Przygotowanie komórek kompetentnych Escherichia coli DH5α

Przygotowanie komórek kompetentnych Escherichia coli DH5α
Uwaga: wszystkie etapy
w warunkach sterylnych.
przygotowania
komórek
kompetentnych
przeprowadzać
1. płynne podłoże LB (objętość hodowli - 10 ml) zaszczepić przy pomocy 200 µl nocnej hodowli
bakterii E.coli i hodować w temperaturze 37°C w płynnej pożywce LB (bez antybiotyków) do uzyskania
OD600 w zakresie 0.3-0.5 (OD600 – ang. Optical Density, gęstość optyczna mierzona przy długości fali
600 nm);
2. pomiary OD600 przeprowadzić na spektrofotometrze: do plastikowej kuwety odpipetować 1.0 ml
hodowli, jako próbkę ślepą zastosować pożywkę hodowlaną LB. Zmierzyć absorbancję próbek przy
długości fali 600 nm, wartość absorbancji zapisać;
3. w momencie osiągnięcia przez bakterie OD600 0.3-0.5, przenieść je do lodu na 10 minut;
Uwaga: od tego etapu nie dopuszczać do wzrostu temperatury powyżej 4°C.
4. po inkubacji bakterie zwirować w sterylnych probówkach typu Falcon o objętości 15 ml (5000 x g,
10 min., 4°C);
5. w międzyczasie przygotować 500 µl buforu TSS 1x stężonego (2x stężony bufor TSS – 250 µl,
podłoże płynne LB – 225 µl, DMSO – 25 µl) i umieścić go w lodzie;
6. usunąć supernatant, a odwirowane komórki zawiesić w 500 µl schłodzonego buforu TSS 1x
stężonego – komórki stają się kompetentne;
7. zawiesinę komórek kompetentnych rozpipetować po 100 µl do odpowiednio podpisanych 5
sterylnych probówek Eppendorfa (trzymać w lodzie);
8. próbki zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w –70°C do następnych zajęć. Komórki mogą
być w tym stanie przechowywane nawet przez kilka lat bez utraty swoich właściwości. Należy jedynie
przestrzegać zasady, że porcja komórek raz rozmrożona nie może być ponownie zamrażana.
2xTSS (transformation and storage solution):
20% (wt/vol) PEG (8000),
100 mM MgCl2,
podłoże płynne LB.
1xTSS preparation:
10% (wt/vol) PEG (8000),
50 mM MgCl2,
podłoże płynne LB,
5% (vol/vol) DMSO.