C).
4.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym
pomieszczeniu.
5.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym
pomieszczeniu.
6.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
7.
Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę za pomocą mieszadła
wibracyjnego.
8.
Powtórzyć etap 6.
9.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
10.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności i
temperaturze 2–8 °C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie wykonywania
odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne w
celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą
się zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone
indywidualnie w każdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do izotypów i fluorochromów sprzężonego przeciwciała. Zalecanym trójbarwnym odczynnikiem
kontrolnym dla TC687 jest odczynnik Dako o numerze kat. X0978.
Etapy 4 i 5: Jeśli używany jest inny odczynnik do lizy komórek, należy przy jego doborze kierować się
poniższymi zaleceniami. Należy zauważyć, że jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza (np.
Dako EasyLyse™, nr kat. S2364), PBS w kroku 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba że próbka
zostanie przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 10: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej liczby komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca ekspresji
antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru. Dzięki
minimalnemu nakładaniu się pasm emisyjnych fluorochromów FITC, RPE i APC, ich połączenie umożliwia
wyjątkowo łatwą analizę.
Ograniczenia swoiste
W przypadku użycia TC687 w procedurze lizy Dako tworzą agregaty płytkowo-leukocytowe (PLA).
dla opisywanego produktu
Przy zastosowaniu procedury lizy Dako EasyLyseTM może dojść do występowania wysokich
poziomów
PLA. Poziom PLA można ograniczyć, przeprowadzając lizę przed dodaniem TC687 lub natychmiast utrwalając
próbkę,
a
następnie
przeprowadzając procedurę bez lizy i płukania (12).
Piśmiennictwo
(113760-002)
1.
van Dongen JJM, Adriaansen HJ. Immunobiology of leukemia. In: Henderson ES, Lister TA, Greaves
MF, editors. Leukemia. Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo: WB Saunders
Company; 1996. p. 83-130.
2.
Sun QH, Newman PJ. CD Guide. CD61. In: Mason D, André P, Bensussan A, Buckley C, Civin C, Clark
E, et al., editors. Leucocyte typing VII. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 7th
International Workshop and Conference; 2000 Jun 19-23; Harrogate, United Kingdom. New York: Oxford
University Press Inc.; 2002. p. 810.
3.
Vinci G, Tabilio A, Deschamps JF, van Haeke D, Henri A, Guichard J, et al. Immunological study of in
vitro maturation of human megakaryocytes. Br J Haematol 1984;56:589-605.
4.
Nachman RL, Leung LLK. Complex formation of platelet membrane glycoproteins IIb and IIIa with
fibrinogen. J Clin Invest 1982;69:263-9.
5.
Civin CI, Trischmann TM, Fackler MJ, Bernstein ID, Bühring HJ, Campos L, et al. M7.1. Report on the
CD34 cluster workshop. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, et al.,
editors. Leukocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th International
Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford
University Press; 1989. p. 818-25.
6.
Campos L, Guyotat D, Archimbaud E, Devaux Y, Treille D, Larese A, et al. Surface marker expression in
adult acute myeloid leukaemia: correlations with initial characteristics, morphology and response to
therapy. Br J Haematol 1989;72:161-6.
TC687/PL/SSA/22.08.05 str. 2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
7.
Honda S, Felding-Habermann B, Loftus J, Annis D, Kunicki TJ. CD41/CD61 cluster workshop report:
localization of epitopes on integrins IIb 3 (CD41/CD61) and v 3 (CD51/CD61). In: Schlossman SF,
Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leucocyte typing V. White cell
differentiation antigens. Proceedings of the 5th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7;
Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1995. p. 1293-8.
8.
Nishio H, Tada J, Hashiyama M, Hirn J, Ingles-Esteve J, Suda T. MC7. CD34 workshop panel report. In:
Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors.
Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop
and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p.
974-84.
9.
Höffkes H-G, Lowe JA, Pedersen RO, Schmidkte G, McDonald DF. BIRMA-K3, a new monoclonal
antibody for CD34 immunophenotyping and stem and progenitor cell assay. J Hematother 1996;5:261-70.
10.
von dem Borne AEG, Modderman PW, Admiraal LG, Nieuwenhuis HK. Joint report of the platelet section.
P1: Platelets antibodies, the overall results. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE,
Stein H, et al., editors. Leucocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th
International Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo:
Oxford University Press; 1989. p. 951-66.
11.
Gatter KC, Cordell JL, Turley H, Heryet A, Kieffer N, Anstee DJ, et al. The immunohistological detection
of platelets, megakaryocytes and thrombi in routinely processed specimens. Histopathology 1988;13:25767.
12.
Hagberg IA, Lyberg T. Evaluation of circulating platelet-leukocyte conjugates: a sensitive flow cytometric
assay well suited for clinical studies. Platelets 2000;11:151-60.
Explanation of symbols
(113760-002)
Catalogue number
Temperature limitation
Use by
In vitro diagnostic medical
device
Keep away from sunlight
(consult storage section)
Manufacturer
Consult instructions for use
Batch code
TC687/PL/SSA/22.08.05 str. 3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17