Anita Rywińska, Marta Utecht

Acta Sci. Pol., Biotechnologia 14 (1) 2015, 17-32
ISSN 1644–065X (print) ISSN 2083–8654 (on-line)
DOSKONALENIE DROŻDŻY YARROWIA LIPOLYTICA
DO BIOSYNTEZY ERYTRYTOLU ZA POMOCĄ
MUTAGENIZACJI CHEMICZNEJ1
Anita Rywińska, Marta Utecht
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Streszczenie. W wyniku chemicznej mutagenizacji szczepu drożdży Yarrowia lipolytica
Wratislavia K1 przy użyciu N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyny otrzymano 32 nowe
szczepy. W testach płytkowych szczepy poddano selekcji w kierunku lepszego niż szczep
wyjściowy wzrostu w niskim pH i przy wysokim stężeniu glicerolu oraz w kierunku słabszego wykorzystania erytrytolu jako źródła węgla. Wybrano 15 szczepów, których zdolność do produkcji erytrytolu zbadano w 7-dobowych hodowlach wytrząsanych. W podłożu
zawierającym glicerol o czystości technicznej wszystkie szczepy produkowały erytrytol
z wydajnością wyższą od szczepu wyjściowego, wynoszącą 0,22–0,25 g·g-1. W hodowlach
z glicerolem odpadowym wydajność produkcji erytrytolu wynosiła od 0,2 do 0,24 g·g-1,
natomiast w przypadku szczepu Wratislavia K1 0,25 g·g-1. Podczas biosyntezy erytrytolu
wszystkie szczepy tworzyły produkty uboczne – mannitol i arabitol oraz kwas cytrynowy i α-ketoglutarowy, których udział w sumie tworzonych produktów wynosił od 41,8
do 32,8%. Analiza udziału produktów towarzyszących wskazała trzy szczepy: Wratislavia
K1-b, Wratislavia K1-d i Wratislavia K1-g, potencjalnie przydatne do biosyntezy erytrytolu
w hodowlach bioreaktorowych.
Słowa kluczowe: Yarrowia lipolytica, glicerol, erytrytol, N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG)
WSTĘP
Erytrytol, występujący w nomenklaturze IUPAC jako (2R,3S)-butano-1,2,3,4-tetraol,
jest alifatycznym, czterowęglowym alkoholem cukrowym należącym do grupy polioli
[Cummings i Stephen 2007]. Nie wykazuje aktywności optycznej – występuje wyłącznie
w formie mezo, co związane jest z symetrycznością cząsteczki. Po raz pierwszy wyizolo© Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Adres do korespondencji – Corresponding author: Anita Rywińska, Katedra Biotechnologii
i Mikrobiologii Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, 51-630 Wrocław, ul. J. Chełmońskiego 37/41, e-mail: [email protected]
18
A. Rywińska i M. Utecht
wał go w 1852 roku Lamy z alg Apatococcus lobatus, a odkrytą wówczas substancję nazwał phycit [cyt. za O’Donnell i Kearsley 2012]. Erytrytol od dawna funkcjonuje w diecie ludzkiej, powszechnie występuje w grzybach, niektórych owocach (gruszki, melony,
winogrona, arbuzy, brzoskwinie) i w żywności fermentowanej (wino, sake, piwo, sosy
sojowe, sery) [Moon i in. 2010, de Cock 1999, Shindou 1989]. W Stanach Zjednoczonych
konsumpcja erytrytolu występującego naturalnie w żywności (głównie w serze i winie)
na jednego mieszkańca jest szacowana na 80 mg na dzień lub około 1,3 mg na kg masy
ciała na dzień [Bernt i in. 1996]. Oczyszczony za pomocą chromatografii jonowymiennej
związek poddaje się krystalizacji, w wyniku której można uzyskać krystaliczny erytrytol
o czystości przekraczającej 99,5% [O’Brien-Nabors 2011]. Zarówno badania toksykologiczne na zwierzętach, jak i badania kliniczne jednoznacznie stwierdzają bezpieczeństwo
spożywania erytrytolu [Moon i in. 2010].
Erytrytol jako jedyny poliol jest produkowany komercyjnie w procesie biotechnologicznym [O’Donnell i Kearsley 2012]. Jego przemysłowa produkcja rozpoczęła się
w roku 1990 w Japonii. Obecnie jest wytwarzany przez Bolak Corporation (Whasung,
Kyungki-do, Korea), Cargill Food & Pharm Specialties (Blair, Nebraska, USA) i Mitsubishi Chemical Corporation (Tokyo, Japan) [Moon i in. 2010]. Źródłem węgla w procesie przemysłowym jest glukoza uzyskana w wyniku chemicznej lub enzymatycznej
hydrolizy skrobi pszenicznej i kukurydzianej. Ze względów ekonomicznych używa się
wyłącznie wyselekcjonowanych osmofilnych szczepów drożdży takich jak Torula sp.
lub Moniliella pollinis [Jeya i in. 2009]. Nie zawsze wykorzystanie szczepów naturalnych (dzikich) zapewnia wystarczająco wysoką wydajność procesu produkcji. W celu
zwiększenia aktywności metabolicznej szczepu prowadzi się prace nad optymalizacją
warunków hodowli bądź modyfikacją genotypu. Dzięki modyfikacjom genetycznym
ilość metabolitów wytwarzanych przez szczepy produkcyjne może przewyższać od kilku
do kilkudziesięciu razy ich biomasę i od kilku do kilkudziesięciu tysięcy razy ich własne potrzeby. Metody biotechnologicznego doskonalenia szczepów mogą obejmować:
selekcję fenotypową, hybrydyzację naturalną w procesach płciowych i paraseksualnych,
hybrydyzację na drodze fuzji protoplastów, techniki inżynierii genetycznej oraz mutagenizację za pomocą promieniowania UV lub czynników chemicznych [Libudzisz i Kowal
2000]. Dostępna literatura dostarcza wielu przykładów z sukcesem przeprowadzonej mutagenizacji mikroorganizmów w celu poprawy ich właściwości produkcyjnych (tab. 1).
Podobne badania były również prowadzone w celu zwiększenia produkcji erytrytolu [Lin
i in. 2010].
Celem pracy było otrzymanie mutantów w szczepie drożdży Y. lipolytica Wratislavia K1 za pomocą mutagenizacji chemicznej przy wykorzystaniu N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyny (MNNG) i ich selekcja pod kątem zwiększonej produkcji erytrytolu
z glicerolu.
MATERIAŁ I METODY
Mikroorganizmy. Przedmiotem badań były 32 szczepy drożdży Yarrowia lipolytica uzyskane w wyniku mutagenizacji chemicznej szczepu Y. lipolytica Wratislavia K1. Wszystkie badane w pracy szczepy przechowywano na skosach z podłożem YM (podłoże z ekstraktem drożdżowym i słodowym), w temperaturze 4°C, w kolekcji własnej Katedry
Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu.
Acta Sci. Pol.
Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica...
19
Tabela 1. Przykłady doskonalenia mikroorganizmów za pomocą promieniowania UV i mutagenizacji chemicznej
Table 1. The examples of microorganisms improvement with the use of UV and chemical mutagenesis methods
Mikroorganizm
Microorganism
Rhizopus oryzae
Aspergillus sojae
Aspergillus niger
Rhodotorula acheniorum
Produkt
Product
Kwas fumarowy
Fumaric acid
Poligalakturonazy
polygalacturonase
Dehydrogenaza
glukozo-6-fosforanowa
Glucose-6-phosphate
dehydrogenase
Β-karoten
β-carotene
Wydajność wzrostu w wysokiej temperaturze i przy
wysokim stężeniu soli
Kefir yeast
Cell yield at high temperatures and salt concentration
Kwas glukonowy
Aspergillus oryzae
Gluconic acid
Inulinaza
Penicillium purpuInulinase
rogenum
Poprawa
wydajności
Improvement
of yield
21,1%
21.1%
2,4-krotna
2.4-fold
Fu i in. [2010]
Fu et al.
Heerd i in. [2014]
Heerd et al.
UV- MNNG
695,9%
695.9%
Liu i in. [2003]
Liu et al.
UV,
Ethymethanesurfonate
(EMS), MNNG
6,45-krotnie
6,45-fold
Nasrabadi i Razavi
[2011]
Nasrabadi and Razavi
MNNG
13%
Petsas i in. [2002]
Petsas et al.
Mutagen
UV- MNNG
UV- MNNG
MNNG
MNNG –UV
2,4-krotna
2.4-fold
2–3,5-krotna
2–3.5-fold
Aspergillus sp.
Enzymy pektynolityczne
Pectinolytic enzymes
UV- MNNG
5,8-krotna
5.8-fold
Guehomyces
pullulans
β-galaktozydaza
β-galactosidase
MNNG
1,4-krotna
1.4-fold
Źródło
Source
Raksha i in. [2012]
Raksha et al.
Sharma i in. [2005]
Sharma et al.
Sheykhinejad i in.
[2008]
Sheykhinejad et al.
Xu i in. [2011]
Xu et al.
Procedura mutagenizacji. Procedurę mutagenizacji opracowano zgodnie z metodyką opisaną w pracy Tianwei i in. [2003]. Materiał komórkowy do procesu mutagenizacji pochodził ze zmywu z 48-godz. skosów. Biomasę standaryzowano w 1 M buforze
fosforanowym (pH 6,0) do gęstości 107 kom·cm-3, a następnie przenoszono do kolbek
stożkowych o objętości 100 cm3. Jako czynnik mutagenny stosowano N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidynę (MNNG) (rys. 1), a jej końcowe stężenie wynosiło: 0,01; 0,05;
0,1; 0,2; 0,5; 0,7; 0,9; 1,5; 2,0 mg·cm-3. Kolbki zawierające 10 cm3 zawiesiny komórek
wraz z czynnikiem mutagennym wytrząsano na wytrząsarce rotacyjnej przy 160 rpm,
w 30°C przez 30 minut. Następnie do kolbek wprowadzono 90 cm3 buforu fosforanowego
i wykonano posiewy z kolejnych dziesiętnych rozcieńczeń na podłoże YM z glicerolem.
Po 72 godz. inkubacji w 30°C policzono liczbę jednostek tworzących kolonie (j.t.k)
w przeliczeniu na 1 ml zawiesiny drożdży i przedstawiono w formie krzywej przeżywalności (rys. 2). Właściwą mutagenizację przeprowadzono przy dawce MNNG równej 0,2
i 0,9 mg·cm-3. Z hodowli płytkowych izolowano wszystkie kolonie, które oczyszczano do
postaci czystej kultury i przechowywano na skosach YM w temperaturze 4°C.
Biotechnologia 14 (1) 2015
20
A. Rywińska i M. Utecht
Rys. 1. N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyna, MNNG
Fig. 1. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG
YM – 20Gly; pH 3,5
YM – 200Gly
YNB – 100ER
YM – 20Gly; pH 3,5
YM – 200Gly
YNB – 100ER
Rys. 2. Schemat testów płytkowych
Fig. 2. Scheme of Petri dishes tests
Substrat. W badaniach wykorzystano glicerol o czystości kosmetycznej (98%) oraz
glicerol odpadowy z produkcji biodiesla, o zawartości 873 g.dm-3 glicerolu i 43 g.dm-3
NaCl (Wratislavia-BIO, Wrocław).
Podłoża. Do testów płytkowych wykorzystano podłoża oznaczone jako: YM – 20Gly
i pH 3,5; YM – 200Gly i YNB – 100ER. Odczyn podłoża YM – 20Gly i pH 3,5 przed
sterylizacją ustalono na 3,5, a jego komponenty to (g·dm-3): glicerol (98%) – 20,0; ekstrakt drożdżowy – 3,0; ekstrakt maltozowy – 3,0; bactopepon – 5,0; agar – 20,0; woda
destylowana do 1 dm3. W podłożu YM – 200Gly stężenie glicerolu (98%) wynosiło
200 g·dm-3, a jego odczyn przed sterylizacją ustalono na 4,5. Podłoże YNB – 100ER
zawierało (g·dm-3): YNB (gotowe wyjściowe podłoże azotowe, Yeast Nitrogen Base –
Sigma-Aldrich) – 0,67; erytrytol – 100; agar – 20,0; woda destylowana do 1 dm3, pH
4,5. Podłoże produkcyjne do hodowli wstrząsanych zawierało (g·dm-3): glicerol (98%)
– 100,0; (NH4)2SO4 – 2,5; MgSO4 x 7H2O – 1,0; KH2PO4 – 0,22; ekstrakt drożdżowy –
1,0; CaCO3 – 2,5; woda destylowana do 1 dm3. Podłoża sterylizowano w 121°C przez 20
minut.
Warunki prowadzenia hodowli
Testy płytkowe. Wykonano serie pasaży według schematu zamieszczonego na rysunku
1, w których materiałem ze skosów szczepiono podłoża stałe na płytkach Petriego: YM
– 20Gly i pH 3,5; YM – 200Gly i YNB – 100ER. W ostatnim etapie za pomocą sterylnej
Acta Sci. Pol.
Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica...
21
igły wykonano punktowy posiew na świeże podłoża. Zaszczepione płytki inkubowano
przez 72 godz. w temperaturze 30°C. Średnicę kolonii mierzono za pomocą suwmiarki.
Hodowle produkcyjne wytrząsane. Hodowle szczepiono materiałem komórkowym
pochodzącym ze skosów. Hodowle prowadzono na wytrząsarce rotacyjnej w temperaturze 29,5°C, przy 140 rpm, w 0,3 dm3 kolbach stożkowych zawierających 0,03 dm3 podłoża produkcyjnego, przez 7 dni. Próby do analiz pobierano po zakończeniu hodowli.
Metody analityczne
Biomasę oznaczano metodą wagową. Stężenie glicerolu, erytrytolu, mannitolu, arabitolu, kwasu cytrynowego oraz kwasu α-ketoglutarowego oznaczano metodą HPLC na
kolumnie HyperRez XP carbohydrate H+ (Dionex, UltiMate 3000 Series) połączonej
z detektorami UV (λ = 210 nm) i RI (detektor refraktometryczny), w temperaturze 65°C,
przy szybkości przepływu fazy ciekłej (25 mM kwasu trifluorooctowego; TFA) równej
0,6 cm3·min-1.
WYNIKI I OMÓWIENIE
W pierwszym etapie badań szczep drożdży Y. lipolytica Wratislavia K1 poddano chemicznej mutagenizacji za pomocą pochodnej nitrozomocznika, mocnego mutagenu
N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyny (MNNG) (rys. 1). W niniejszej pracy stężenie
MNNG wynosiło od 0,01 do 2,0 mg·cm-3. Uzyskane wyniki przedstawiono w formie krzywej przeżywalności (rys. 3). Już najniższa zastosowana dawka MNNG (0,01 mg·cm-3)
powodowała znaczny stopień redukcji populacji, o około 64%. MNNG jest mocnym
mutagenem, który działa szczególnie efektywnie podczas procesu replikacji DNA. Wynikiem mutagenezy są mutacje punktowe związane z metylacją guaniny w pozycji O6,
mogące prowadzić do dwuniciowego uszkodzenia DNA, śmierci komórki lub kontrolowanego procesu mutagenezy w określonym regionie genomu [Niknahad i O`Brien
1995, Margison i in. 2002]. Przy dawkach NTG w zakresie od 0,1 do 0,7 mg·cm-3 pozostawało od 11,8 do 16,9% żywych komórek. W zakresie stężenia MNNG od 0,9 do
2,0 mg·cm-3 przeżywała podobna ilość komórek, około 5%. Tianwei i in. [2003] podobną
procedurę mutagenizacji, przy dawkach MNNG w zakresie 0,05–0,9 mg·cm-3, zastosowali do zwiększenia aktywności lipazy wytwarzanej przez szczep Candida sp. 99–123.
Przy najniższym stężeniu MNNG przeżywalność komórek wynosiła 53%, natomiast przy
najwyższym zaledwie 0,02%, co oznacza, że drożdże te były bardziej wrażliwe na działanie zastosowanego czynnika niż szczep badany w niniejszej pracy. Jednocześnie autorzy
stwierdzili największy procent niepożądanych mutacji, 66,6%, przy stężeniu mutagenu
0,05 mg·cm-3, natomiast najwięcej pożądanych mutacji, 85%, przy stosunkowo niskiej
przeżywalności (0,05%), przy 0,5 mg·cm-3. Ta sama dawka w badaniach własnych gwarantowała 8-krotnie wyższą przeżywalność. Mutagenizację z udziałem MNNG przeprowadzili również Finogenova i in. [2008] w celu ulepszenia zdolności drożdży Y. lipolytica
do produkcji kwasu cytrynowego z glicerolu. W tych badaniach maksymalne stężenie
MNNG wynosiło 0,1 mg·cm-3. W zakresie stężenia tego związku od 0,05 do 0,1 mg·cm-3
przeżywalność drożdży utrzymywała się na stałym poziomie wynoszącym około 25%.
W badaniach własnych podobną przeżywalność, około 16%, uzyskano przy dawkach
MNNG 0,1–0,2 mg·cm-3.
Biotechnologia 14 (1) 2015
22
A. Rywińska i M. Utecht
W wyniku właściwej mutagenizacji, do której wybrano dawki MNNG 0,2 i 0,9 mg·cm-3
dające przeżywalność komórek odpowiednio 16,9 i 5%, otrzymano 32 szczepy.
Procent przeżywających komórek [%]
Percentage of survived cells
50,0
40,0
36,2
30,0
20,0
32,1
16,4
16,9
14,1
11,8
10,0
5,0
0,0
0,01
0,1
1
4,7
4,5
10
MNNG [mg·cm-3]
Rys. 3. Krzywa przeżywalności szczepu Yarrowia lipolytica Wratislavia K1 po działaniu różnych
dawek MNNG
Fig. 3. Survival curve of Yarrowia lipolytica Wratislavia K1strain treated with different doses of
MNNG
Kolejnym etapem badań były testy płytkowe na podłożach: YM o pH 3,5 z 2% glicerolu (YM – 20Gly i pH 3,5), YM z wysokim stężeniem glicerolu (200 g·dm-3) (YM –
200Gly) oraz na podłożu minimalnym YNB z erytrytolem jako źródłem węgla w stężeniu
100 g·dm-3 (YNB – 100ER). Wybór takich podłoży selekcyjnych został podyktowany dotychczasowymi wynikami badań, które wskazują, że kluczowymi czynnikami odpowiedzialnym za nadprodukcję erytrytolu z glicerolu przez drożdże Y. lipolytica są niskie pH
oraz podwyższone ciśnienie osmotyczne środowiska hodowlanego [Rywińska i in. 2015,
Tomaszewska i in. 2012]. Wcześniejsze badania wykazały również, że szczep Wratislavia
K1 nie utylizuje erytrytolu jako źródła węgla, co okazało się niezwykle korzystne w procesach hodowlanych. Po wyczerpaniu podstawowego źródła węgla drożdże wykorzystują produkty uboczne, natomiast nie zużywają erytrytolu, co pozwala na znaczną poprawę
selektywności procesu produkcji [Tomaszewska i in. 2014]. W wyniku mutagenizacji
drożdży Monileilla sp. 440 przeprowadzonej za pomocą MNNG otrzymano 6 mutantów
wykazujących wyższą produkcję erytrytolu od szczepu dzikiego. Interesujący jest fakt, że
najbardziej efektywny producent asymilował inozytol i słabo erytrytol, natomiast szczep
dziki nie asymilował inozytolu, za to dobrze wykorzystywał erytrytol jako źródło węgla
[Lin i in. 2010]. Dlatego w niniejszej pracy celem testów płytkowych było wyselekcjonowanie szczepów zdolnych do wzrostu w niskim pH, przy wysokim stężeniu glicerolu
oraz niewykorzystujących erytrytolu, czyli szczepów tworzących duże kolonie na podłożach YM oraz jak najmniejsze na podłożu YNB. Kontrolę stanowił szczep Wratislavia
K1, który tworzył kolonie o średnicy 3,201, 4,13 i 1,38 mm, odpowiednio na podłożu:
YM – 200Gly, YM – 20Gly i pH 3,5 oraz YNB – 100ER. Średnice kolonii wraz z wynikami analiz statystycznych przedstawiono w tabelach 2–4. Nowo otrzymane szczepy
dobrze rosły na podłożu z wysokim stężeniem glicerolu (tab. 2). Tylko dwa spośród nich
tworzyły mniejsze kolonie od średnicy
rednicy kolonii szczepu Wratislavia K1. Na podstawie staActa Sci. Pol.
Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica...
23
tystycznego opracowania wyników wzrostu drożdży
żdży
dży
ży
y na tym podłożu
żuu otrzymano 3 grupy jednorodne. W trzeciej z nich występował szczep Wratislavia K1-a tworzący kolonie
o największej
ększej
kszej średnicy,
rednicy, 7,39 mm. Na podłożu
żu
u YM – 20Gly i pH 3,5 ażż 24 szczepy osiąągnęły średnicę kolonii większą od szczepu wyjściowego Wratislavia K1 (tab. 3). Średnica
kolonii pozostałych 8 szczepów wynosiła mniej niż 4,13 mm. Na podstawie analizy statystycznej otrzymano aż siedem grup jednorodnych. W siódmej grupie znalazł się szczep
Wratislavia K1-e tworzący
ący
cy kolonie o największej
ększej
kszej średnicy,
rednicy, 5,10 mm. Na podłożu
żuu minimalnym z erytrytolem jako źródłem węgla (YNB-100ER) 18 szczepów wykazywało
słabszy wzrost niż szczep wyjściowy, tworząc kolonie o średnicy mniejszej niż 1,38 mm
(tab. 4). Na podstawie analizy statystycznej otrzymano osiem grup jednorodnych. Szczep
Wratislavia K1-rr, który znalazł sięę w pierwszej grupie, nie wykazywał wzrostu na podłożu YNB z erytrytolem, natomiast kolonie o największej średnicy, 2 mm, zanotowano
w przypadku szczepów Wratislavia K1-g i Wratislavia K1-gg. Na podstawie analizy statystycznej testów płytkowych do dalszych badań wybrano 15 szczepów (tab. 5). Wszystkie
wybrane szczepy tworzyły większe kolonie niż szczep wyjściowy na podłożu z wysokim
stężeniem glicerolu (YM – 200Gly), jednak trzy spośród nich tworzyły mniejsze kolonie
na podłożu kwaśnym (YM – 20Gly i pH 3,5). Dwa szczepy wykazywały lepszy wzrost
na podłożu z erytrytolem jako źródłem węgla niż szczep Wratislavia K1.
W kolejnym etapie badań wyselekcjonowane szczepy testowano pod kątem produkcji erytrytolu w 7-dobowych hodowlach wytrząsanych w podłożu zawierającym glicerol o czystości technicznej (kosmetyczny) oraz w podłożu z glicerolem odpadowym,
pochodzącym z produkcji biodiesla. Na rysunku 4 przedstawiono wydajność produkcji
erytrytolu w przypadku wybranych szczepów. Badane szczepy produkowały erytrytol
z glicerolu czystego z podobną wydajnością wynoszącą 0,22–0,25 g·g-1. Interesujący jest
natomiast fakt, że szczep wyjściowy w przypadku tego substratu produkował erytrytol
z wydajnością niższą, 0,20 g·g-1. Nieco bardziej zróżnicowane wartości tego parametru uzyskano w hodowlach, w których stosowano glicerol odpadowy. Uzyskane szczepy produkowały erytrytol z wydajnością w zakresie od 0,20 do 0,24 g·g-1, podczas gdy
szczep Wratislavia K1 z wydajnością równą 0,25 g·g-1. Otrzymane wyniki, pomimo braku
statystycznie istotnych różnic, mogą sugerować większą wrażliwość nowo otrzymanych
szczepów na zanieczyszczenia obecne w substracie odpadowym, w porównaniu ze szczepem wyjściowym.
Ponieważ nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy szczepami, o dalszym wyborze szczepów zdecydował udział produktów ubocznych tworzonych podczas
biosyntezy erytrytolu (rys. 5). Duża ilość produktów towarzyszących może znacznie
zwiększyć koszty uzyskania finalnego produktu. Wszystkie szczepy oprócz erytrytolu
produkowały również mannitol, arabitol, kwas cytrynowy i kwas α-ketoglutarowy. Stężenie mannitolu wynosiło od 6,7 do 8,7 g·dm-3, a arabitolu nie przekroczyło 3,9 g·dm-3. Badane szczepy tworzyły nieco więcej kwasu cytrynowego niż α-ketoglutarowego, a stężenie tych kwasów nie przekroczyło odpowiednio 3,8 i 2,7 g·dm-3. Udział erytrytolu w puli
tworzonych produktów wynosił od 59,2% w przypadku szczepu Wratislavia K1-pp do
67,2% w szczepie Wratislavia K1-d. W hodowlach szczepu wyjściowego Wratislavia K1
udział erytrytolu był zdecydowanie wyższy w przypadku glicerolu odpadowego (68,2%)
niż czystego substratu (57,9%). W efekcie analizy udziału innych polioli oraz kwasów
organicznych za najlepsze uznano trzy szczepy Wratislavia K1-b, Wratislavia K1-d oraz
Wratislavia K1-g.
Biotechnologia 14 (1) 2015
24
A. Rywińska i M. Utecht
Tabela 2. Analiza statystyczna średnicy kolonii segregantów szczepu Y. lipolytica Wratislavia K1,
uzyskanych w wyniku mutagenizacji chemicznej za pomocą MNNG rosnących na podłożu YM – 200Gly
Table 2. Statistical analysis of the diameter of colony surface of Y. lipolytica Wratislavia K1 segregants obtained through chemical mutagenesis using MNNG growing on YM – 200Gly
medium
Lp.
No.
1.
Szczep
Strain
Wratislavia K1-pp
Średnica kolonii na podłożu
YM – 200Gly [mm]
Diameter of the colony on the medium
YM – 200Gly
2,89
2.
Wratislavia K1-mm
3,00
3.
Wratislavia K1
3,20
4.
Wratislavia K1-dd
3,20
5
Wratislavia K1-nn
3,24
6.
Wratislavia K1-o
3,26
7.
Wratislavia K1-oo
3,31
8.
Wratislavia K1-j
3,38
9.
Wratislavia K1-ee
3,40
10.
Wratislavia K1-aa
3,43
3,46
11.
Wratislavia K1-hh
12.
Wratislavia K1-ii
3,55
13.
Wratislavia K1-k
3,57
14.
Wratislavia K1-ss
3,59
15.
Wratislavia K1-i
3,61
16.
Wratislavia K1-h
3,67
17.
Wratislavia K1-g
3,69
18.
Wratislavia K1-e
3,71
19.
Wratislavia K1-l
3,76
20.
Wratislavia K1-m
3,78
21.
Wratislavia K1-ll
3,89
22.
Wratislavia K1-n
3,90
23.
Wratislavia K1-rr
3,94
24.
Wratislavia K1-kk
3,95
25.
Wratislavia K1-gg
4,06
26.
Wratislavia K1-cc
4,17
27.
Wratislavia K1-bb
4,18
28.
Wratislavia K1-d
4,30
29.
Wratislavia K1-jj
4,31
30.
Wratislavia K1-f
4,38
31.
Wratislavia K1-c
4,47
32.
Wratislavia K1-b
5,10
33.
Wratislavia K1-a
7,39
Grupy jednorodne
Homogenous groups
Analiza wariancji test Duncana; α = 0,05 – Variance analysis Duncan’s test; α = 0.05
Acta Sci. Pol.
Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica...
25
Tabela 3. Analiza statystyczna średnicy kolonii segregantów szczepu Y. lipolytica Wratislavia K1,
uzyskanych w wyniku mutagenizacji chemicznej za pomocą MNNG rosnących na podłożu YM – 20Gly i pH 3,5
Table 3. Statistical analysis of the diameter of colony surface of Y. lipolytica Wratislavia K1 se
gregants, obtained through chemical mutagenesis using MNNG growing on YM – 20Gly
and pH 3,5 medium
Lp.
No.
Szczep
Strain
Średnica kolonii na podłożu
YM -20Gly i pH 3,5 [mm]
Diameter of the colony on the medium
YM -20Gly and pH 3,5
1.
Wratislavia K1-ss
2.
Wratislavia K1-i
3,66
3.
Wratislavia K1-rr
3,67
4.
Wratislavia K1-ii
3,69
5.
Wratislavia K1-cc
3,84
6.
Wratislavia K1-hh
3,84
7.
Wratislavia K1-c
3,87
8.
Wratislavia K1-ee
3,88
9.
Wratislavia K1
3,88
10.
Wratislavia K1-h
3,93
3,95
Grupy jednorodne
Homogenous groups
3,41
11.
Wratislavia K1-ll
12.
Wratislavia K1-kk
3,95
13.
Wratislavia K1-k
3,97
14.
Wratislavia K1-pp
3,98
15.
Wratislavia K1-dd
4,02
16.
Wratislavia K1-bb
4,06
17.
Wratislavia K1-oo
4,09
18.
Wratislavia K1-nn
4,10
19.
Wratislavia K1-mm
4,18
20.
Wratislavia K1-jj
4,20
21.
Wratislavia K1-f
4,22
22.
Wratislavia K1-j
4,23
23.
Wratislavia K1-d
4,24
24.
Wratislavia K1-g
4,27
25.
Wratislavia K1-l
4,35
26.
Wratislavia K1-m
4,35
27.
Wratislavia K1-b
4,35
28.
Wratislavia K1-gg
4,35
29.
Wratislavia K1-n
4,36
30.
Wratislavia K1-o
4,49
31.
Wratislavia K1-aa
4,50
32.
Wratislavia K1-a
4,53
33.
Wratislavia K1-e
5,10
Analiza wariancji test Duncana; α = 0,05 – Variance analysis Duncan’s test; α = 0.05
Biotechnologia 14 (1) 2015
26
A. Rywińska i M. Utecht
Tabela 4. Analiza statystyczna średnicy kolonii segregantów szczepu Y. lipolytica Wratislavia K1,
uzyskanych w wyniku mutagenizacji chemicznej za pomocą MNNG rosnących na podłożu YNB – 100ER
Table 4. Statistical analysis of the diameter of colony surface of Y. lipolytica Wratislavia K1 segregants, obtained through chemical mutagenesis using MNNG growing on YNB – 100ER
medium
1.
Wratislavia K1-rr
Średnica kolonii na podłożu
YNB -100ER [mm]
Diameter of the colony on the
medium YNB -100ER
0,00
2.
Wratislavia K1-bb
0,53
3.
Wratislavia K1-a
0,65
4.
Wratislavia K1-h
0,87
5.
Wratislavia K1-pp
0,89
6.
Wratislavia K1-n
0,90
7.
Wratislavia K1-ss
0,94
8.
Wratislavia K1-c
0,99
9.
Wratislavia K1-ii
1,00
10.
Wratislavia K1-mm
1,08
1,10
Lp.
No.
Szczep
Strain
11.
Wratislavia K1-nn
12.
Wratislavia K1-ee
1,12
13.
Wratislavia K1-e
1,12
14.
Wratislavia K1-b
1,13
15.
Wratislavia K1-j
1,21
16.
Wratislavia K1-dd
1,21
17.
Wratislavia K1-cc
1,22
18.
Wratislavia K1-oo
1,29
19.
Wratislavia K1-l
1,29
20.
Wratislavia K1-i
1,38
21.
Wratislavia K1
1,38
22.
Wratislavia K1-kk
1,38
23.
Wratislavia K1-k
1,40
24.
Wratislavia K1-f
1,40
25.
Wratislavia K1-o
1,41
26.
Wratislavia K1-aa
1,41
27.
Wratislavia K1-m
1,42
28.
Wratislavia K1-d
1,44
29.
Wratislavia K1-hh
1,48
30.
Wratislavia K1-jj
1,51
31.
Wratislavia K1-ll
1,61
32.
Wratislavia K1-gg
1,99
33.
Wratislavia K1-g
2,00
Grupy jednorodne
Homogenous groups
Analiza wariancji test Duncana; α = 0,05 – Variance analysis Duncan’s test; α = 0.05
Acta Sci. Pol.
Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica...
27
Tabela 5. Zestawienie wyników hodowli na podłożach selekcyjnych dla wybranych szczepów
drożdży
Table 5. The summary of the obtained cultures results on the selective media for strains selected
Lp.
No.
Szczep
Strain
YM – 200Gly
Ø; Średnice kolonii [mm]
Ø; Diameter of the colony
YM – 20Gly i pH 3,5
YM – 20Gly and pH 3,5
3,87
YNB – 100ER
Wratislavia K1
3,20
1.
Wratislavia K1-a
7,39
4,53
0,65
2.
Wratislavia K1-b
5,10
4,35
1,13
3.
Wratislavia K1-c
4,47
3,87
0,99
4.
Wratislavia K1-d
4,30
4,23
1,44
5.
Wratislavia K1-e
3,71
5,10
1,12
6.
Wratislavia K1-g
3,69
4,27
2,00
1,38
7.
Wratislavia K1-h
3,67
3,93
0,87
8.
Wratislavia K1-j
3,37
4,23
1,21
9.
Wratislavia K1-l
3,76
4,35
1,29
10.
Wratislavia K1-n
3,90
4,36
0,90
11.
Wratislavia K1-o
3,26
4,49
1,41
12.
Wratislavia K1-bb
4,18
4,06
0,53
13.
Wratislavia K1-pp
3,98
2,89
0,89
14.
Wratislavia K1-rr
3,94
3,67
0,00
15.
Wratislavia K1-ss
3,59
3,41
0,94
Glicerol 98% – Glycerol
Wydajność produkcji erytrytolu [Y g·g-1]
Erythritol production yield
Glicerol 87,3% – Glycerol
Szczep – Strain
Rys. 4. Wydajność produkcji erytrytolu z glicerolu czystego i odpadowego przez szczepy drożdży
Y. lipolytica uzyskane w wyniku mutagenizacji za pomocą MNNG
Fig. 4. Yield of erythritol production from pure and crude glycerol by Y. lipolytica strains obtained
through chemical mutagenesis using MNNG
Biotechnologia 14 (1) 2015
28
A. Rywińska i M. Utecht
Erytrytol – Erythritol
Kwas cytrynowy – Citric acid
Mannitol
Kwas alfa-ketoglutarowy – Alpha-ketoglutaric acid
Arabitol
Glicerol odpadowy – Crude glycerol
ss
rr
pp
bb
o
n
l
j
h
g
e
d
c
b
a
Wratislavia K1
Glicerol czysty – Pure glycerol
ss
rr
pp
bb
o
n
l
j
h
g
e
d
c
b
a
Wratislavia K1
0%
20%
40%
60%
80%
Selektywność [%] – Selelctivity
Rys. 5. Procentowy udział produktów podczas biosyntezy erytrytolu z glicerolu czystego i odpadowego przez szczepy drożdży Y. lipolytica uzyskane w wyniku mutagenizacji za pomocą
MNNG
Fig. 5. Percentage share of products during erythritol biosynthesis from pure and crude glycerol
by Y. lipolytica strains obtained through chemical mutagenesis using MNNG
Acta Sci. Pol.
100%
Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica...
29
PODSUMOWANIE
W niniejszej pracy po razy pierwszy wykorzystano mutagenizację chemiczną za pomocą
MNNG w celu poprawy zdolności drożdży Y. lipolytica do produkcji erytrytolu z glicerolu. W wyniku mutagenizacji przeprowadzonej w szczepie Wratislavia K1 uzyskano 32
nowe szczepy. Za pomocą testów płytkowych, w których oceniano zdolność do wzrostu
w niskim pH, przy wysokim stężeniu glicerolu oraz zdolność do utylizacji erytrytolu,
wyselekcjonowano 15 szczepów. Wybrane szczepy zbadano pod kątem produkcji erytrytolu z glicerolu o czystości technicznej i odpadowej w hodowlach wytrząsanych. Na
podstawie oceny zarówno parametrów procesu biosyntezy erytrytolu, jak i selektywności
tej produkcji wskazano 3 szczepy o poprawionych, w stosunku do szczepu wyjściowego,
cechach produkcyjnych. Dalszy ciąg badań będzie obejmował charakterystykę procesu
biosyntezy erytrytolu przez wskazane szczepy w hodowlach bioreaktorowych.
Podziękowania. Badania realizowano w ramach projektu nr POIG.01.01.02-00074/09; „Biotechnologiczna konwersja glicerolu do polioli i kwasów dikarboksylowych”
oraz w ramach grantu N N312256640 „Metabolizm glicerolu do erytrytolu w komórkach
drożdży Yarrowia lipolytica”.
PIŚMIENNICTWO
Bernt W., Borzelleca J., Flamm G., Munro I., 1996. Erythritol: a review of biological and toxicological studies. Reg. Toxic. Pharmacol., 24, 191.
Cummings J.H., Stephen A.M., 2007. Carbohydrate terminology and classification. Eur. J. Clin.
Nutr., 61, 5–18.
de Cock P., 1999. Erythritol: a novel noncaloric sweetener ingredient. Corti A (ed.): Low-Calorie
Sweeteners: Present and Future. World Rev Nutr Diet. Basel, Karger. 85, 110–116.
Finogenova T.V., Puntus I.F., Kamzolova S.V., Lunina Yu.N., Monastyrskaya S.E.,
Morgunov I.G., Boronin A.M., 2008. Mutant Yarrowia lipolytica strains producing citric acid from
glucose. Appl. Biochem. Microbiol., 44 (2), 197–202.
Fu Y.-Q., Xu Q., Li S., Chen Y., Huang H., 2010. Strain improvement of Rhizopus oryzae for overproduction of fumaric acid by reducing ethanol synthesis pathway. Korean J. Chem. Eng., 27 (1),
183–186.
Heerd D., Tari C. Fernández-Lahore M., 2014. Microbial strain improvement for enhanced polygalacturonase production by Aspergillus sojae. Appl. Microbiol. Biotechnol., 98, 7471–7481.
Libudzisz Z., Kowal K., 2000, Mikrobiologia techniczna, Wyd. Politechnika Łódź
Lin S.J., Wen C.J., Wang P.M., Huang J.C., Wei C.L., Chang J.W., Chu W.S., 2010. High-level production of erythritol by mutants of osmophilic Moniliella sp. Proc. Biochem. 45 (6), 973–979.
Liu J.-Z., Zhang Q.-L., Weng L.-P., Ji L.-N., 2003. Screening and mutagenesis of Aspergillus niger for the improvement of glucose-6-phosphate dehydrogenase production. Appl. Biochem.
Microbiol., 39, 5, 493–496.
Margison G., 2002. A new damage limitation exercise: ironing (Fe(II)) out minor DNA methylation
lesions. DNA Repair 1. 1057–1061.
Moon H.J., Jeya M., Kim I.W., Lee J.K., 2010. Biotechnological production of erythritol and its
applications. Appl. Microbiol. and Biotechnol., 86, 1017–1025.
Nasrabadi M.,N., Razavi S.,H. 2011. Optimization of β-carotene production by a mutant of the
lactosepositive yeast Rhodotorula acheniorum from whey ultrafiltrate. Food Sci. Biotechnol.
20, 2, 445–454.
Biotechnologia 14 (1) 2015
30
A. Rywińska i M. Utecht
Niknahad H.I., O`Brien P.J., 1995. Cytotoxicity induced by N-methyl-N`-nitro-Nnitrosoguanidine
may involve S-nitrosyl glutathione and nitric oxide. Xenobiotica 25, 91–101.
O’Brien-Nabors L., 2011. Alternative Sweeteners, fourth edition. CRC Press, 249–264.
O’Donnell K., Kearsley M., 2012. Sweeteners and sugar alternatives in food technology, second
edition. Wiley-Blackwell, 215–218.
Petsas I., Psarianos K., Bekatorou A., Koutinas A.A., Banat I.M., Marchant R., 2002. Improvement
of Kefir yeast by mutation with N-methyl-N-nitrosoguanidine. Biotechnol. Lett. 24, 557–560.
Raksha S., Srinivasan S., Prasant G., Prabu R., 2012. Over-expression of gluconic acid in Aspergillus oryzae RP-21 mutants generated by a random mutagenesis approach. 3 Biotech. 2, 219–
223.
Rywińska A., Marcinkiewicz M., Cibis E., Rymowicz W., 2015. Optimization of medium composition for erythritol production from glycerol by Yarrowia lipolytica using response surface
methodology. Prep. Biochem. Biotechnol. 45, 6, 515–529.
Sharma A.D., Gill P.K., Bhullar S.S., Singh P. 2005. Improvement in inulinase production by simultaneous action of physical and chemical mutagenesis in Penicillium purpurogenum. World
J. Microbiol. Biotechnol., 21, 929–932.
Sheykhinejad A., Heydarian M., Hormozi F., 2008. Strain improvement of Aspergillus sp. for pectinolytic enzymes production. Abstracts / J. Biotechnol. 136S, S290–S344.
Shindou T., Sasaki Y., Eguchi T., Euguchi T., Hagiwara K., Ichikawa T., 1989. Identification of
erythritol by HPLC and GC-MS and quantitative measurement in pulps of various fruits.
J. Agric. Food Chem., 37 (6), 1474–1476.
Tianwei T., Mu Z., Bingwu W., Chunhua Y., Li D., 2003. Screening of high lipase producing Candida sp. and production of lipase by fermentation. Proc. Biochem., 39, 459–465.
Tomaszewska L., Rywińska A., Gładkowski W., 2012. Production of erythritol and mannitol by
Yarrowia lipolytica yeast in media containing glycerol. J. Ind.Microbiol Biotechnol. 39 (9),
1333–1343.
Tomaszewska L., Rywińska A., Rymowicz W., 2014. High selectivity of erythritol production from
glycerol by Yarrowia lipolytica. Biomass Bioenerg., 64, 309–320.
Xu J.-L., Zhao J., Wang L.-F., Sun H.-Y., Song Ch.-L., Chi Z.-M., 2012. Enhanced β-galactosidase
production from whey powder by a mutant of the psychrotolerant yeast Guehomyces pullulans
17–1 for hydrolysis of lactose. Appl. Biochem. Biotechnol., 166, 599–611.
Acta Sci. Pol.
Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica...
31
IMPROVEMENT OF YARROWIA LIPOLYTICA YEAST FOR ERYTHRITOL
BIOSYNTHESIS USING CHEMICAL MUTAGENESIS
Abstract. Thirty-two strains were obtained in Wratislavia K1 strain of Yarrowia lipolytica
through chemical mutagenesis using N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine. In Petri-dishes
test strains were examined towards better growth in conditions of low pH and high concentration of glycerol and towards poorer use of erythritol as carbon source in comparison to
parental strain. Fifteen strains were selected and tested for their ability to produce erytrhtiol
in 7-days shake-flasks experiment. In the medium containing pure glycerol all the strains
under investigation produced erythritol with the yield of 0.22–0.25 g·g-1, hence higher than
parental strain. The yield of erythritol production from crude glycerol by mutant strains
was in the range of 0.20–0.24 g·g-1, and 0.25 g·g-1 by Wratislavia K1. During erythritol
biosynthesis all the examined strains formed by-products – mannitol, arabitol, citric and
α-ketoglutaric acids – and their share in the total products ranged from 41.8 to 32.8%. Analysis of by-products indicated three strains, Wratislavia K1-b, Wratislavia K1-d i Wratislavia
K1-g, as potentially useful for erythritol biosynthesis in bioreactor cultures.
Key words: Yarrowia lipolytica, glycerol, erythritol, N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine
(MNNG)
Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 30.03.2015
Do cytowania – For citation: Rywińska A., Utecht M., 2015. Doskonalenie drożdży
Yarrowia lipolytica do biosyntezy erytrytolu za pomocą mutagenizacji chemicznej, Acta
Sci. Pol. Biotechnol., 14 (1), 17–32.
Biotechnologia 14 (1) 2015