ćwiczenie nr 5 analiza nmr produktów fermentacji alkoholowej

ĆWICZENIE NR 5
ANALIZA NMR PRODUKTÓW FERMENTACJI ALKOHOLOWEJ
Uwaga: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz kontakt z materiałem biologicznym, studenci
zobowiązani są uŜywać fartuchów i rękawiczek jednorazowych.
Fermentacja alkoholowa to proces rozkładu węglowodanów pod wpływem enzymów
wytwarzanych przez droŜdŜe z wytworzeniem alkoholu etylowego i CO2:
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2
Fermentację alkoholową moŜna prowadzić takŜe stosując jako substrat
wielocukry
(najczęściej skrobię, zawartą w ziemniakach lub zboŜu), które przez enzymy zostają
rozłoŜone na cukry proste, które następnie ulegają fermentacji.
W czasie fermentacji mogą powstawać w reakcjach ubocznych takŜe
niewielkie ilości innych związków (innych alkoholi - amylowego, izobutylowego,
propylowego oraz estrów, ketonów i kwasów organicznych), tworząc tzw. olej
fuzlowy, fuzel - ciecz o przykrym zapachu i smaku, pozostająca po oddestylowaniu
frakcyjnym alkoholu etylowego z surowego produktu fermentacji.
Enzymy prowadzące fermentację zostają unieczynnione po osiągnięciu
stęŜenia alkoholu etylowego około 15%. Aby otrzymać alkohol etylowy o wyŜszym
stęŜeniu, oraz oddzielić go od pozostałych składników procesu fermentacji
przeprowadza się wielokrotną destylację (rektyfikację), w wyniku, której powstaje
produkt zwany spirytusem rektyfikowanym. Ze względu na właściwości
fizykochemiczne etanolu w procesie prostej destylacji otrzymać moŜemy jedynie
spirytus o stęŜeniu etanolu 95% i zawierający 5% wody, tworzy on z wodą mieszaninę
azeotropową.
Własność T. Ruman. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania
1
W wyniku tego procesu powstaje równieŜ szereg produktów ubocznych, między innymi:
-
gliceryna,
kwas bursztynowy,
kwas octowy,
acetaldehyd,
diacetal,
propanol,
butanol,
kwas propionowy
wyŜsze alkohole i estry.
Substratami w fermentacji alkoholowej mogą byc:
-
sacharoza
glukoza, fruktoza
skrobia
celuloza (tylko w przypadku organizmów hydrolizujących celuloze)
Spektrometria NMR
a) Spin jądrowy i rozszczepienie poziomów energetycznych w polu magnetycznym.
Jądra atomowe takie jak 1H i 13C nie posiadają całkowitego spinu. Reguły do
wyznaczenia spinu jąder przestawiono poniŜej:
JeŜeli liczba protonów i liczba neutronów jest parzysta, wówczas jądro nie posiada spinu
JeŜeli suma ilości neutronów i protonów jest nieparzysta, wówczas jądro posiada spin
połówkowy (np. ½, 3/2 ,5/2)
JeŜeli ilości protonów i neutronów są nieparzyste, wówczas jądro posiada spin całkowity
(np. 1, 2, 3)
Mechanizm kwantowy mówi nam, Ŝe jądro o spinie I będzie miało 2I+1 moŜliwych
orientacji, np. w przypadku jądra o spinie ½ posiada ono dwa moŜliwe kierunki. W przypadku
braku zewnętrznego pola magnetycznego wszystkie orientacje mają tą samą energię. JeŜeli
zostanie zastosowane pole magnetyczne wówczas nastąpi rozszczepienie poziomów
energetycznych:
b) Przesunięcie chemiczne
Przesunięcie chemiczne wynika z magnetycznego przesłaniania (jądro absorbuje
promieniowanie magnetyczne o wyŜszych częstotliwościach, przesunięcie w prawo na
widmie) lub odsłaniania (absorpcja promieniowania o niŜszych częstościach, przesunięcie w
lewo) jądra przez gęstość elektronową
Własność T. Ruman. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania
2
Przesunięcie chemiczne (δ) obliczane jest wg wzoru:
δ=
ν X −ν R
⋅ 106 [ ppm]
ν NMR
gdzie νX jest to częstotliwość rezonansowa mierzonego jądra, νR – częstotliwość rezonansowa
wzorca, νNMR – częstotliwość podstawowa instrumentu NMR dla danego jądra.
SprzęŜenie spinowo-spinowe sygnału ma miejsce w obecności innych jąder aktywnych
magnetycznie odległych max o 3 wiązania (wyjątki: układy sprzęŜonych wiązań podwójnych
i aromatyczne – więcej wiązań; układy alifatyczno-aromatyczne – brak sprzęŜenie pomiędzy
częścią alifatyczną i aromatyczną)
Multipletowość (krotność rozszczepienia sygnału): 2nI+1 dla n równocennych jąder
sąsiadujących o spinie I, tzn.
• singlet dla 1H przy braku jąder sąsiadujących,
• dublet dla 1 atomów H sąsiadujących
• tryplet dla 2 atomów H sąsiadujących
• kwartet dla 3 atomów H sąsiadujących itd.
c) 1H NMR. Najczęściej stosowaną metodą NMR jest 1H NMR. Widma tego typu pokazują
charakter i zróŜnicowanie atomów wodoru w cząsteczce:
Widmo 1H NMR etanolu w CDCl3:
Własność T. Ruman. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania
3
Widmo 1H NMR etanolu w D2O
Własność T. Ruman. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania
4
Opis wykonania ćwiczenia
1. Fermentacja alkoholowa
a). Do kolby stoŜkowej o pojemności 500 ml rozpuścić 100g sacharozy w 200ml
wody.
b). Do uzyskanego roztworu wprowadzić 20g świeŜych droŜdŜy i 120ml wody.
c). Kolbę zamknąć korkiem zaopatrzonym rurką fermentacyjną. Proces prowadzić
przez 7 dni w 24°C.
d) Z uzyskanej zawiesiny pobrać 2ml; oddzielić stałą frakcję odwirowując próbkę;
uzyskaną ciecz przekazać prowadzącemu ćwiczenie
2. Analiza NMR
Zapoznać się z widmem 1H NMR uzyskanym od prowadzącego. Wyszukać rezonanse
odpowiadające grupom CH2 i CH3 w widmie i porównać z widmami wzorcowymi.
Określić stęŜenie etanolu na podstawie porównania powierzchni rezonansów etanolu z
powierzchnią rezonansów wzorca.
Własność T. Ruman. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania
5