Wielki przełom w badaniach nad rakiem,MikroRNA w terapii
Transkrypt
Wielki przełom w badaniach nad rakiem,MikroRNA w terapii
Wielki przełom w badaniach nad rakiem Wielki przełom w badaniach nad rakiem. Badacze pracujący nad szczepionką przeciwko malarii ‘przy okazji’ dokonali przełomowego odkrycia, które bez wątpienia przyczyni się do opracowania nowych sposobów leczenia raka. Skonstruowano białko, które skoniugowane z toksynami ma zdolność leczenia aż 90% nowotworów złośliwych u myszy. Badacze z grupy prof. Ali Salanti z uniwersytetu w Kopenhadze we współpracy z badaczami kanadyjskimi z UBC, badając zachowanie zarodźców malarii w organizmach ciężarnych kobiet, dokonali bardzo ciekawego odkrycia. Udowodnili oni, że Plasmodium falciparum modyfikuje zakażone erytrocyty w taki sposób, aby prezentowały malaryczne białko VAR2CSA, które wiąże się z rodzajem siarczanu chondroityny (CS), który w warunkach fizjologicznych wykazuje ekspresję wyłącznie w łożysku. To przypadkowe odkrycie, okazało się wielkim przełomem, gdy badacze odkryli analogiczną modyfikację CS w…. wysokim odsetku komórek nowotworowych. Dzięki temu odkryciu autorzy publikacji udowodnili, że zmodyfikowany CS może być celem molekularnym dla rekombinowanego białka VAR2CSA (rVAR2). W połączeniu z lekami, białko rVAR2 bardzo sprawnie lokalizuje komórki nowotworowe. Efektem tego było zaobserwowane u myszy silne hamowanie proliferacji komórek nowotworowych, zarówno w guzach nowotworowych, jak i w przerzutach. Duńscy i kanadyjscy badacze testowali tysiące próbek – obiecujący efekt terapeutyczny zaobserwowano w 90% typów nowotworów złośliwych u myszy – były wśród guzy mózgu, różne typy białaczki, chłoniaki, nowotwory kości. Wielki przełom w badaniach nad rakiem źródło wikimedia commons/własny fotomontaż Między innymi, leczenie przetestowano na myszach, którym wszczepiono trzy typy nowotworów człowieka. W przypadku chłoniaka nieziarniczego, guzy myszy leczonych były o 75% mniejsze niż w grupie kontrolnej. W przypadku raka prostaty – guzy nowotworowe całkowicie zniknęły u dwóch z sześciu leczonych myszy w miesiąc po otrzymaniu pierwszej dawki. W przypadku przerzutów do kości –pięć z sześciu leczonych myszy żyło aż po ośmiu tygodniach, gdy tymczasem, żadna z nieleczonych myszy z grupy kontrolnej w tym czasie już nie żyła. Testy z udziałem ludzi planowane są do dwóch lat. Z oczywistych powodów leczenie nie będzie dostępne w przypadku kobiet ciężarnych. Onformacja źródłowa: http://news.ku.dk/all_news/2015/10/malaria-vaccine-provides-hope-for-a-general-c ure-for-cancer/ Publikacja: Salanti et al. Targeting Human Cancer by a Glycosaminoglycan Binding Malaria Protein http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610815003347 MikroRNA w terapii nowotworów (II) — o miRNA i nowotworzeniu MikroRNA spełniają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów. Następstwa nieprawidłowej specyficznej ekspresji tych cząstek odgrywają niebagatelną rolę w patogenezie wielu chorób serca, chorób immunologicznych oraz, co jest szczególnie interesujące — nowotworów. Warto zatem przyjrzeć się im bliżej. Rola w procesie nowotworzenia Ponieważ mikroRNA bierze udział w wielu bardzo istotnych dla komórek organizmu procesach-ich namnażaniu, różnicowaniu oraz apoptozie, nieprawidłowości w jego działaniu nie pozostają obojętne dla całego organizmu. [2] Badacze sądzą obecnie, że mogą one odgrywać istotną rolę w inicjacji i rozwoju chorób nowotworowych. Co powoduje rozwój nowotworu? Z jednej strony może to być uaktywnienie genów onkogennych, z drugiej zaś wyciszenie genów supresorowych. W pierwszej sytuacji uczestniczyć mogą mikroRNA, których geny uległy delecji lub wyciszeniu. [2]. Jeśli odpowiadają one za regulację protoonkogenów, może podówczas wystąpić efekt onkogenny. W drugim przypadku przyczyną nowotworzenia jest stan rzeczy, w którym mamy do czynienia z amplifikacją lub wzrostem ekspresji mikroRNA odpowiadającego za regulację ekspresji genu supresorowego. Tutaj warto zapoznać się z pojęciem onkomirów, czyli mikroRNA funkcjonujących jako onkogeny lub geny supresorowe. Jak sytuacja wygląda w praktyce? Znanych jest obecnie szereg schorzeń nowotworowych, w których powstawaniu i rozwoju mikroRNA ma swój niebagatelny udział.[2] Pierwsze doniesienie tego typu dotyczyło badanie przewlekłej białaczki limfatycznej. Kolejne nowotwory, których występowanie ma związek ze zmianami w ekspresji mikroRNA to chłoniak Burkitta, chłoniak Hodgkina oraz rozlane chłoniaki z dużych limfocytów B. [1] Badania w tej dziedzinie nadal trwają. Obecnie sądzi się, że zmienione mikroRNA występuje w każdym rodzaju nowotworu. Dwa oblicza małej cząsteczki — istota tkwi w szczegółach Ze względu na unikatowy dla każdego guza profil ekspresji mikroRNA oraz brak skomplikowanych modyfikacji transkrypcyjnych i translacyjnych w stosunku do mRNA i białek, zastosowanie mikroRNA jako biomarkerów ma duży potencjał. Za przykład może tu posłużyć analiza regionu chromosomowego 13q14. U ponad połowy wszystkich pacjentów cierpiących na B-komórkową przewlekłą białaczkę limfatyczną region ten ulega delecji. Stwierdzono, że u ok. 68% pacjentów mikroR‐15a oraz mikroR‐16a były w związku z tym nieobecne albo ich ilość uległa zmniejszeniu. Jedne z pierwszych badań dotyczących mikroRNA w guzach litych wykazały różnice w ekspresji tych cząstek w przypadku gruczolaka okrężnicy oraz w prawidłowych komórkach błony śluzowej. Również poziom mikroR-143 i miroR-145 były znacznie niższe w przypadku guza niż normalnych komórek. Inne badania wykazały specyficzne sygnatury ekspresji mikroRNA w przypadku takich nowotworów jak: rak piersi, pierwotny glejak, rak wątrobowokomórkowy, rak brodawkowaty tarczycy oraz rak płuc. W badaniach przeprowadzonych na 540 próbkach sześciu nowotworów (płuc, żołądka, piersi, trzustki oraz jelita grubego) stwierdzono różnicę w regulacji aż 43 rodzajów mikroRNA w porównaniu do normalnych tkanek. Z kolejnych badań wyłaniał się obraz coraz rozleglejszego udziału mikroRNA w patogenezie nowotworów. I tak na przykład badanie 48 mikroRNA pozwoliło także z ponad 90% dokładnością sklasyfikować raka z przerzutami z nieznanego ogniska. Następnym krokiem badaczy było ustalenie wpływu mikroRNA na nowotwór. Coraz więcej dowodów wykazało, że miRNA mogą działać jako onkogeny lub geny supresorowe guza.Dla przykładu — mikroR-21 regulujące ważne supresory genów takie jak PTEN 41 oraz PDCD4, jest pobudzane w różnych guzach litych a także nowotworach układu krwiotwórczego, uznaje się je za potencjalnie onkogenne. Jednocześnie kolejne badania pokazały, że pierwotna klasyfikacja mikroRNA jako onkogenów albo genów supresorowych nie do końca była trafna. Diabeł, jak zwykle, tkwi w szczegółach — w zależności od typu nowotworu i rodzaju komórek te małe cząsteczki RNA mogą funkcjonować zarówno jako onkogeny jaki i geny supresorowe nowotworów. Przykładem może tu być mikroRNA znany jako mikroR- 125b.[1] W przypadku płaskonabłonkowego raka jajników, tarczycy oraz jamy ustnej występuje on w zmniejszonej ilości. Wykazano jego wpływ na hamowanie proliferacji komórek i progresję cyklu komórkowego. Natomiast w przypadku raka prostaty cząsteczka ta sprzyjała proliferacji i inwazji komórek nowotworowych. Szansa na postęp w diagnostyce i leczeniu Coraz pełniejsza wiedza na temat roli mikroRNA w procesach chorobowych stanowi punkt wyjścia dla badań dotyczących terapeutycznego wykorzystania tych małych cząsteczek — zarówno jako leków, jak i celów w terapii. Jednym z głównych nurtów w dziedzinie zastosowania mikroRNA w leczeniu jest próba uzyskania wpływu na ekspresję białek. Wiele doniesień wskazuje, że możliwa jest pośrednia modyfikacja ekspresji białek odgrywających ważną rolę w patogenezie różnych chorób, także nowotworów dzięki wykorzystaniu mikroRNA. Tak na przykład wprowadzenie do mikroRNA-125b mutacji typu knockdown skutkuje ograniczeniem proliferacji linii komórkowych raka prostaty PC-3 a także komórek raka szyjki macicy HeLa. Badacze już syntezują sztuczne (ang. artificial) mikroRNA, które jest komplementarne do mRNA określonego genu. Ich rolą jest wyciszenie ekspresji genu odgrywającego ważną rolę w rozwoju lub progresji danej choroby. Podjęto próbętransfekcji plazmidu pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRbased zawierającego sztucznie zaprojektowany pre-mikroRNA przeciwko receptorowi chemokinowemu CXCR4 do hodowli komórek raka piersi MDAMB-231. W efekcie uzyskano obniżenie ekspresji CXCR4 o blisko 100% i w związku z tym, zahamowanie migracji komórek nowotworowych. Inną strategią jest zastosowanie tak zwanych antagomirów — syntetycznych oligonukleotydów komplementarnych do określonego mikroRNA (inne określenie to oligonukleotyd anty-mikroRNA, AMO). Leczenie tego typu miałoby polegać na pośredniej modyfikacji aktywności określonych białek, przez wyciszenie genów mikroRNA które regulują ich ekspresję. Co z tego wynika? MikroRNA niewątpliwie rokują duże nadzieje w terapii nowotworów. Zrozumienie roli jaką odgrywają w patogenezie tych chorób pozwoli na lepszą, szybszą diagnostykę, a także skuteczniejsze leczenia. Liczba badań i publikacji dotyczących tych małych cząstek już na chwilę obecną jest ogromna. Kolejne doniesienia stale się pojawiają. Na zainteresowanego tematem czeka zatem literatura ogromna i bogata. Być może niniejszy krótki zarys zachęci niejednego czytelnika do bliższego przyjrzenia się mikroRNA — małym cząsteczkom o naprawdę dużym znaczeniu. Olga Andrzejczak Literatura Ciepłucha A. et. al., Perspektywy zastosowania mikroRNA w leczeniu nowotworów, „Acta Haematologica Polonica”, vol. 38 (2007) s. 425–435. Cortez M. A. et. al., MicroRNAs in body fluids — the mix of hormones and biomarkers, „Nature Reviews Clinical Oncology”, vol. 8 (2011), s. 467-477. Majorek K., Krzyżosiak W., Rola mikroRNA w patogenezie, diagnostyce i terapii nowotworów, „Współczesna Onkologia”, vol. 10 (2006), s. 359–366. Wielki przełom w badaniach nad rakiem źródło wikimedia commons/własny fotomontaż MikroRNA w terapii nowotworów (I) — małe cząsteczki o wielkim znaczeniu Był rok 1993. Zespoły Victora Ambrosa oraz Gary’ego Ruvkuna badając nicienia Caenorhabditis elegans, modelowy organizm współczesnej genetyki i nauk biologicznych odkryły, że ilość białka o symbolu LIN14 regulowana jest przez małe RNA, kodowane przez gen o nazwie lin-4[1]. Ich odkrycia zwiastowały prowadzenie badań nad mikroRNA na szeroką skalę. MikroRNA to krótkie (20 – 23 nukleotydowe), jednoniciowe, niekodujące cząsteczki RNA. [2] Dotychczasowe badania pozwalają sądzić, że w organizmie człowieka występuje ok. 1000 genów kodujących mikroRNA. Ta ilość reguluje około 30% ludzkich genów. Szacuje się obecnie, że 70% genów mikroRNA znajduje się w obszarze egzonów oraz/ lub intronów innych genów. 30% zlokalizowane jest w sekwencjach niekodujących. Narodziny cząsteczki — jak powstaje mikroRNA? Geny mikroRNA można znaleźć zarówno w intronach, egzonach, jak również pomiędzy genami odpowiedzialnymi za kodowanie białka lub niekodującego RNA. [3] Stąd traskrybowane są przez polimerazę II RNA. Generuje ona jednak nie „gotowe” cząsteczki, lecz ich prekursory zwane pri-mikroRNA. Zawierają one fragmenty przypominające kształtem nieregularną, wydłużoną spinkę (około 70 nukleotydów długości). Następnie ma miejsce dojrzewanie mikroRNA. Jest ono dwuetapowe i przebiega z udziałem rybonukleaz Drosha i Dicer, zaliczanych do rodziny RNaz III.[3] Pierwszy etap, przycinanie pri-mikroRNA do pre-mikroRNA przebiega w jądrze komórkowym. Przeprowadza go kompleks Mikroprocesora, w skład którego wchodzą Drosha oraz białko DGCR8. Następnie, z pomocą Eksportyny-5 zachodzi transport utworzonej w ten sposób cząsteczki poprzez pory jądrowe do cytoplazmy, gdzie ma miejsce II etap dojrzewania. W jego efekcie wytwarzany jest dupleks mikroRNA/mikroRNA*. Aby powstał, do akcji wkracza rybonukleaza Dicer. Zazwyczaj występuje ona w kompleksie z białkiem Argonaute (popularnie nazywanym Argo) oraz TRBO i/lub PACT. Białka te pozostają także w składzie aktywnego kompleksu odpowiedzialnego za wyciszanie ekspresji genów. MikroRNA funkcjonują w kompleksie rybonukleoproteinowym o nazwie miRISC (ang. microRNA induced silencing complex). [3] Zależnie od stopnia w jakim sekwencja mikroRNA jest komplementarna do miejsca jego wiązania w mRNA a także rodzaju białka Ago wchodzącego w skład miRISC, może on prowadzić do nukleolitycznego przecięcia mRNA albo represji jego translacji. Warto zauważyć, że większość zwierzęcych mikroRNA posiada zdolność wiązania się z minimum kilkoma częściowo komplementarnymi miejscami, które występują zwykle w 3’UTR. [3] Ich działanie jest kooperatywne, w efekcie czego następuje inhibicja syntezy białka. Poziom transkryptu zazwyczaj się wtedy nie zmienia. Następnie regulowane transkrypty są transportowane do tzw. ciałek P — miejsc ich przechowywania i/lub degradacji. Małe cząsteczki o wielkim znaczeniu MikroRNA pełni szereg istotnych funkcji, uczestnicząc w regulacji wielu ważnych procesów biologicznych. Według różnych badań różnego rodzaju cząsteczki mikroRNA biorą udział w kontroli proliferacji komórki — czyli jej namnażania, a także różnicowania, apoptozy, w metabolizmie tłuszczów, sekrecji insuliny oraz procesach hematopoezy. [2] Wspomniane już mikroRNA lin-4 stanowi najlepiej poznany przykładem czynności mikroRNA. Ulega on ekspresji w pierwszym stadium larwalnym L1 Caenorhabditis elegans. Cząsteczka ta odpowiada za inhibicję ekspresji genów lin-14 oraz lin-28, będących regulatorami wczesnych stadiów rozwojowych nicienia. Jego mutacja skutkuje powtórzeniem podziałów z pierwszego stadium larwalnego zamiast różnicowania komórek. Jakie są inne przykłady działalności tych małych cząsteczek? MikroRNA-15a uczestniczy w regulacji apoptozy, jednej z rodzajów śmierci komórki, działając na gen BCL-2, mikroRNA-221 bierze udział w regulacji erytropoezy, czyli procesów namnażania i różnicowania czerwonych ciałek krwi, mikroRNA-27 reguluje metabolizm ksenobiotyków działając na gen CYP1B, natomiast mikroRNA-375 wpływa na sekrecję insuliny oddziałując na gen o symbolu MTPN .[2] Olga Andrzejczak Wielki przełom w badaniach nad rakiem źródło wikimedia commons/własny fotomontaż Literatura 1. MicroRNAs in body fluids—the mix of hormones and biomarkers; Cortez M. A. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 467–477 (2011) 2. Perspektywy zastosowania mikroRNA w leczeniu nowotworów; Ciepłucha A. i wsp.; Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 4, str. 425–435 3. Rola mikroRNA w patogenezie, diagnostyce i terapii nowotworów; Majorek K., Krzyżosiak W.;Współczesna Onkologia (2006) vol. 10; 8 (359–366) Pakiet onkologiczny. Ministerstwo rozpoczęło prace nad zmianami. Ministerstwo Zdrowia rozpoczęło prace nad zmianami w pakiecie onkologicznym. Jak podał rzecznik resortu Krzysztof Bąk przygotowywana jest m.in. nowelizacja rozporządzenia w sprawie świadczeń gwarantowanych z zakresu leczenia szpitalnego. Przygotowano już projekt rozporządzenia w sprawie wzoru karty diagnostyki i leczenia onkologicznego. Zmiany pozwolą na leczenie łagodnych nowotworów centralnego układu nerwowego, niektórych nowotworów układu krwiotwórczego i chłonnego w ramach szybkiej terapii onkologicznej. O 20 proc. zwiększyć ma się też stawka dla placówek AOS, jeśli będą one diagnozować pacjentów w ciągu siedmiu tygodni. Zmiany zakładają też m.in. dopuszczenie nowych świadczeniodawców w pakiecie w drodze konkursów uzupełniających, stworzenie możliwości finansowania badania PET poza stawką ryczałtową, stworzenie nowych pakietów diagnostycznych, rozszerzenie listy świadczeń szpitalnych, które będą stosowane bez limitu, np. radioterapii paliatywnej oraz usprawnienie systemu informacyjnego kart diagnostyki i leczenia onkologicznego np. poprzez możliwość wypełniania kart w ciągu 3 dni od wizyty. Rozporządzenia te są obecnie na etapie uzgodnień wewnętrznych w resorcie zdrowia, następnym etapem będą konsultacje publiczne, po których zostaną wprowadzone w życie. Wielki przełom w badaniach nad rakiem źródło wikimedia commons/własny fotomontaż BASTION – konferencja onkologiczna – 21-22 maja 2015 W dniach 21-22 maja 2015 roku, na Warszawskim Uniwersytecie Medycznym odbędzie się międzynarodowa konferencja onkologiczna organizowana w ramach europejskiego programu BASTION . Podczas pierwszego dnia konferencji czołowi europejscy naukowcy zajmujący się onkologią będą mówić o postępach w badaniach. Drugi dzień konferencji zostanie poświęcony innowacjom w medycynie oraz wdrożeniom odkryć nauki do praktyki. Wybitni naukowcy, którzy osiągnęli komercyjny sukces swoich badań naukowych będą dzielić się doświadczeniami w zakresie ochrony własności intelektualnej czy komercjalizacji wyników. Reprezentanci firm farmaceutycznych będą uczyć naukowców, jak znaleźć wspólny język z businessem, a reprezentanci agencji finansujących naukę powiedzą o możliwościach zdobycia grantów na badania onkologiczne. Więcej: http://www.tron.wum.edu.pl/ Program: http://www.tron.wum.edu.pl/autoinstalator/joomla9/program Wielki przełom w badaniach nad rakiem źródło wikimedia commons/własny fotomontaż Technika MLPA: cytogenetyką a molekularną między biologią Nazywana potocznie „małpą” technika MLPA (ang. Multiplex Ligationdependent Probe Amplification) nie jest ani tak znana jak SSCP, ani tak popularna jak RFLP, ani tak sławna jak FISH. Jest za to równie elastyczna jak wszystkie wymienione metody razem wzięte i pozwala na detekcję małych i większych mutacji, jak również rearanżację chromosomowych naraz. Ani rutynowa cytogenetyka ani tradycyjna diagnostyka molekularna nie oferuje tak szybkiego i zgrabnego screeningu jak MLPA, a mimo to nie jest to powszechnie stosowana w diagnostyce metoda. Może jednak warto przyjrzeć się jej bliżej? MLPA powstała jako odpowiedź na pytanie: czy da się podczas jednej reakcji PCR zamplifikować więcej niż 10 amplikonów? Każdy, kto choć raz łączył PCR’y w multipleks wie, że przy tradycyjnym podejściu do zagadnienia jest to praktycznie niewykonalne. Ale jest sposób, który eliminuje konieczność mieszania >20 oligonukleotydowych starterów, by zamplifikować interesujące nas geny. Wystarczy użyć uniwersalnych adaptorów przed właściwą reakcją PCR. Dzięki temu jeden komplet starterów komplementarnych do sekwencji adaptorów zamplifikuje co nam się żywnie podoba! Mechanizm reakcji W MLPA wykorzystano dwie znane od dawna techniki, należące do kanonu biologii molekularnej: PCR oraz ligację DNA. Pierwszy etap reakcji polega na hy6brydyzacji sond połówkowych, częściowo komplementarnych do sekwencji docelowych naszego DNA, częściowo zaś niekomplementarnych. Obie połówki sond hybrydyzują dokładnie obok siebie na DNA, pozwalając na późniejszą ligację, natomiast sekwencje niekomplementarne zawierająna końcu tag wspólny dla wszystkich połówek (który stanie się po ligacji sekwencją przyłączającą starter) oraz tak zwany stuffer, niekomplementarny ciąg zasad DNA, którego jedyną funkcją jest wydłużenie sekwencji amplifikowanej później przez wspólne startery. Celem jest to, żeby każda sonda różniła się znacząco wielkością. Pozwoli to na rozdział elektroforetyczny zaplifikowanych sond. Po przyłączeniu sond połówkowych następuje ligacja obu połówek każdej z sond. Produktem ligacji jest zestaw sond o różnej sekwencji środka, różnej długości, ale o wspólnych sekwencjach końców. Nasz zestaw sond jest później poddawany amplifikacji w reakcji PCR, wykorzystującej pojedynczą parę starterów, komplementarną do sekwencji brzeżnych sond. Produkty amplifikacji rozdziela się z reguły kapilarnie, chociaż niektóre metodyki dopuszczają rozdział agarozowy (na przykład w screeningu mutacji dystrofiny, tak zwanym low-resolution MLPA). Żeby pomóc wam zrozumieć nietypowy i dość zawiły mechanizm reakcji zamieszczam poniżej rycinę, obrazującą przebieg MLPA. Niezbędne odczynniki i sprzęt MLPA nie wymaga bardzo zaawansowanego sprzętu, a odczynniki niezbędne do przeprowadzenia analizy (ligaza, bufor, sondy i startery, polimeraza i dNTP) są sprzedawane w zestawie przez laboratorium, w którym wynaleziono i udoskonalono technikę i to za stosunkowo niewielkie pieniądze. Do wszystkich analiz wymagany jest termocykler (nie ma chyba laboratorium molekularnego, które nie byłoby wyposażone w to urządzenie) a dodatkowo, do oznaczeń o wysokiej rozdzielczości, konieczny jest system do fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej. Brak tego kosztownego sprzętu nie stanowi jednak problemu nie do przeskoczenia dla małych laboratoriów — rozdział kapilarny wykonywany jest przez wiele firm i nie jest drogi (koszt poniżej 20 złotych za próbkę), więc technika MLPA jest osiągalna niemal dla każdego. Samodzielne przygotowanie testu w oparciu o MLPA? MRC Holland oferuje obecnie duży wybór zestawów do MLPA, które pokrywają większość zapotrzebowania dla diagnostyki i badań naukowych. Każdego naukowca kusi jednak perspektywa przygotowania własnego, skrojonego na miarę MLPA. Z jednej strony jest to bardzo atrakcyjna technika o wielkim potencjale, z drugiej jednak stanowi ogromne wyzwanie dla bioinformatyków i spory koszt poniesiony na przygotowanie sond połówkowych (amplifikacja w oparciu o wektory fagowe M13). W Polsce niewiele laboratoriów na to stać, a ryzyko, że metoda nie będzie chodzić, albo że połowa sond „wypadnie” z powodu konfliktów sterycznych i dimeryzacji jest znaczne. Nie oznacza to jednak, że nie warto podnieść rękawicy; należy jednak zastanowić się i przekalkulować, czy projektowanie własnego zestawu MLPA nam się opłaci. Nie tylko zalety Oprócz trudności w przygotowaniu własnej metodyki MLPA metoda ma inne wady, które zmniejszają jej użyteczność. Przede wszystkim MLPA rzadko wykrywa translokacje zrównoważone, nie nadaje się także do poszukiwania nieznanych mutacji. Wrażliwość na SNP w miejscu ligacji jest przydatna w analizie znanych mutacji, ale jest też piętą achillesową, bo obecność polimorfizmów pomiędzy sondami połówkowymi może być potraktowana jako (fałszywie) pozytywny wynik. Inny potencjalny problem to czystość DNA poddanego hybrydyzacji z sondami MLPA. Materiał musi być nienagannej jakości, by można było przeprowadzić reakcję. Dla cytogenetyków złą wiadomością będzie także ograniczenie możliwości identyfikacji rearanżacji chromosomowych do populacji komórek. Nie jesteśmy w stanie określić kariotypów poszczególnych komórek — wynik jest wypadkową wszystkich rearanżacji w pewnej ich populacji, więc nie mamy możliwości opisu materiału z taką dokładnością, z jaką ma to miejsce w cytogenetyce klasycznej. Zastosowania metody Gdzie MLPA ma zastosowanie? Metoda przeżywa swój renesans w diagnostyce prenatalnej i genetyce klinicznej, wspomagając analizę kariotypu i FISH w poszukiwaniu zespołów mikrodelecyjnych i insercji, które są nieuchwytne w badaniu chromosomów metafazalnych. Wiele metodyk jest także dedykowanych badaniom aberracji chromosomowych w onkologii i hematologii (istnieją panele dedykowane np. dla chłoniaków czy ostrych białaczek) oraz mutacji kojarzonych z wieloma zaburzeniami (EGFR w niedrobnokomórkowym raku płuca, BRCA1 i 2 w raku piersi). MLPA jest także w stanie zidentyfikować disomię jednorodzicielską (analiza profilu metylacji) jako przyczynę choroby oraz dać odpowiedź (w niektórych przypadkach) na pytanie o to dlaczego pary starające się o potomstwo nie mogą go począć. Wiele laboratoriów w Polsce ma już w swojej ofercie MLPA. Mimo pewnych słabości, ta metoda ma przyszłość ze względu na swoją prostotę i wyjątkową plastyczność. Na pewno warto rozważyć wypróbowanie jej w praktyce. Marzena Pieronkiewicz Źródło: MRC Holland. Postępy Biologii Komórki. Wielki przełom w badaniach nad rakiem źródło wikimedia commons/własny fotomontaż Krążące DNA nowotworowy jako marker Naukowcy z Uniwersytetu Stanford School of Medicine pracują nad nowatorską metodą wykrywania litych guzów nowotworowych przy pomocy badania krwi. Już wcześniej krążące DNA nowotworowe (ctDNA) pojawiło się jako obiecująca możliwość nieinwazyjnego wykrywania chorób nowotworowych. W artykule opublikowanym w Nature Medicine przeanalizowano zastosowanie pomiaru poziomu ctDNA u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC). NSCLC obejmuje zdecydowaną większość nowotworów tego narządu, w tym gruczolakoraka, raka płaskonabłonkowego i raka wielkokomórkowego. Nowotworowe DNA różni się od normalnego obecnością mutacji w sekwencji nukleotydów. Mutacje te powstają przypadkowo podczas podziału komórkowego i odpowiedzialne są między innymi za niekontrolowany wzrost komórek nowotworowych. Mutacje wtórne mogą być przyczyną powstawania oporności na leczenie przeciwnowotworowe. Komórki nowotworowe, gdy umierają uwalniają DNA do krwioobiegu. Nawet u pacjentów z zaawansowaną chorobą nowotworową, zdecydowana większość krążącego we krwi DNA pochodzi z komórek nie zmienionych nowotworowo. W celu wykrywania bardzo małych ilości ctDNA konieczne było zwiększenie czułości metody stosowanej do jego oznaczania. Wobec tego naukowcy opracowali metodę Capp-Seq – ultraczułą metodę sekwencjonowania nowotworowego DNA, która wykrywa 1 cząsteczkę ctDNA na 10000 nie zmienionych nowotworowo cząsteczek DNA. Wyzwaniem dla nauki jest znalezienie takich sekwencji DNA, których występowanie jest najbardziej prawdopodobne dla danego nowotworu. Dlatego zespół naukowców przeanalizował dane uzyskane od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc pod kątem charakterystycznych dla tego nowotworu mutacji, zebranych w atlasie genomów (The Cancer Genome Atlas). W pracy zbadano genom 407 pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc. Zidentyfikowano 139 genów, które są zmutowane w badanym nowotworze i które stanowią jedynie 0,004% ludzkiego genomu. ctDNA wykryto u blisko 50% pacjentów z rakiem płuc w I stadium zaawansowania choroby i u 100% w II-IV stadium choroby. Co więcej naukowcy wykazali silną korelację między ilością krążącego DNA nowotworowego, a przybliżoną objętością guza widocznego w badaniu obrazowym. Zespół naukowców obecnie opracowuje badanie kliniczne, oceniające zastosowanie Capp-Seq oraz dąży do rozszerzenia techniki dla innych typów nowotworów. Wielki przełom w badaniach nad rakiem źródło wikimedia commons/własny fotomontaż Opracowanie testu, który miałby możliwość szybkiego i nieinwazyjnego wykrywania niewielkich stężeń DNA, pochodzących z komórek nowotworowych byłby szansą nie tylko na monitorowanie leczenia i wielkości guza, ale również mógłby mieć szansę stać się podstawą przesiewowego wykrywania nowotworów. Piśmiennictwo: 1. Newman M.A., Bratman V.S., Diehn M. et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine, 2014 2. Conger K. Blood test could provide rapid, accurate method of detecting solid cancers, study finds. Stanford School of Medicine, 6 Apr 2014 Szansa na nowy test szacujący ryzyko przerzutów raka piersi Badacze z College’u Medycznego Alberta Einsteina na Yeshiva University opracowali nowoczesny test, pozwalający oszacować ryzyko przerzutów nowotworowych (metastaz) u kobiet dotkniętych nowotworem piersi. W porównaniu do istniejących już metod, które bazują na wykrywaniu różnic w ekspresji genów lub w poziomie białka związanego ze wzrostem komórek nowotworu, nowo opracowany test oparty jest na biologicznym mechanizmie wyjaśniającym sposób w jaki komórki nowotworowe atakują naczynia krwionośne. Dzięki specjalnej technologii obrazowania przyżyciowego zaobserwowano, że przerzuty z pierwotnego guza piersi inicjowane są poprzez tworzenie się specjalnego trójczłonowego kompleksu złożonego z komórki śródbłonkowej, okołonaczyniowej komórki makrofaga i komórki nowotworowej, produkującej w zwiększonej ilości białko Mena (ułatwiające metastazę). Miejsce, w którym te trzy komórki się łączą, jest miejscem o zwiększonym prawdopodobieństwie tworzenia przerzutu i nosi nazwę mikrośrodowiska nowotworowego (ang. tumor microenvironment of metastasis, TMEM) W badaniu klinicznym przeanalizowano próbki pobrane od 3760 pacjentów, u których zdiagnozowano inwazyjnego przewodowego raka piersi (ang. invasive ductal breast carcinoma) na przestrzeni 20 lat, tj. od 1980 do 2000 roku. Test diagnozujący miesjca TMEM przeprowadzono na na próbkach, pochodzących od 259 kobiet, u których pojawiły się przerzuty nowotworowe oraz na kontrolnej grupie kobiet, które nie posiadały odległych przerzutów. Sam test TMEM opracowano na podstawie kilkunastu różnych technik wizualizacji, które umożliwiły szczegółową analizę procesu powstawania przerzutów. Miejsca TMEM zostały określone za pomocą przeciwciał przeciwko komórkom biorącym udział w tworzeniu mikrośrodowiska nowotworowego, a następnie policzone przez patologów. Wyniki testu TMEM okazały się istotne statystycznie i wiarygodne w ocenie ryzyka metastatycznego w nowotworze raka piersi o charakterze ER+/HER2- (rak piersi z ekspresją receptorów estrogenowych i bez podwyższonej ilości białka HER2), który stanowi 60% zachorowalności na tego typu nowotwór. Co więcej, ryzyko metastaz oszacowano na 2,7 razy wyższe u kobiet, u których miejsca TMEM występują w zwiększonej ilości. Wielki przełom w badaniach nad rakiem źródło wikimedia commons/własny fotomontaż Nowocześnie opracowany test pozwoli zarówno na dokładniejsze, bardziej sprecyzowane leczenie, jak również na zredukowanie zastosowania poważniejszych, bardziej inwazyjnych metod leczenia we wczesnych stadiach raka piersi u kobiet. Choć dalsze badania są konieczne w celu potwierdzenia istotności testu, niewątpliwie naukowcy znaleźli nowy sposób na optymalizację wyboru metod leczenia. Adrianna Grzelak Piśmiennictwo: 1. Rohan TE. et al. Tumor Microenvironment of Metastasis and Risk of Distant Metastasis of Breast Cancer. JNCI J Natl Cancer Inst, 2014; 106, 8: 10. 2. New test predicts if breast cancer will spread. Science Daily, 3 June 2014. Bomba komórki rozbrojona? rakowej Nie jest nowością fakt, że rokrocznie na świecie odnotowuje się wzrastającą tendencję zachorowalności na raka. W samym 2012 roku zdiagnozowano aż 14,1 mln chorych na nowotwór. Rak czyni coraz większe spustoszenie. Naukowcy i lekarze biją na alarm aby doprowadzić do jak najwcześniejszego zdiagnozowania nowotworu oraz ulepszenia profilaktyki. Co jeśli jednak zachorujemy? Jakie mamy szanse? Najnowsze badania przeprowadzone przez brytyjskich naukowców w Cancer Research UK Cambridge Institute donoszą o rozpracowaniu struktury komórki rakowej guza litego. Badania przeprowadzono na komórkach rakowych trzustki. Nowotwór tego narządu jest specyficzny i w przeciwieństwie do innych litych guzów zastosowanie immunoterapii nie daje oczekiwanych rezultatów. Z tego też powodu środowiska naukowe poszukują innych metod walki z tym nowotworem. Celem badań było przyjrzenie się strukturze zewnętrznej komórki rakowej guza litego. Na jej powierzchni zidentyfikowano białko z rodziny cytokin – chemokinę CXCL12. Oplatając komórkę nowotworową, ochrania ona ją przed limfocytami T, których receptory CXCR4 rozpoznając tą chemokinę i łącząc się z nią nie mają możliwości dalszego wnikania w głąb obcej komórki. Postawiono hipotezę, iż pozbawienie komórek nowotworowych tarczy ochronnej w postaci otoczki CXCL12 umożliwiłoby organizmowi i limfocytom T samozwalczenie komórek rakowych. Do badań użyto obecnego już na rynku leku AMD3100, znanego pod nazwą Plerixaforu. Blokuje on receptory CXCR4 na powierzchni limfocytów T, dzięki czemu limfocyty pozostają obojętne wobec otoczki rakowej CXCL12 i są w stanie zaatakować modelową komórkę rakową trzustki z pełną siłą. Dzięki synergistycznemu działaniu z immunoterapeutycznym przeciwciałem anty – PD – L1, które zwiększa aktywność limfocytów T, zaobserwowano znaczącą redukcję liczby komórek rakowych i rozmiaru guza. Kontynuacja tej modelowej terapii zakończyła się sukcesem, gdyż w przeciągu tygodnia niemal wszystkie komórki rakowe zostały unieszkodliwione. Wielki przełom w badaniach nad rakiem źródło wikimedia commons/własny fotomontaż Podążając za słowami profesora Fearona – kierownika badań, metoda oparta na wykorzystaniu potencjału ludzkiego organizmu do samodzielnej konfrontacji z komórką rakową i jej zwalczeniu niewątpliwie w przyszłości może przyczynić się do polepszenia leczenia guzów litych. Adrianna Grzelak Piśmiennictwo: 1.International Agency for Research on Cancer, Latest world cancer statistics: Global cancer burden rises to 14.1 million new cases in 2012: Marked increase in breast cancers must be addressed,12 Dec 2013. 2.Fearon DT. et.al Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti–PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer, PNAS, 2013, 110, 50: 20212-20217. Polski „boom” na e-papierosy – czy faktycznie są lepszą alternatywą dla palaczy? Można pokusić się o stwierdzenie, że obecnie „panuje moda” na epapierosy. Na ulicach widać dziesiątki osób z tą nowoczesną alternatywą papierosa. Dlaczego stały się tak popularne? Czy są mniej szkodliwe niż tytoniowe papierosy? Kto i jak to sprawdził? Czy zostało to potwierdzone badaniami? Te i wiele innych wątpliwości budzi temat elektronicznych papierosów. E-papierosy to urządzenia dostarczające nikotyny, których rosnąca popularność może budzić obawy przed zmniejszeniem używania wyrobów tytoniowych. W ich skład wchodzi wymienny pojemnik na specjalny płyn tzw. liquid oraz atomizer, w którym płyn jest podgrzewany i zamienia się w parę. Chiński farmaceuta Hon Lik wynalazł to urządzenie w 2003 roku. Po raz pierwszy elektroniczny papieros został wprowadzony do sprzedaży w Chinach w 2004 roku. Najnowsze badania oceniają bezpieczeństwo stosowania oraz dowody popierające potencjalne korzyści płynące z zastąpienia tytoniowych papierosów e-papierosami. Kontrowersje budzi zawartość nikotyny w liquidzie oraz działanie substancji powstających po spalaniu liquidu. Okazuje się, że nie ma wystarczających dowodów na stwierdzenie, że e-papierosy powinny być używane jako środek terapeutyczny przy „rzucaniu” palenia. Owszem posiadają walory: nie pozostawiają popiołu, ubrania nie przesiąkają dymem, nie zawierają substancji smolistych, mają przyjemny smak i zapach. Autor pracy opublikowanej w Annals of Allergy, Asthma & Immunology podkreśla, że elektroniczne papierosy są używane od zbyt krótkiego czasu, aby określić czy istnieją odległe skutki zdrowotne z nimi związane. FDA przyznaje, że bezpieczeństwo oraz skuteczność e-papierosów nie została dostatecznie zbadana. Aktualnie na stronie FDA znajdują się zgłoszenia dotyczące niepożądanych zdarzeń związanych z e-papierosami takich jak zapalenie płuc, dezorientacja, drgawki, niedociśnienie czy zastoinowa niewydolność serca. Do tej pory nie dowiedziono związku używania elektronicznych papierosów z ww. zdarzeniami. Opary powstające po spalaniu liquidu zawierają nikotynę, ultradrobne cząstki, szkodliwe związki organiczne oraz inne toksyny. Jak dotąd zidentyfikowano obecność następujących związków: aldehyd octowy, benzen, kadm, formaldehyd, izopren, ołów, nikiel, nikotyna, N-nitrozonornikotyna, toluen. E-papierosy zawierają glikol propylenowy, który przy krótkim kontakcie powoduje podrażnienie oczu, gardła i dróg oddechowych, natomiast długofalowa ekspozycja może skutkować astmą u dzieci. W powstającym aerozolu wykryto także kancerogenne nitrozaminy. E-papierosy powodują powstanie ekspozycji na inne substancje niż w przypadku tytoniowych papierosów. W związku z powyższym, niezbędne są wnikliwe badania oceniające wpływ tych substancji na palaczy czynnych i biernych. Pomimo faktu, że elektroniczne papierosy nie są zaliczane do wyrobów tytoniowych, a tym samym nie podlegają ustawie o ochronie zdrowia, w niektórych miastach w Polsce wprowadzono już obostrzenia dotyczące używania e-papierosów w miejscach publicznych. W krajach takich jak Austria, Belgia, Kolumbia czy Indonezja zabroniono ich sprzedaży. W wielu państwach wprowadzono dwupoziomowy system pozwolenia na sprzedaż w zależności od tego czy zawierają nikotynę. Nadal nie wiemy czy i jakie są skutki uboczne stosowania e-papierosów. Uzyskanie argumentów przemawiających za ich korzystnym lub szkodliwym działaniem wymaga czasu. Dostarczanie nikotyny w jakikolwiek sposób, także w e-papierosach, jest mechanizmem narażenia na używki. Należy pamiętać, że powstający aerozol to nie czysta para wodna, a wdychanie substancji drażniących wpływa na organizm w bardziej lub mniej szkodliwy sposób. Piśmiennictwo: Nickels AS. et al. Electronic cigarettes: navigating the vapor. Annals of Allergy, Asthma & Immunology, 11 Apr 2014. ANR. Electronic (e-) Cigarettes and Secondhand Aerosol. Americans for Nonsmokers’ Rights, 2014. FDA fact sheet E-cigarette politics, 10 Mar 2014.