Przechowywanie próbek w biotechnologii

Przechowywanie
próbek
w
biotechnologii: „jak”, „gdzie”, i
„jak długo”? (I)
Temat archiwizacji próbek jest istotny zarówno dla naukowców, jak i dla
klinicystów. Czy to podczas realizacji projektu badawczego, czy to do
późniejszego wykorzystania, wreszcie- dla celów terapeutycznych. Dla
niektórych typów materiałów istnieje consensus co do sposobu
przechowywania, natomiast dla innych nie ma żadnych konkretnych
wytycznych i tylko od załogi laboratorium i posiadanego sprzętu zależy,
jak i czy w ogóle jest on bankowany.
W części pierwszej zajmiemy się materiałami tkankowymi i komórkowymi.
Żywotne hodowle komórkowe eukariotyczne, gamety i komórki
macierzyste
Zachowanie w dobrej kondycji wrażliwych, osłoniętych jedynie błoną
plazmatyczną komórek zwierzęcych jest nie lada wyzwaniem. Oczywiście
zatrzymanie ich metabolizmu jest możliwe jedynie poprzez zamrożenie, jednak
woda podczas mrożenia tworzy kryształy, które niczym włócznie przebijają na
wskroś mrożone komórki. Dlatego procedura mrożenia jest bardzo ściśle
określona i wymaga specjalistycznej aparatury.
Komórki przed mrożeniem są delikatnie traktowane, odpłukiwane z medium
hodowlanego, zastępowanego roztworem zawierającym krioprezerwant
(najszerzej używanym jest DMSO, chociaż wybór środka zależy od typu komórek).
Jego funkcją jest nie dopuścić do tworzenia się kryształów i do nadmiernego
obkurczania się komórek w stanie zamrożenia.
Samo zamrażanie musi być na tyle szybkie, żeby komórki nadmiernie się nie
obkurczyły, ale na tyle wolne, by nie doprowadzić do ich lizy. Komórki ssacze
najczęściej poddaje się mrożeniu z szybkością 1-3 stopni Celcjusza na minutę,
schładzając je docelowo do temperatury poniżej -130 stopni.
Jest jeszcze druga technika zamrażania, zwana witryfikacją, czyli zeszkleniem.
Polega ona na tak szybkim zamrożeniu komórek, by ich roztwór zamienił się nie w
kryształy lodu, ale w amorficzne ciało stałe podobne do szkła. Odbywa się to
poprzez nagłe włożenie do ciekłego azotu i nadanie ruchu próbce podczas
zamrażania, tak by ciekły azot maksymalnie szybko odbierał jej ciepło.
Krioprezerwacja to powszechna metoda przechowywania komórek i
ekstraktów białkowych w celu zachowania ich funkcji biologicznych
Źródło: Wikimedia Commons, autor Jeffrey M. Vinocur, licencja CC BY SA 3.0
Przechowywanie po zamrożeniu odbywa się albo nad ciekłym azotem, w jego
parach (-140 do -180 stopni), albo w cieczy (-196).
Rozmrażanie komórek polega najczęściej na raptownym rozgrzaniu do 37 stopni i
szybkim odpłukaniu środka konserwującego, by nie dopuścić do zatrucia komórek
i szoku osmotycznego.
Materiał roślinny pochodzący z zawiesin komórkowych mrozi się w podobny
sposób.
Żywotne linie bakteryjne i drożdżowe
Bakterie i drożdże, z racji mniej skomplikowanego metabolizmu, naturalnych
przystosowań do trudnych warunków środowiska i posiadania ściany komórkowej,
łatwiej jest zachować przy życiu w stanie zamrożenia. Oczywiście są mikroby
wrażliwe, wymagające odpowiedniego przygotowania przed krioprezerwacją,
jednak poczciwa E. coli, czy S. cerevisiae, jak ii wiele innych gatunków nie
wymagają skomplikowanych procedur.
Kolonie w fazie wzrostu logarytmicznego (nigdy w fazie stacjonarnej ani
obumierania!) zawirowuje się i zawiesza w 15% roztworze glicerolu. Voila, teraz
po prostu nasze bakterie przechowujemy w -20 stopniach.
Do krótkotrwałego przechowywania (kilkudniowego) można wykorzystać
schładzane w lodówce szalki lub skosy agarowe, czasami także podłoża płynne.
Istnieje także możliwość wysuszenia naszych mikroogranizmów z zachowaniem
częściowej żywotności (nawet >50%) przy użyciu specjalnej aparatury do
sublimacji. W zamrożeniu z kultur odparowywana jest woda, dzięki czemu
otrzymujemy liofilizat, który może być przechowywany przez długi czas w
zamrożeniu czy też nawet w temperaturze pokojowej bez dostępu wody. Tą
technologią suszone są dobrej jakości drożdże piekarskie i winiarskie, które
kupujemy w saszetkach w sklepach spożywczych.
Ekstrakty komórkowe
Ekstrakty komórkowe nie muszą być utrzymane przy życiu, dlatego istnieje wiele
sposobów na ich przechowywanie.
Jeżeli zależy nam jedynie na materiale DNA lub plazmidowym, można po prostu
zawiesinę lub tkankę zamrozić w buforze. Mniej kłopotliwe w transporcie są
liofilizaty, które bez dostępu wody można przechowywać w temperaturze
pokojowej lub w lodówce.
Do otrzymania lizatów o jakości wystarczającej do badań białek należy się bardziej
przyłożyć. Jeżeli nasze eksperymenty zakładają użycie zdenaturowanych
polipeptydów- nie ma większego problemu, wystarczy inhibicja proteolizy i
zamrożenie lizatu. Jeżeli natomiast potrzebne nam są białka natywne,
postępujemy z reguły tak, jak z hodowlami komórkowymi- zawieszamy lizat w
odpowiednim buforze (zawiera inhibitory proteaz, chelatory i/lub krioprotektanty),
następnie zanurzamy w ciekłym azocie i przechowujemy w co najmniej -70
stopniach. Jeżeli białka które badamy są stabilne (np. kolageny) lub występują w
dużych ilościach w komórce (albuminy, kazeina), możemy spróbować liofilizacji
jako tańszej i mniej kłopotliwej alternatywy.
Przechowywanie krótkoterminowe w lodówce, od kilku dni do nawet miesiąca
czasu jest możliwe przy zastosowaniu buforów zawierających substancje
bakteriobójcze i inhibitory proteaz.
Wycinki tkankowe i bioptaty
Konserwacja skrawków do badań histopatologicznych jest standardowo
wykonywana w pracowniach patologii i polega na maceracji wycinka tkankowego
w zbuforowanym roztworze 10% formaliny, następnie zaś zatopieniu skrawka w
kostce parafiny. Tzw. „bloczki” parafinowe można przechowywać latami bez dużej
straty właściwości biologicznych. O ile RNA w takich kostkach ulega szybkiej lizie,
o tyle chromatyna jądrowa i większość białek (aczkolwiek te częściowo
denaturują) pozostaje nietknięta. Możliwe jest więc prowadzenie analiz
retrospektywnych na DNA (techniki biologii molekularnej i FISH) oraz badań
immunohistochemicznych i histochemicznych. By przygotować preparat
mikroskopowy i wybarwić tkankę należy z bloczka odciąć na mikrotomie
odpowiednie skrawki, „odparafinować” je i wybarwić.
Krótkotrwałe (kilka dni lub tygodni) przechowywanie preparatów tkankowych
możliwe jest w zbuforowanym roztworze formaliny.
Rozmazy cytologiczne
W zależności od typu rozmazu (szpik i krew obwodowa, materiał z biopsji
aspiracyjnych BAC, cytologia ginekologiczna, rozmazy płynów wysiękowych itd.)
stosuje się różne techniki wykonywania rozmazów i różne barwienia.
Przechowywanie takich rozmazów polega w dużym uogólnieniu na przygotowaniu
niebarwionych szkiełek z naniesionym odpowiednio materiałem w kilku (co
najmniej 2) powtórzeniach, dobrym osuszeniu szkiełek, a następnie archiwizacji
ich w suchym i ciemnym pomieszczeniu. Materiał utrwalony na szkiełkach zwykle
nadaje się do barwień cytochemicznych, czasami możliwe jest otrzymanie małych
ilości DNA z takich próbek do badań molekularnych, ale jest ono znacznie gorszej
jakości (i w mniejszej ilości) niż z bloczków parafinowych. Różnie bywa z
oznaczeniami białek: są one często mocno zdenaturowane i mogą nie wykazywać
właściwości antygenowych niezbędnych np. do immunolokalizacji przeciwciałami
mono, a nawet poliklonalnymi.
Preparaty barwione niektórymi barwnikami strąceniowymi można przechowywać
w ciemnym pomieszczeniu przez dłuższy czas, jednak część barwień bleknie już
po kilku dniach (np. FAG) lub tygodniach (barwienia immunofluorescencyjne, np.
FISH)
Jądra komórkowe do techniki FISH
Do badań cytogenetycznych wykorzystuje się bioptaty tkankowe lub świeże
zawiesiny komórkowe. Gdy nie jest możliwe wykonanie badania FISH od razu, lub
gdy zaistnieje potrzeba przechowania prób pochodzących z zawiesiny komórek
(np.w onkologii), można je przechować w dwojaki sposób: albo w postaci
utrwalonych, niewybarwionych szkiełek przechowanych w < -70 stopniach, lub
jako zawiesina komórek utrwalona w mieszaninie metanol-kwas octowy,
przechowywana w zamrożeniu. Bardziej polecana jest ta druga metoda, gdyż
materiał po wykonaniu FISHa jest lepszej jakości niż po nałożeniu na gotowe,
przemrożone szkiełka.
Co do skrawków parafinowych do FISH, postępowanie nie różni się od tego
opisanego w punkcie 4.
Piśmiennictwo:
1. Riggio B. A Beginner’s Guide to Storing Biological Materials. Bitesize Bio, 30
July 2012.
2. El-Danasouri I., Selman H. Vitrification versus conventional cryopreservation
technique. MEFSJ, Bioline, 2005, 10, 3: 205-206.
3. Millipore technical publications: Cell Lysate Extracts-General Protocols, 2007.
Data publikacji: 10.04.2015r.