Mycobacterium tuberculosis
Transkrypt
Mycobacterium tuberculosis
COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis MTB DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. Informacja dotycząca zamówienia AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation Kit RSP PREP 100 Tests P/N: 20756903 122 ART: 07 5690 3 US: 83267 AMPLICOR® M. tuberculosis Positive Control Kit MTB CTL 10 Sets P/N: 20756954 122 ART: 07 5695 4 US: 83263 AMPLICOR® Mycobacterium Amplification Kit MYCO AMP 96 Tests P/N: 20756784 122 ART: 07 5678 4 US: 83258 COBAS® AMPLICOR® M. tuberculosis Detection Kit MTB DK 100 Tests P/N: 20757551 122 ART: 07 5755 1 US: 83279 COBAS® AMPLICOR® Detection Reagents Kit DK 100 Tests P/N: 20757470 122 ART: 07 5747 0 US: 83276 COBAS® AMPLICOR® Conjugate Detection Reagent CN4 200 Tests P/N: 20764213 123 ART: 07 6421 3 US: 83305 COBAS® AMPLICOR® Wash Buffer WB 500 Tests P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314 COBAS® AMPLICOR® Internal Control Detection Kit 6/2007, Revision 4.0 IC DK 100 Tests COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test P/N: 20757608 122 ART: 07 5760 8 US: 83281 1/30 P/N: 03032129 049 Poniższy zestaw służy do detekcji kontroli wewnętrznej Mycobacterium amplifikowanej przy użyciu zestawu do amplifikacji AMPLICOR® Mycobacterium. Detekcja kontroli wewnętrznej jest opcjonalna dla użytkownika. Przeznaczenie Test COBAS® AMPLICOR® na obecność Mycobacterium tuberculosis (MTB) jest testem przeznaczonym do jakościowej detekcji in vitro bakterii kompleksu M. tuberculosis w próbkach klinicznych na analizatorze COBAS® AMPLICOR®. Test wykorzystuje łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) oraz technikę amplifikacji i hybrydyzacji kwasów nukleinowych do detekcji bakterii kompleksu M. tuberculosis w ciekłych, odkażonych i zagęszczonych próbkach pobranych z układu oddechowego ludzi, obejmujących odkrztuszoną i indukowaną plwocinę, popłuczyny oskrzelowe i popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL). Podsumowanie i objaśnienie testu Prątki są to kwasooporne, nieruchome bakterie tlenowe w kształcie pałeczek, nietworzące form przetrwalnikowych. Grupa ta zawiera kilka gatunków patogennych dla ludzi. Wiele gatunków prątków jest saprofitami w glebie i wodzie. Głównymi ludzkimi patogenami są gatunki kompleksu Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum i M. microti) oraz M. leprae. M. tuberculosis jest najważniejszym patogenem z grupy prątków. M. tuberculosis występuje tylko u ludzi, którzy stanowią jego rezerwuar; prątki gruźlicy rozprzestrzeniają się w populacji w drodze zakażenia kropelkowego. Około jedna trzecia populacji na całym świecie to nosiciele M. tuberculosis obarczeni ryzykiem rozwoju choroby. Szacunkowa liczba osób aktualnie zakażonych prątkami gruźlicy w Stanach Zjednoczonych wynosi 15 milionów, a rocznie odnotowuje się 18 000 przypadków czynnej gruźlicy1. M. tuberculosis może wywoływać przewlekłą chorobę płuc, ale również może prowadzić do zakażenia dowolnego narządu ludzkiego organizmu. Z uwagi na niebezpieczeństwo rozprzestrzeniania się choroby, możliwość rozwoju szczepów lekoopornych oraz ciężki przebieg schorzenia u osób zakażonych wirusem HIV-1, szybka diagnostyka mikroorganizmów kompleksu M. tuberculosis jest niezmiernie ważna. W skali całego świata gruźlica odpowiada za 3 miliony zgonów rocznie oraz 26% przypadków zgonów osób dorosłych w krajach rozwijających się, których można by było uniknąć1–5. Do ostatecznego rozpoznania gruźlicy konieczna jest izolacja drobnoustroju należącego do kompleksu M. tuberculosis. Rutynowe hodowle bakteryjne są czasochłonne, uzyskanie ostatecznej diagnozy może trwać do ośmiu tygodni. Najszybszą metodą detekcji prątków jest badanie mikroskopowe rozmazów kwasoopornych, jest ona jednak mało czuła i nieswoista. Techniki immunologiczne i serologiczne mają ograniczoną wartość z uwagi na słabą czułość i/lub swoistość6,7. Analiza kwasów mykolowych pochodzących z prątków przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej stanowi użyteczne uzupełnienie hodowli i badań biochemicznych8. Gatunkowo swoiste sondy z kwasów nukleinowych znacząco poprawiły możliwość szybkiego potwierdzenia wyników hodowli bakteryjnej w przypadku kilku gatunków prątków9. Udowodniono, że opracowanie swoistych dla prątków testów opartych na PCR w dalszym stopniu usprawniło szybką diagnostykę gruźlicy, umożliwiając bezpośrednią detekcję prątków w próbkach klinicznych10–22. Zasady procedury Test COBAS® AMPLICOR® MTB jest oparty na czterech głównych procesach: przygotowanie próbki; amplifikacja PCR23,24 docelowego DNA przy użyciu primerów biotynylowanych; hybrydyzacja produktów amplifikacji do sond oligonukleotydowych swoistych dla elementu docelowego (elementów docelowych); oraz detekcja produktów amplifikacji związanych z sondami metodą kolorymetryczną. 2/30 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test Test COBAS® AMPLICOR® MTB pozwala na jednoczesną amplifikację docelowego DNA kompleksu M. tuberculosis oraz wewnętrznej kontroli DNA Mycobacterium. Odczynnik Master Mix zawiera parę biotynylowanych primerów swoistych zarówno dla MTB, jak i dla kontroli wewnętrznej Mycobacterium. Detekcja zamplifikowanego DNA kontroli wewnętrznej Mycobacterium jest opcjonalna i zależna od użytkownika. Przygotowanie próbki Próbki pochodzące z układu oddechowego ludzi, obejmujące odkrztuszoną lub indukowaną plwocinę, popłuczyny oskrzelowe i BAL (popłuczyny oskrzelowopęcherzykowe), upłynnione i odkażone za pomocą NALC-NaOH25, NaOH25 lub SDS-NaOH26,27, po zagęszczeniu są przemywane roztworem do przemywania próbek z dróg oddechowych. Drobnoustroje ulegają lizie przez inkubację w odczynniku lizującym do próbek z dróg oddechowych, a próbka po dodaniu odczynnika neutralizującego do próbek z dróg oddechowych jest gotowa do amplifikacji. Amplifikacja PCR Wybór sekwencji docelowej Wybór docelowej sekwencji DNA jest uzależniony od identyfikacji regionów w obrębie genomu prątka wykazujących maksymalny konserwatyzm spośród gatunków kompleksu M. tuberculosis. Co za tym idzie, właściwa selekcja primerów i sondy ma kluczowe znaczenie dla zdolności testu do wykrycia wszystkich drobnoustrojów należących do kompleksu M. tuberculosis. Genom Mycobacterium zawiera region liczący około 1500 nukleotydów, który koduje gen dla 16S rRNA. Test COBAS® AMPLICOR® MTB wykorzystuje swoiste dla gatunku Mycobacterium biotynylowane primery KY18 i KY75 w celu określenia sekwencji około 584 nukleotydów w tym regionie.28,29,30 Amplifikacja sekwencji docelowej Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (A-tubes), gdzie zachodzi PCR. Mieszanina reakcyjna jest podgrzewana w celu denaturacji dwuniciowej helisy DNA oraz odsłonięcia sekwencji docelowych primerów. Po ochłodzeniu się mieszaniny, biotynylowane primery KY18 i KY75 ulegają przyłączeniu do docelowej nici DNA. Termostabilna polimeraza DNA pochodząca z bakterii Thermus aquaticus (Taq pol) w obecności jonów Mg2+ i nadmiaru trójfosforanów dezoksynukleotydów (dNTP), w tym trójfosforanu dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny (zamiast dezoksytymidyny), wydłuża zhybrydyzowane primery wzdłuż sekwencji docelowych i tworzy sekwencję DNA zwaną amplikonem. Analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich skutecznie podwajając ilość DNA amplikonu. Amplifikacja kontroli wewnętrznej W procesach amplifikacji wykorzystujących enzymy, takich jak PCR, zawartość inhibitorów w próbce klinicznej może skutkować zmniejszoną wydajnością amplifikacji. Do testu COBAS® AMPLICOR® MTB dodano kontrolę wewnętrzną Mycobacterium, aby umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR. Kontrola wewnętrzna Mycobacterium jest to plazmid DNA z regionami wiążącymi primery identycznymi jak te w sekwencji DNA MTB, losową sekwencją wewnętrzną o podobnej długości i składzie zasad jak sekwencja docelowa MTB, oraz unikatowym regionem wiążącym sondę, który pozwala na odróżnienie kontroli wewnętrznej Mycobacterium od amplikonu docelowego. Powyższe cechy wybrano, aby zapewnić równoważną amplifikację DNA kontroli wewnętrznej Mycobacterium i badanego MTB. Kontrola wewnętrzna Mycobacterium jest wprowadzana do każdej z reakcji amplifikacji i ulega równoczesnej amplifikacji z DNA docelowym próbki klinicznej. Detekcja kontroli wewnętrznej MTB jest opcjonalna i zależna od użytkownika. 6/2007, Revision 4.0 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 3/30 Amplifikacja wybiórcza Wybiórczą amplifikację docelowego DNA z próbki klinicznej w teście COBAS® AMPLICOR® MTB uzyskano dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase LD (uracyloN-glikozylazy)31. Enzym AmpErase LD został oczyszczony, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenie bakteryjnym DNA. Enzym AmpErase LD rozpoznaje i katalizuje rozkład nici DNA zawierających dezoksyurydynę, nie wpływając na DNA zawierający dezoksytymidynę. Dezoksyurydyna nie jest obecna w występującym w naturze DNA, lecz jest zawsze obecna w amplikonie z uwagi na użycie trójfosforanu dezoksyurydyny w miejsce trójfosforanu dezoksytymidyny jako jednego z dNTP w odczynniku Master Mix. Dlatego też tylko amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase LD przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase LD katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym w pH zasadowym odczynnika Master Mix, łańcuch amplikonu DNA pęka w pozycji dezoksyurydyny, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase LD jest nieczynny w temperaturach powyżej 55°C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu docelowego. Po amplifikacji całość pozostałego enzymu ulega denaturacji przez dodanie roztworu denaturującego, zapobiegając w ten sposób degradacji dowolnego amplikonu docelowego. Wykazano, że enzym AmpErase LD w teście COBAS® AMPLICOR® MTB inaktywuje co najmniej 103 kopii amplikonu MTB zawierającego dezoksyurydynę na jedną reakcję PCR. Reakcja hybrydyzacji Po amplifikacji PCR, analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie dodaje roztwór denaturujący do probówek A-tube w celu chemicznej denaturacji amplikonu MTB oraz amplikonu wewnętrznej kontroli Mycobacterium i uzyskania jednoniciowego DNA. Próbki zdenaturowanego amplikonu przenosi się następnie do naczynek D używanych do oznaczeń. Do poszczególnych naczynek D dodaje się zawiesiny magnetycznych cząsteczek pokrytych sondą oligonukleotydową swoistą dla kompleksu M. tuberculosis (KY172T3) lub wewnętrznej kontroli Mycobacterium (SK535). Znakowane biotyną amplikony MTB i wewnętrzna kontrola Mycobacterium ulegają hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału sondami oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Hybrydyzacja amplikonów ze swoistą dla badanego materiału sondą zwiększa ogólną swoistość testu. Reakcja detekcji Bezpośrednio po reakcji hybrydyzacji analizator COBAS® AMPLICOR® przepłukuje cząstki magnetyczne w naczynkach D w celu usunięcia niezwiązanego materiału, a następnie dodaje koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej. Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej wiąże się ze znakowanymi biotyną amplikonami, które uległy hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału sondami oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Analizator COBAS® AMPLICOR® usuwa niezwiązany kompleks, płucząc cząsteczki magnetyczne, a następnie do każdego naczynka D dodaje roztwór substratów zawierający nadtlenek wodoru oraz 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB). W obecności nadtlenku wodoru peroksydaza chrzanowa związana z cząsteczkami katalizuje utlenianie TMB, tworząc barwny kompleks, którego absorbancję mierzy analizator COBAS® AMPLICOR® przy długości fali 660 nm. 4/30 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test Odczynniki RSP PREP AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation Kit AMPLICOR® zestaw do przygotowywania próbek z dróg oddechowych 100 testów P/N: 20756903 122 ART: 07 5690 3 US: 83267 2 x 25 ml RW (roztwór do przemywania próbek z dróg oddechowych) bufor Tris-HCl < 1% substancja ułatwiająca rozpuszczanie EDTA 0,05% azydek sodu RL (odczynnik lizujący do próbek z dróg oddechowych) 0,2% wodorotlenek sodu < 1% substancja ułatwiająca rozpuszczanie EDTA 0,05% azydek sodu 3 x 6 ml RN (odczynnik neutralizujący do próbek z dróg oddechowych) bufor Tris-HCl chlorek magnezu 0,05% azydek sodu 2 x 5 ml MTB CTL 10 zestawów P/N: 20756954 122 AMPLICOR® M. tuberculosis Positive Control Kit ART: 07 5695 4 US: 83263 AMPLICOR® M. tuberculosis zestaw kontroli dodatniej MTB (+) C [kontrola (+) M. tuberculosis] bufor Tris-HCl < 0,001% niezakaźny plazmid DNA (bakteryjny) zawierający sekwencje M. tuberculosis < 0,005% poly rA RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu 10 × 0,75 ml AMPLICOR® Mycobacterium MYCO AMP 96 testów P/N: 20756784 122 Amplification Kit ART: 07 5678 4 US: 83258 AMPLICOR® Mycobacterium zestaw do amplifikacji MYCO MMX (Odczynnik Mycobacterium Master Mix) bufor Tris-HCl glicerol < 0,01% AmpliTaq® (polimeraza DNA Taq, bakteryjna) < 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP < 0,005% primery KY18 i KY75, biotynylowane 0,05% azydek sodu 6/2007, Revision 4.0 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 3 x 1,7 ml 5/30 3 x 0,1 ml AmpErase LD enzyme (uracylo-N-glikozylaza z niską zawartością DNA) bufor Tris-HCl < 0,01% uracylo-N-glikozylaza (bakteryjna) EDTA ditiotreitol glicerol < 1% substancja ułatwiająca rozpuszczanie chlorek sodu 0,05% azydek sodu MYCO IC 3 x 0,1 ml (kontrola wewnętrzna Mycobacterium) bufor Tris-HCl < 0,001% niezakaźny plazmid DNA (bakteryjny) zawierający sekwencje wiążące Mycobacterium, identyczne z docelowym DNA MTB i unikatowy region wiążący sondę. < 0,005% poly rA RNA (syntetyczny) EDTA barwnik amarantowy 0,05% azydek sodu MYCO (–) C [kontrola (–) Mycobacterium] bufor Tris-HCl < 0,005% poly rA RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu 1 x 0,75 ml 100 testów P/N: 20757551 122 COBAS® AMPLICOR® MTB DK M. tuberculosis Detection Kit ART: 07 5755 1 COBAS® AMPLICOR® zestaw do detekcji M. tuberculosis US: 83279 MT PS1 1 x 100 testów (zawiesina 1 sondy MTB) bufor MES < 0,3% zawiesina cząsteczek Dynabeads® (o właściwościach paramagnetycznych) pokrytych oligonukleotydową sondą wychwytującą, swoistą dla MTB (KY172T3) 0,09% azydek sodu MT4 (zawiesina 2 sondy MTB) bufor fosforanu sodu 29,9% tiocyjanian sodu chlorek sodu < 0,2% substancja ułatwiająca rozpuszczalność 29,9% (udział wagowy) tiocyjanian sodu + Xn 1 x 100 testów Produkt szkodliwy 6/30 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test DK COBAS® AMPLICOR® 100 testów P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS® AMPLICOR® zestaw odczynników do detekcji US: 83276 DN4 (roztwór denaturujący) 1,6% wodorotlenek sodu EDTA błękit tymolowy 1,6% (udział wagowy) wodorotlenek sodu + Xi 1 x 100 testów Produkt drażniący CN4 1 x 100 testów (koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) bufor Tris-HCl < 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej surowicza albumina bydlęca (ssacza) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% substancja konserwująca ProClin® 150 SB3 (substrat A) roztwór cytrynianu 0,01% nadtlenek wodoru 0,1% substancja konserwująca ProClin® 150 5 x 75 testów SB (substrat B) 0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB) 40% dimetyloformamid (DMF) 5 x 5 ml T 40% (udział wagowy) dimetyloformamid (DMF) Produkt toksyczny 6/2007, Revision 4.0 R: 61-20/21-36 Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. Działa szkodliwie przez drogi oddechowe i w kontakcie ze skórą. Działa drażniąco na oczy. S: 53-45 Unikać narażenia - przed użyciem zapoznać się z instrukcją. W przypadku awarii lub jeżeli źle się poczujesz, niezwłocznie zasięgnij porady lekarza - jeżeli to możliwe, pokaż etykietę. COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 7/30 CN4 COBAS® AMPLICOR® 200 testów P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS® AMPLICOR® odczynnik do detekcji koniugatu US: 83305 CN4 2 x 100 testów (koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) bufor Tris-HCl < 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej surowicza albumina bydlęca (ssacza) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% substancja konserwująca ProClin® 150 WB COBAS® AMPLICOR® Wash Buffer COBAS® AMPLICOR® bufor płuczący 500 testów P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314 WB (10X-koncentrat płuczący) < 2% bufor fosforanowy < 9% chlorek sodu EDTA < 2% detergent 0,5% substancja konserwująca ProClin® 300 2 x 250 testów Ostrzeżenia i środki ostrożności Do stosowania w diagnostyce in vitro. Niniejszy test jest przeznaczony do użycia wyłącznie z upłynnionymi, odkażonymi i zagęszczonymi próbkami pobranymi z układu oddechowego od ludzi, włączając odkrztuszoną i indukowaną plwocinę, popłuczyny oskrzelowe i BAL, które zostały upłynnione, odkażone i zagęszczone przy użyciu metod wykorzystujących NALC-NaOH25, NaOH25 lub SDS-NaOH26,27. Nie pipetować za pomocą ust. Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Przy obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami z zestawów stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami testowymi. Unikać skażenia odczynników bakteriami podczas pobierania porcji z butelek z odczynnikami. Zaleca się stosowanie jałowych, jednorazowych pipet oraz końcówek pipet. Nie łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii. Wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. Nie używać zestawu po upływie daty ważności. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheets – MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. Praca w laboratorium musi przebiegać w sposób jednokierunkowy – należy ją rozpocząć w obszarze przedamplifikacyjnym i przemieszczać się jednokierunkowo w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności poprzedzające 8/30 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test proces amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania odczynników, a następnie przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej czynności poprzedzającej proces amplifikacji; nie wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym obszarze konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki lub pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym. Z próbkami należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w dokumentach Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories32 oraz w CLSI Document M29-A333. Dokładnie wyczyścić i zdezynfekować odpowiednim roztworem dezynfekującym wszystkie powierzchnie pracy. Odczynniki RW, RL, RN, MYCO MMX, AmpErase LD enzyme, MYCO IC, MTB (+) C, MYCO (–) C i MT PS1 zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. Podczas obchodzenia się z odczynnikami RW, RL, RN, MYCO MMX, MT4, DN4, CN4, SB3, SB i substratem roboczym (zmieszane odczynniki SB3 i SB) należy mieć na sobie ochronę oczu, fartuch laboratoryjny i jednorazowe rękawiczki. Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą. Należy unikać kontaktu SB i substratu roboczego ze skórą i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, natychmiast spłukać dużą ilością wody. Dimetyloformamid zawarty w SB i substracie roboczym może działać szkodliwe na płód w łonie matki; opisywano ponadto działania toksyczne po doustnym przyjęciu dużych dawek. Należy unikać kontaktu ze skórą, wdychania oparów oraz spożycia. Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, dokładnie spłukać za pomocą mydła i wody oraz natychmiast zwrócić się o pomoc medyczną. Do przygotowania próbek i kontroli należy bezwzględnie używać probówek zakręcanych, aby uniknąć rozpryśnięcia próbki i możliwości krzyżowego skażenia próbek. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. Wymagania dotyczące przechowywania i użytkowania Nie zamrażać odczynników. RW, RL i RN należy przechowywać w temperaturze 2–25°C. Jeżeli nie zostały otwarte, odczynniki te są trwałe do upływu wymienionej daty ważności. Odczynniki MYCO MMX, MYCO IC i AmpErase LD enzyme należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Jeżeli nie zostały otwarte, odczynniki te są trwałe do upływu wymienionej daty ważności. Po otwarciu odczynnik roboczy Master Mix (przygotowany przez dodanie enzymu AmpErase LD enzyme i odczynnika MYCO IC do MYCO MMX) musi być przechowywany w temperaturze 2–8°C i jest trwały przez 4 tygodnie. 6/2007, Revision 4.0 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 9/30 MTB (+) C i MYCO (–) C należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Odczynniki te są trwałe do upływu podanej daty ważności. Przechowywać MT PS1 i MT4 w temperaturze 2–8°C. Odczynniki te są trwałe do upływu podanej daty ważności. Po zmieszaniu MT PS1 i MT4 odczynnik roboczy jest trwały przez 30 dni w temperaturze 2–8°C. Odczynnik roboczy może być używany maksymalnie przez sześć cykli pracy urządzenia (12 godzin na cykl) i pomiędzy cyklami pracy urządzenia musi być przechowywany w temperaturze 2–8°C. DN4 należy przechowywać w temperaturze 2–25°C. DN4 jest trwały do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu DN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze 2–8°C lub do upływu daty ważności (zależnie od tego, który termin jest wcześniejszy). DN4 można stosować w ciągu maksymalnie sześciu cykli pracy urządzenia (12 godzin na cykl), a między poszczególnymi cyklami należy go przechowywać w temperaturze 2–8°C. CN4 należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. CN4 jest trwały do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu CN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze 2–8°C lub do upływu daty ważności (zależnie od tego, który termin jest wcześniejszy). CN4 można stosować w ciągu maksymalnie sześciu cykli pracy urządzenia (12 godzin na cykl), a między poszczególnymi cyklami należy go przechowywać w temperaturze 2–8°C. SB3 i SB należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Jeżeli nie zostały otwarte, odczynniki te są trwałe do upływu podanej daty ważności. Substrat roboczy musi być przygotowywany codziennie przez zmieszanie SB3 z SB. Substrat roboczy w analizatorze COBAS® AMPLICOR® jest trwały przez 16 godzin. SB3, SB ani substratu roboczego nie należy poddawać działaniu metali, środków utleniających lub bezpośredniego światła. WB należy przechowywać w temperaturze 2–30°C. WB jest trwały do upływu podanej daty ważności. Zbadać WB oraz, jeżeli jest to konieczne, ogrzać w 30–37°C w celu ponownego rozpuszczenia ewentualnego osadu. Roboczy bufor płuczący (1X), przygotowany przez rozcieńczenie WB wodą destylowaną lub dejonizowaną, powinien być przechowywany w pojemniku na bufor płuczący analizatora COBAS® AMPLICOR® w temperaturze 2–25°C; bufor jest trwały przez 2 tygodnie od daty przygotowania. Pomiędzy przebiegami pracy urządzenia częściowo zużyte odczynniki służące do detekcji należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Przed wprowadzeniem do analizatora COBAS® AMPLICOR® odczynników z otwartych opakowań lub odczynników roboczych należy sprawdzić ich datę ważności. Dostarczane materiały AMPLICOR® Respiratory RSP PREP Specimen Preparation Kit AMPLICOR® zestaw do przygotowywania próbek z dróg oddechowych P/N: 20756903 122 ART: 07 5690 3 US: 83267 RW (roztwór do przemywania próbek z dróg oddechowych) RL (odczynnik lizujący do próbek z dróg oddechowych) RN (odczynnik neutralizujący do próbek z dróg oddechowych) 10/30 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test AMPLICOR® M. tuberculosis MYCO CTL Positive Control Kit AMPLICOR® M. tuberculosis zestaw kontroli dodatniej P/N: 20756954 122 ART: 07 5695 4 US: 83263 MTB (+) C [kontrola (+) M. tuberculosis] AMPLICOR® Mycobacterium MYCO AMP Amplification Kit AMPLICOR® Mycobacterium zestaw do amplifikacji P/N: 20756784 122 ART: 07 5678 4 US: 83258 MYCO MMX (odczynnik Mycobacterium Master Mix) AmpErase LD enzyme (uracylo-N-glikozylaza z niską zawartością DNA) MYCO IC (kontrola wewnętrzna Mycobacterium) MYCO (–) C [kontrola (–) Mycobacterium] COBAS® AMPLICOR® MTB DK M. tuberculosis Detection Kit COBAS® AMPLICOR® zestaw do detekcji M. tuberculosis P/N: 20757551 122 ART: 07 5755 1 US: 83279 MT PS1 (zawiesina 1 sondy MTB) MT4 (zawiesina 2 sondy MTB) COBAS® AMPLICOR® DK Detection Reagents Kit COBAS® AMPLICOR® zestaw odczynników do detekcji P/N: 20757470 122 ART: 07 5747 0 US: 83276 DN4 (roztwór denaturujący) CN4 (koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) SB3 (substrat A) SB (substrat B) P/N: 20764213 123 COBAS® AMPLICOR® CN4 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS® AMPLICOR® odczynnik do detekcji koniugatu US: 83305 CN4 (koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) COBAS® AMPLICOR® Wash Buffer COBAS® AMPLICOR® bufor płuczący WB P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314 WB 10X-koncentrat płuczący 6/2007, Revision 4.0 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 11/30 Materiały wymagane, lecz niedostarczane Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania odczynników – Pierścień A przeznaczony do analizatora COBAS® AMPLICOR® z wbudowanymi 12 probówkami A-tube – Statyw pierścienia A przeznaczony do analizatora COBAS® AMPLICOR® – Pipeta Eppendorf Multipette® ze zbiorniczkiem Combitip® o pojemności 1,25 ml (jałowa, pojedynczo pakowana) – Pipetory (pojemność 100 µl)* z barierą aerozolową lub z końcówkami z wyrzutnikiem – Rękawice jednorazowe bezpudrowe Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania próbki i kontroli – Polipropylenowe probówki z zakręcanym korkiem o pojemności 1,5 ml, jałowe, niesilikonizowane, stożkowe (Sarstedt 72.692.105 lub odpowiednik)** – Statyw na probówki (Sarstedt 93.1428 lub odpowiednik) – Sterylne pipety transferowe z precyzyjną końcówką – Pipetory (pojemność 50 µl, 100 µl, 400 µl, 500 µl i 1000 µl)* z barierą aerozolową lub końcówkami z wyrzutnikiem – Mikrowirówka (maks. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M lub odpowiednik – Mieszadło wibracyjne – Blok grzejny 60°C ± 2°C – Rękawice jednorazowe bezpudrowe Obszar obróbki poamplifikacyjnej – obszar amplifikacji/detekcji – Analizator COBAS® AMPLICOR® z drukarką – Instrukcja obsługi analizatora COBAS® AMPLICOR® • Opcjonalnie: Oprogramowanie AMPLILINK obejmujące: – Stacja danych z oprogramowaniem AMPLILINK, wyposażona w drukarkę – Instrukcja obsługi programu AMPLILINK, wersja 2.4, do analizatora COBAS® AMPLICOR® (do użytku z programem AMPLILINK, v2.41) lub podręcznik obsługi programu AMPLILINK, wersja 3.2, do użytku z narzędziem COBAS® AmpliPrep oraz analizatorami COBAS® TaqMan®, COBAS® TaqMan® 48 i COBAS® AMPLICOR® (do użytku z programem AMPLILINK, v3.2) – – – – – – – Instrukcja metodyczna do testu COBAS® AMPLICOR® MTB Stojak na naczynka D Woda destylowana lub dejonizowana Pipety serologiczne o pojemności 5 ml Cylinder miarowy (o pojemności co najmniej 1 litra) Mieszadło wibracyjne Rękawice jednorazowe bezpudrowe * Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. Tam, gdzie jest to wskazane, konieczne jest stosowanie końcówek z barierą aerozolową lub wyrzutnikiem, aby zapobiec krzyżowemu skażeniu próbki i amplikonu. ** Do przygotowywania próbek oraz kontroli należy stosować probówki z zakręcanym korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i potencjalnemu skażeniu krzyżowemu próbek i kontroli. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. 12/30 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test Pobieranie, transport i przechowywanie próbek Uwaga Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. Pobieranie próbek Jedyne akceptowalne próbki z dróg oddechowych to: (a) odkrztuszona i indukowana plwocina; (b) popłuczyny oskrzelowe; oraz (c) BAL pobrane do sterylnych, plastikowych pojemników. Próbki te muszą być płynne, odkażone i zagęszczone przy użyciu metod wykorzystujących NALC-NaOH25, NaOH25 lub SDS-NaOH26,27. Transport próbek Odkażone próbki muszą być przewiezione do laboratorium w temperaturze 2–25°C pod warunkiem, że dotrą tam w ciągu 24 godzin od chwili pobrania. Jeżeli próbki nie dotrą do laboratorium w ciągu 24 godzin od chwili pobrania, będą musiały być przechowywane w temperaturze –70°C i transportowane na suchym lodzie. Próbki należy przesyłać zgodnie z wszystkimi przepisami krajowymi, wojewódzkimi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych34. Przechowywanie próbek Odkażone próbki można przechowywać w temperaturze –70°C do 8 miesięcy. Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze –70°C do 6 miesięcy lub do 4 dni w temperaturze 2–8°C. Instrukcja użytkowania Uwaga Aby uzyskać szczegółowe instrukcje użytkowania, informacje dotyczące drukowania wyników oraz interpretowania oznaczeń kodowych i komentarzy, należy sięgnąć do (1) instrukcji obsługi analizatora COBAS® AMPLICOR®, a (2) w razie korzystania z programu AMPLILINK, v2.41 należy zapoznać się z instrukcją obsługi programu AMPLILINK, wersja 2.4, do analizatora COBAS® AMPLICOR®, lub w przypadku korzystania z programu AMPLILINK, v3.2, należy zapoznać się z podręcznikiem obsługi programu AMPLILINK, wersja 3.2, do narzędzia COBAS® AmpliPrep, analizatorów: COBAS® TaqMan®, COBAS® TaqMan® 48 i COBAS® AMPLICOR®. Uwaga Jeśli obróbka próbki, amplifikacja i detekcja wykonywane są w jednym dniu roboczym, wykonać procedurę, jak opisano poniżej. Jeśli przygotowanie próbki wykonywane jest w dniu innym niż amplifikacja i detekcja, należy wykonać przygotowanie odczynników w tym samym dniu co amplifikację i detekcję. Uwaga Wszystkie odczynniki muszą mieć temperaturę otoczenia przed użyciem. Tam, gdzie jest to wskazane, należy używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Należy dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić selektywną amplifikację. Uwaga Do przygotowania próbek oraz kontroli należy używać probówek z zakręcanym korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i możliwości skażenia krzyżowego próbek. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. Przygotowanie odczynników Wykonywane w: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania odczynników 1. 6/2007, Revision 4.0 Ustalić odpowiednią liczbę pierścieni A potrzebnych do oznaczenia próbek pacjentów i kontrolnych. Przy każdej przeprowadzanej reakcji PCR należy uwzględnić jedną kontrolę (+) M. tuberculosis oraz jedną kontrolę (–) Mycobacterium (patrz rozdział „Kontrola jakości”). Umieścić pierścień A w odpowiednim statywie. COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 13/30 Uwaga Przygotowanie próbki i kontroli Uwaga 14/30 Nawet jeżeli nie będzie się przeprowadzać detekcji MYCO IC, należy dodać MYCO IC do odczynnika Master Mix. 2. Wymieszać probówkę z MYCO IC na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. Przygotować roboczy odczynnik Master Mix, dodając 100 µl MYCO IC i 100 µl enzymu AmpErase LD enzyme do jednej fiolki MYCO MMX (mieszanina wystarcza do przeprowadzenia 32 amplifikacji). Nie jest konieczne odmierzanie objętości odczynnika Master Mix. Dodać 100 µl MYCO IC i 100 µl enzymu AmpErase LD enzyme do pełnej fiolki z MYCO MMX. Zamknąć ponownie probówkę i dokładnie wymieszać zawartość, odwracając 10–15 razy. Nie mieszać roboczego odczynnika Master Mix na mieszadle wibracyjnym. Zanotować datę przygotowania odczynnika na fiolce. Wyrzucić puste fiolki po MYCO IC i enzymie AmpErase LD enzyme. Odczynnik roboczy Master Mix jest trwały przez 4 tygodnie w temperaturze 2–8°C. 3. Dodać 50 µl odczynnika roboczego Master Mix do każdej z probówek A-tube, używając pipetora powtarzalnego ze zbiorniczkiem Combitip o objętości 1,25 ml lub pipetora wyposażonego w barierę aerozolową lub końcówkę z wyrzutnikiem. W tym czasie nie należy zamykać korków probówek A-tube. 4. Umieścić pierścień A zawierający odczynnik roboczy Master Mix w plastikowej torebce przeznaczonej do wielokrotnego zamykania i zamknąć szczelnie torebkę. Przenieść pierścienie A do obszaru przedamplifikacyjnego – obszaru przygotowania próbki i kontroli. Pierścienie A zawierające odczynnik roboczy Master Mix należy przechowywać w temperaturze 2–8°C w obszarze przed amplifikacją – przygotowania próbek badanych i kontrolnych, do czasu zakończenia przygotowywania próbek badanych i kontrolnych. Odczynnik roboczy Master Mix jest trwały przez 24 godziny w temperaturze 2–8°C w probówkach A-tube umieszczonych w szczelnie zamkniętej torebce z tworzywa. Przeprowadzane w: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania próbki i kontroli Aby wykonać amplifikację przygotowanych próbek i kontroli należy najpierw wykonać kroki opisane w części „Przygotowanie odczynników”. Rozmrozić przygotowane próbki i próbki kontrolne w temperaturze pokojowej i przejść do etapu 10 z rozdziału „Przygotowanie próbki i kontroli”. 1. Na każdą próbkę oznaczyć jedną polipropylenową probówkę o pojemności 1,5 ml z zakręcanym korkiem oraz próbkę kontrolną. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. Oznaczyć każdą probówkę do przygotowania próbek numerem identyfikacyjnym próbki. 2. Dodać 500 µl RW do każdej probówki z próbką badaną. 3. Dodać 100 µl płynnej, odkażonej i zagęszczonej próbki z dróg oddechowych do probówki zawierającej RW. Zamknąć ponownie probówkę i mieszać przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym. 4. Odwirować przy prędkości ≥ 12 500 x g przez 10 minut. 5. Zaaspirować supernatant przy użyciu pipety transferowej z cienką końcówką i dodać 100 µl RL do peletki, używając do każdej próbki nowej końcówki do pipet z osłoną aerozolową. Mieszać przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym do czasu uzyskania zawiesiny z peletki. 6. Przygotować kontrole robocze w następujący sposób: COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test Uwaga Konieczne jest przygotowanie świeżych kontroli roboczych każdego dnia, w którym wykonywany jest test, a następnie należy je wyrzucić na koniec dnia. a. Wymieszać probówkę z MYCO (–) C przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym. Przenieść 100 µl MYCO (–) C do polipropylenowej probówki z zakrętką o pojemności 1,5 ml, używając pipetora z końcówką z barierą aerozolową. Dodać 400 µl RL. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. Przygotowana próbka jest kontrolą roboczą (–) Mycobacterium. b. Mieszać probówkę z MTB (+) C przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym. Przenieść 100 µl MTB (+) C do polipropylenowej probówki z zakrętką o pojemności 1,5 ml, używając pipetora z końcówką z barierą aerozolową. Dodać 400 µl RL. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. Przygotowana próbka jest kontrolą roboczą (+) M. tuberculosis. c. Przenieść 100 µl każdej z kontroli roboczych do polipropylenowej probówki o pojemności 1,5 ml z zakrętką i poddać obróbce równolegle z próbkami klinicznymi. 7. Inkubować próbki i kontrole w suchym bloku grzejnym w temperaturze 60°C ± 2°C przez 45 minut. 8. Wyjąć probówki z bloku grzejnego i odwirować pulsacyjnie przez 5 sekund, aby usunąć kondensat z zakrętki. 9. Przy użyciu pipetora z końcówką do pipet z osłoną aerozolową dodać 100 µl RN do każdej probówki z próbką i próbką kontrolną. Mieszać przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym przy połowie prędkości maksymalnej. Należy użyć nowej końcówki z osłoną aerozolową dla każdej próbki i kontroli. 10. Używając pipetora(-ów) z końcówką(-ami) z osłoną aerozolową, przenieść 50 µl każdej przygotowanej próbki chorego, kontroli roboczej (+) M. tuberculosis i kontroli roboczej (–) Mycobacterium do odpowiednich probówek A-tube z odczynnikiem roboczym Master Mix. Zachować ostrożność, aby uniknąć przeniesienia materiału, który mógł nie zostać ponownie zawieszony. Zamknąć probówki zakrętkami. Odnotować pozycję próbki (próbek) od chorych i próbki kontrolnej na mapie pierścienia A. 11. Przenieść przygotowane próbki (próbki od pacjentów i próbki kontrolne) w pierścieniach A do obszaru amplifikacji/detekcji. Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze 2–8°C do 8 godzin. Amplifikacja i detekcja Przeprowadzane w: Obszar obróbki poamplifikacyjnej – obszar amplifikacji/detekcji Należy wykonać następujące codzienne czynności serwisowe: 6/2007, Revision 4.0 – Przecierać stanowisko startowe przy użyciu wilgotnej szmatki pozbawionej kłaczków, a następnie osuszyć je. – Wytrzeć końcówkę statywu na naczynka D wilgotną ściereczką niezostawiającą włókien, a następnie wysuszyć. – Sprawdzić pojemnik buforu płuczącego i napełnić go w razie potrzeby. – Przygotować roboczy bufor płuczący (1X) w sposób podany poniżej. Zbadać WB oraz, jeżeli jest to konieczne, ogrzać w 30–37°C w celu ponownego rozpuszczenia ewentualnego osadu. Przygotować roboczy roztwór płuczący, dodając 1 objętość WB do 9 objętości wody destylowanej lub dejonizowanej. Dobrze wymieszać. Należy dbać o to, żeby w zbiornik buforu płuczącego przez cały czas zawierał co najmniej 3–4 litry buforu płuczącego (1X). COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 15/30 – Opróżnić pojemnik na resztki. – Uruchomić analizator COBAS® AMPLICOR®. – Podczas uruchamiania systemu sprawdzić strzykawki i przewody. – Podczas uruchamiania sprawdzić końcówkę transferową. Przed każdym przebiegiem oznaczeń: – Sprawdzić pojemnik na resztki i opróżnić, jeśli to konieczne. – Sprawdzić pojemnik buforu płuczącego i dodać bufor, jeśli to konieczne. – Usunąć zużyte statywy na naczynka D. – Uruchomić analizator COBAS® AMPLICOR®. Uruchamianie i obsługa systemu analizatora COBAS® AMPLICOR® 1. Sprawdzić ilości odczynników wewnątrz analizatora COBAS® AMPLICOR®. Przygotować wystarczającą liczbę kaset z odczynnikami do wykonania analizy wprowadzonych próbek. 2. Dokładnie wymieszać MT PS1 na mieszadle wibracyjnym. Dodać 2,5 ml MT PS1 do kasety z MT4. Umieścić kasetę w statywie dla odczynników specyficznych dla określonego testu. Usunąć zużytą fiolkę MT PS1. Zanotować datę przygotowania odczynnika na kasecie MT4. Uwaga Jeżeli nie będzie wykonywana detekcja kontroli wewnętrznej, przejść do etapu 4. W przeciwnym razie kontynuować etap 3. 3. Dokładnie wymieszać IC PS1 na mieszadle wibracyjnym. Dodać 2,5 ml IC PS1 do kasety z IC4. Umieścić kasetę w statywie dla odczynników specyficznych dla określonego testu. Usunąć zużytą fiolkę IC PS1. Zanotować datę przygotowania odczynnika na kasecie IC4. 4. Przygotować roztwór substratu roboczego, odpipetowując 5 ml SB do jednej kasety z SB3. Aby wymieszać roztwór, kilkakrotnie nabrać i usunąć płyn z pipety. Wyrzucić zużytą fiolkę SB. Odnotować datę przygotowania na kasecie z SB3. 5. Umieścić substrat roboczy w kasecie z SB3 w statywie dla roztworów podstawowych. 6. Umieścić kasety z DN4 i CN4 w statywie dla roztworów podstawowych. Na każdej kasecie odnotować datę jej otwarcia. 7. Oznaczyć ramki na odczynniki jako zwykłe lub określone dla danego testu, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. 8. Skonfigurować ramki na odczynniki przez wprowadzenie pozycji odczynników i numerów serii do analizatora COBAS® AMPLICOR®, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. 9. Załadować statyw na odczynniki do analizatora COBAS® AMPLICOR®, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. Upewnić się, że każda kaseta z odczynnikami znajduje się w przypisanym jej miejscu i jest mocno zamocowana w statywie. 10. Umieścić statyw na naczynka D na platformie przeznaczonej dla naczynek D. Dla każdej reakcji detekcji wymagana jest jedno naczynko D, a dla każdej kasety z substratem roboczym wymagane są dwa naczynka D, aby umożliwić wyzerowanie analizatora COBAS® AMPLICOR®. 16/30 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test 11. Umieścić pierścienie A w segmentach termocyklera analizatora COBAS® AMPLICOR®. 12. Załadować pierścienie A do analizatora COBAS® AMPLICOR®, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. 13. Utworzyć listę roboczą pierścienia A. 14. Szczelnie zamknąć pokrywę segmentu(-ów) termocyklera. 15. Uruchomić analizator COBAS® AMPLICOR®. 16. Zaczekać, aż analizator COBAS® AMPLICOR® wyświetli komunikat o pomyślnym sprawdzeniu systemu w czasie uruchamiania. Uwaga Analizator COBAS® AMPLICOR® umożliwia wykonanie 6 oddzielnych oznaczeń zawartości każdej probówki A-tube. Analizator oblicza wymaganą ilość każdego odczynnika do detekcji, a przeprowadzone sprawdzanie obciążenia na początku każdego przebiegu testu pozwala określić, czy dostępna jest wystarczająca ilość odczynników koniecznych do testów. 17. Analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie wykonuje amplifikację i detekcję. Wyniki wyrażone są w postaci wartości absorbancji przy długości fali 660 nm oraz jako wynik dodatni lub ujemny. Kontrola jakości Z każdą serią próbek musi zostać przygotowana co najmniej jedna kontrola (+) M. tuberculosis oraz jedna kontrola (–) Mycobacterium. Jak w przypadku każdej nowej procedury laboratoryjnej, nowi operatorzy do czasu uzyskania przez nich wysokiej biegłości w prawidłowym wykonywaniu procedury oznaczenia powinni rozważyć użycie dodatkowych dodatnich i ujemnych prób kontrolnych podczas każdego oznaczenia. Nie ma wymagań dotyczących położenia kontroli w pierścieniu A. Aby upewnić się o prawidłowym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały i komentarze na właściwym dla niego wydruku. Kontrola ujemna Absorbancja kontroli (–) Mycobacterium powinna być mniejsza od 0,25 przy długości fali 660 nm. Jeżeli absorbancja kontroli (–) Mycobacterium jest równa lub wyższa niż 0,25, cały przebieg oznaczeń jest nieprawidłowy. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja). Jeśli absorbancja kontroli (–) Mycobacterium jest znacząco większa niż 0,25, w celu otrzymania pomocy technicznej należy skontaktować się z miejscowym biurem Roche. Kontrola dodatnia Absorbancja kontroli (+) M. tuberculosis przy długości fali 660 nm powinna być równa lub wyższa niż 2,0. Jeżeli absorbancja kontroli (+) M. tuberculosis wynosi poniżej 2,0, cały cykl jest nieprawidłowy. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja). Jeżeli absorbancja kontroli (+) M. tuberculosis wynosi systematycznie poniżej 2,0, należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Kontrola Aby zbadać efektywność przygotowywania próbek (zalecane raz w miesiącu), przygotowywania próbek 104 studzienek z M. tuberculosis należy przygotować w sposób opisany w rozdziale „Przygotowanie próbki i kontroli”, a następnie zbadać je tak samo jak próbki kliniczne. Jeżeli próbka została właściwie przygotowana przy użyciu testu COBAS® AMPLICOR® MTB, powinno się uzyskać wartość absorbancji większą lub równą 0,35 przy długości fali 660 nm. 6/2007, Revision 4.0 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 17/30 Wyniki Interpretacja wyników Interpretacja wyników Bez użycia detekcji kontroli wewnętrznej 1. Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały (FLG, flags) i komentarze umieszczone na wydruku dla danego cyklu. Jeżeli cykl jest nieprawidłowy, należy powtórzyć go w całości (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja). 2. W przypadku prawidłowego cyklu wyniki próbek interpretuje się w następujący sposób: A660 Komentarz < 0.35 NEGATIVE Nie wykryto DNA MTB. Próbka przypuszczalnie nie zawiera M. tuberculosis. Wynik ujemny nie wyklucza obecności zakażenia MTB, gdyż wyniki zależne są od odpowiedniego pobrania próbki, nieobecności inhibitorów oraz obecności wystarczającej ilości DNA do detekcji. ≥ 0.35 POSITIVE Wykryto DNA MTB. Wynik dodatni badania próbki na obecność M. tuberculosis. Przy użyciu detekcji kontroli wewnętrznej 1. Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały (FLG, flags) i komentarze umieszczone na wydruku dla danego cyklu. Jeżeli cykl jest nieprawidłowy, należy powtórzyć go w całości (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja). 2. W przypadku prawidłowego cyklu wyniki próbek interpretuje się w następujący sposób: Wynik próbki MTB 18/30 Interpretacja Wynik próbki IC A660 < 0.35 Komentarz NEGATIVE A660 ≥ 0.35 < 0.35 NEGATIVE < 0.35 ≥ 0.35 POSITIVE DOWOLNY Interpretacja Komentarz POSITIVE Nie wykryto DNA MTB. Próbka przypuszczalnie nie zawiera M. tuberculosis. Wynik ujemny nie wyklucza obecności zakażenia MTB, gdyż wyniki zależne są od odpowiedniego pobrania próbki, nieobecności inhibitorów oraz obecności wystarczającej ilości DNA do detekcji. NEGATIVE Wynik ujemny nieważny. Przygotować następną porcję wyjściowej próbki. Jeżeli wyjściowa próbka nie jest dostępna, należy pobrać nową. DOWOLNY Wykryto DNA MTB. Wynik dodatni badania próbki na obecność MTB. COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test Środki ostrożności dotyczące procedury Praca w laboratorium musi przebiegać w sposób jednokierunkowy – należy ją rozpocząć w obszarze przedamplifikacyjnym i przemieszczać się jednokierunkowo w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności poprzedzające proces amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania odczynników, a następnie przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej czynności przed procesem amplifikacji i nie wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym obszarze konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki lub pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym. Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu należy zachować wyjątkową ostrożność, aby zapewnić czystość zestawów odczynników oraz mieszanin do amplifikacji. Należy ściśle monitorować czystość wszystkich odczynników. Należy usunąć wszystkie podejrzane odczynniki. Ograniczenia metody Niniejszy test został zwalidowany dla płynnych, odkażonych i zagęszczonych próbek pobranych z układu oddechowego ludzi, włączając odkrztuszoną i indukowaną plwocinę, popłuczyny oskrzelowe i BAL. Próbki te zostały upłynnione, odkażone i zagęszczone przy użyciu metod wykorzystujących NALC-NaOH25, NaOH25 lub SDS-NaOH26,27. Badanie innych rodzajów próbek może dawać wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie. Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od właściwego pobrania próbki, transportu, przechowywania oraz procedur obróbki. Detekcja drobnoustrojów kompleksu M. tuberculosis zależna jest od liczby bakterii obecnych w próbce i mogą na nią mieć wpływ metody pobrania próbki, czynniki zależne od pacjenta (np. wiek, obecność objawów) i/lub stadium zakażenia. Wyniki fałszywie ujemne mogą się pojawiać na skutek hamowania polimerazy. Do testu COBAS® AMPLICOR® MTB dodano kontrolę wewnętrzną Mycobacterium, aby umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR. Dodanie enzymu AmpErase LD do odczynnika Master Mix zmniejsza ryzyko skażenia amplikonu. Jednak kontaminacji z dodatnich kontroli MTB i materiałów klinicznych można uniknąć tylko przez dobre praktyki laboratoryjne i dokładne realizowanie procedur wyszczególnionych w niniejszym podręczniku metod. Jak w przypadku każdego testu diagnostycznego, wyniki testu COBAS® AMPLICOR® MTB należy interpretować z uwzględnieniem wszystkich dostępnych wyników badania klinicznego i badań laboratoryjnych. Produktu tego powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach PCR. Niniejszego produktu można używać wyłącznie w analizatorze COBAS® AMPLICOR®. 6/2007, Revision 4.0 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 19/30 Charakterystyka skuteczności Swoistość analityczna: Swoistość analityczną testu COBAS® AMPLICOR® MTB oceniono na podstawie testów przeprowadzonych przy użyciu następujących bakterii i wirusów, z których wiele stanowi prawidłową florę lub często spotykane patogeny dróg oddechowych. Wszystkie izolaty bakterii przebadano przy użyciu 106 komórek/ml lub 105 kopii kwasu nukleinowego/PCR. Izolaty wirusów zbadano, używając wymienionych poniżej poziomów PFU/ml. Żaden z badanych izolatów nie wykazał dodatniego odczynu w teście COBAS® AMPLICOR® MTB. Gatunki Mycobacterium 20/30 Mycobacterium asiaticum Mycobacterium marinum Mycobacterium aurum Mycobacterium neoaurum Mycobacterium avium Mycobacterium nonchromogenicum Mycobacterium chitae Mycobacterium phlei Mycobacterium cookii Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium fallax Mycobacterium senegalens Mycobacterium flavescens Mycobacterium simiae Mycobacterium fortuitum Mycobacterium smegmatis Mycobacterium gastri Mycobacterium sphagni Mycobacterium gordonae Mycobacterium szulgai Mycobacterium intracellulare Mycobacterium terrae Mycobacterium kansasii Mycobacterium thermoresistibile Mycobacterium komassense Mycobacterium triviale Mycobacterium malmoense Mycobacterium xenopi COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test Gatunki inne niż Mycobacterium Acinetobacter calcoaceticus Actinomadura madurae Actinomyces pyogenes Actinoplanes italicus Aeromonas hydrophila Arcanobacterium haemolyticum Arthrobacter oxydans Bacillus subtilis Bacteroides fragilis Blastomyces dermatitidis Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Branhamella (Moraxella) catarrhalis Brevibacterium linens Campylobacter jejuni Candida albicans Chromobacterium violaceum Citrobacter freundii Clostridium perfringens Coccidioides immitis Corynebacterium aquaticum Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium flavescens Corynebacterium glutamicum Corynebacterium jeikeium Corynebacterium minutissimum Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium pseudotuberculosis Corynebacterium renale Corynebacterium striatum Corynebacterium xerosis Cryptococcus neoformans Deinococcus radiodurans Dermatophilus congolensis Eikenella corrodens Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Gordona sputi Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae 6/2007, Revision 4.0 Histoplasma capsulatum Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Lactobacillus casei Legionella micdadei Legionella pneumophila Microbacterium lactamicum Neisseria gonorrhoeae Neisseria lactamica Neisseria meningitidis Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis Nocardia farcinica Nocardia nova Nocardia otitidiscaviarum Nocardia transvalensis Oerskovia turbata Peptococcus niger Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica Propionibacterium acnes Pseudomonas aeruginosa Rhodococcus aichiensis Rhodococcus bronchialis Rhodococcus chubuensis Rhodococcus equi Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus gordonii Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptomyces griseus Veillonella atypica Veillonella parvula Vibrio parahaemolyticus Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 21/30 Izolaty wirusowe WIRUS Badanie poprzez PFU/PCR Adenowirus Cytomegalowirus Herpes Simplex I Herpes Simplex II Wirus grypy, typ B Parainfluenza 2 Wirus syncytium nabłonka oddechowego 3,2 x 105 98 5,6 x 105 brak danych Nieznany* 2,8 x 105 28 * Próbka ta pochodziła z popłuczyn gardła pacjenta. Izolaty chlamydii Czułość analityczna: Oczyszczone DNA Gatunki chlamydii Badane IFU/PCR Chlamydia pneumoniae Chlamydia trachomatis 188 88 Limit detekcji testu COBAS® AMPLICOR® MTB określono przez ustalenie minimalnej liczby kopii docelowego DNA M. tuberculosis, która może być powtarzalnie wykrywana przez niniejszą procedurę. Osiągnięto to przez analizę seryjnych rozcieńczeń oczyszczonego, docelowego DNA. Wyniki pokazują, że w jednej reakcji PCR test COBAS® AMPLICOR® MTB może wykryć 1 kopię DNA kompleksu M. tuberculosis oraz że w jednej reakcji PCR 5 lub więcej kopii oczyszczonego DNA M. tuberculosis było wykrywane w 100% przypadków. Pięć kopii DNA kompleksu M. tuberculosis w reakcji PCR odpowiada 1000 kopii DNA kompleksu M. tuberculosis na ml próbki. Limit detekcji testu COBAS® AMPLICOR® MTB określono przez ustalenie Czułość analityczna: Komórki M. tuberculosis minimalnej liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) M. tuberculosis, które mogą być wykryte w powtarzalny sposób przez niniejszą procedurę. Osiągnięto to przez analizę seryjnych rozcieńczeń zmianowanych hodowli każdego z dwunastu izolatów M. tuberculosis. Wyniki pokazują, że test COBAS® AMPLICOR® MTB może wykryć jedno CFU na reakcję PCR i że 40 CFU na reakcję PCR było wykrywane w 100% przypadków dla każdego z dwunastu izolatów kompleksu M. tuberculosis. Jedno CFU M. tuberculosis na reakcję PCR odpowiada 40 CFU M. tuberculosis na ml próbki. Dokładność 22/30 Dokładność testu COBAS® AMPLICOR® MTB w obrębie cyklu, pomiędzy cyklami, pomiędzy różnymi dniami oraz całkowitą dokładność testu oceniano zgodnie z metodami określonymi w wytycznych CLSI (EP5-A2) „Ocena skuteczności urządzeń chemii klinicznej”36. Procedura ta pozwala na określenie dokładności w obrębie cyklu, pomiędzy cyklami, pomiędzy różnymi dniami oraz całkowitej dokładności testu dzięki przeprowadzeniu wielodniowego badania, w którym bierze udział wielu operatorów. Badanie wykonano w laboratoriach Roche Molecular Systems Diagnostic Development przy użyciu testów COBAS® AMPLICOR® MTB pochodzących z jednej serii. Dla celów niniejszego badania kontrolę (+) Mycobacterium poddano obróbce, a następnie rozcieńczono buforami do przygotowania próbek, aby uzyskać stężenia 10 i 20 kopii DNA/reakcję amplifikacji. Cykl składający się z 24 testów był przeprowadzany codziennie przez 10 dni przez każdego z 2 operatorów. Każdy cykl obejmował 8 powtórzeń każdego z 2 stężeń kontroli (+) Mycobacterium oraz kontrolę (–) Mycobacterium. Wyniki omawianego badania przedstawiono w tabeli 1. COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test Tabela 1. Dokładność testu COBAS® AMPLICOR® MTB Docelowy MTB LICZBA KOPII/REAKCJA PCR Całkowita liczba powtórzeń Średnia absorbancja 0 10 Kopie/reakcja PCR Kopie/reakcja PCR Kopie/reakcja PCR 20 160 160 160 0,017 3,746 3,889 Wartość minimalna 0,007 1,316 3,334 Wartość maksymalna 0,029 4,000 4,000 Odchylenie standardowe 0* 0,218 0* Współczynnik zmienności 0* 5,8% 0* Odchylenie standardowe 0,007 0,185 0,139 Współczynnik zmienności 40,5% 4,9% 3,6% Odchylenie standardowe 0,0017 0,373 0,081 Współczynnik zmienności 10,1% 10,0% 2,1% Odchylenie standardowe 0,007 0,470 0,161 Współczynnik zmienności 41,7% 12,6% 4,1% Pomiędzy dniami Między przebiegami Wewnątrz przebiegu Razem * Przybliżona wartość składnika wariancji była ujemna i z tego względu została ustawiona na zero. Skuteczność kliniczna Test COBAS® AMPLICOR® MTB oceniano w badaniu przeprowadzanym w 7 ośrodkach klinicznych w Stanach Zjednoczonych, Kanadzie i Europie. Aby ocenić skuteczność kliniczną testu COBAS® AMPLICOR® MTB, wyniki porównano z wynikami hodowli MTB i ze zweryfikowanymi wynikami badań, które obejmowały hodowlę MTB i wyniki przeglądowe pacjentów w formie diagramu (tabele 2 i 3). Wyniki rozmazu AFB i hodowli prątków oraz testu COBAS® AMPLICOR® MTB uzyskano dla 5430 próbek. Spośród nich, wynik rozmazu AFB był dodatni dla 271 próbek, w przypadku 5159 próbek wynik był ujemny. Z 271 prób, których wynik rozmazu AFB był dodatni, 200 dało dodatni wynik także w przypadku hodowli MTB i testu COBAS® AMPLICOR® MTB; osiem próbek było dodatnich w hodowli i ujemnych w teście COBAS® AMPLICOR® MTB. Sześćdziesiąt trzy (63) próby dodatnie w rozmazie AFB były ujemne w hodowli MTB. Siedemnaście (17) z nich było dodatnich dla bakterii niegruźliczych, a w przypadku czterdziestu sześciu (46) hodowla była ujemna dla wszystkich prątków. Obecność MTB w grupie wszystkich próbek, według wyników hodowli, wynosiła 6,5% (352/5430). Obecność MTB w grupach dodatnich i ujemnych rozmazów wynosiła odpowiednio 76,8% (208/271) i 2,8% (144/5159). Zastosowanie wewnętrznej kontroli do oceny wyników testu ujawniło, że 2,8% (155/5430) próbek wykazywało wielokrotne działanie hamujące w stosunku do reakcji PCR. Przy zastosowaniu wewnętrznej kontroli w interpretacji wyników badań, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB w stosunku do hodowli w grupie próbek dodatnich pod względem rozmazu wynosiła 96,2% (200/208), a swoistość kliniczna 73,8% (45/61). W porównaniu ze zweryfikowanymi wynikami badań, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB wynosiła 96,4% (217/225), a swoistość kliniczna 100% (45/45). W grupie prób o ujemnym wyniku rozmazu, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB względem hodowli wynosiła 66,4% (93/140), a swoistość kliniczna 99,2% (4726/4763). W porównaniu ze zweryfikowanymi wynikami badań, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB wynosiła 72,8% (118/162), a swoistość kliniczna 99,7% (4832/4845). 6/2007, Revision 4.0 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 23/30 Przy niezastosowaniu wewnętrznej kontroli w interpretacji wyników badań, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB względem hodowli w grupie próbek dodatnich pod względem rozmazu wynosiła 96,2% (200/208), a swoistość kliniczna 74,6% (47/63). W porównaniu ze zweryfikowanymi wynikami badań, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB wynosiła 96,4% (217/225), a swoistość kliniczna 100% (46/46). W grupie prób o ujemnym wyniku rozmazu, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB względem hodowli wynosiła 64,6% (93/144), a swoistość kliniczna 99,3% (4978/5015). W porównaniu ze zweryfikowanymi wynikami badań, czułość kliniczna testu COBAS® AMPLICOR® MTB wynosiła 71,3% (117/164), a swoistość kliniczna 99,7% (4982/4995). 24/30 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test Tabela 2. Skuteczność testu COBAS® AMPLICOR® MTB na próbkę bez wewnętrznej kontroli Ośrodek Kategoria próbki Wszystkie próbki 1 2 3 4 5 6 7 N 1025 Rozmaz + 63 Rozmaz – 962 Wszystkie próbki 893 Rozmaz + 37 Rozmaz – 856 Wszystkie próbki 762 Rozmaz + 11 Rozmaz – 751 Wszystkie próbki 585 Rozmaz + 12 Rozmaz – 573 Wszystkie próbki 1046 Rozmaz + 57 Rozmaz – 989 Wszystkie próbki 910 Rozmaz + 69 Rozmaz – 841 Wszystkie próbki 209 Rozmaz + 22 Rozmaz – 187 Wszystkie próbki 5430 OGÓŁEM Rozmaz + Rozmaz – 6/2007, Revision 4.0 271 5159 Częstość W porównaniu do hodowli występowania Czułość Swoistość W porównaniu do wyników zweryfikowanych Czułość Swoistość PPV NPV 8,7% (89/1025) 79,4% (50/63) 4,1% (39/962) 6,2% (55/893) 81,1% (30/37) 2,9% (25/856) 4,2% (37/762) 81,8% (9/11) 3,1% (23/751) 1,5% (9/585) 16,7% (2/12) 1,2% (7/573) 5,6% (59/1046) 80,7% (46/57) 1,3% (13/989) 10,0% (91/910) 78,3% (54/69) 4,4% (37/841) 8,1% (17/209) 77,3% (17/22) 0,0% (0/187) 6,5% (352/5430) 76,8% (208/271) 2,8% (144/5159) 84,8% (89/105) 100,0% (59/59) 65,2% (30/46) 89,4% (59/66) 100,0% (32/32) 79,4% (27/34) 87,5% (28/32) 88,9% (8/9) 87,0% (20/23) 90,0% (9/10) 100,0% (2/2) 87,5% (7/8) 89,4% (59/66) 98,1% (51/52) 57,1% (8/14) 78,3% (72/92) 88,9% (48/54) 63,2% (24/38) 100,0% (18/18) 100,0% (17/17) 100,0% (1/1) 85,9% (334/389) 96,4% (217/225) 71,3% (117/164) 77,5% (69/89) 100,0% (50/50) 48,7% (19/39) 87,3% (48/55) 100,0% (30/30) 72,0% (18/25) 87,5% (28/32) 88,9% (8/9) 87,0% (20/23) 88,9% (8/9) 100,0% (2/2) 85,7% (6/7) 88,1% (52/59) 97,8% (45/46) 53,8% (7/13) 78,0% (71/91) 88,9% (48/54) 62,2% (23/37) 100,0% (17/17) 100,0% (17/17) – (0/0) 83,2% (293/352) 96,2% (200/208) 64,6% (93/144) 96,8% (906/936) 30,8% (4/13) 97,7% (902/923) 98,7% (827/838) 71,4% (5/7) 98,9% (822/831) 100,0% (730/730) 100,0% (2/2) 100,0% (728/728) 99,8% (575/576) 100,0% (10/10) 99,8% (565/566) 99,1% (978/987) 54,5% (6/11) 99,6% (972/976) 99,9% (818/819) 100,0% (15/15) 99,9% (803/804) 99,5% (191/192) 100,0% (5/5) 99,5% (186/187) 99,0% (5025/5078) 74,6% (47/63) 99,3% (4978/5015) 98,9% 89,9% (910/920) (89/99) 100,0% 100,0% (4/4) (59/59) 98,9% 75,0% (906/916) (30/40) 100,0% 100,0% (827/827) (59/59) 100,0% 100,0% (5/5) (32/32) 100,0% 100,0% (822/822) (27/27) 100,0% 100,0% (730/730) (28/28) 100,0% 100,0% (2/2) (8/8) 100,0% 100,0% (728/728) (20/20) 100,0% 100,0% (575/575) (9/9) 100,0% 100,0% (10/10) (2/2) 100,0% 100,0% (565/565) (7/7) 99,7% 95,2% (977/980) (59/62) 100,0% 100,0% (5/5) (51/51) 99,7% 72,7% (972/975) (8/11) 100,0% 100,0% (818/818) (72/72) 100,0% 100,0% (15/15) (48/48) 100,0% 100,0% (803/803) (24/24) 100,0% 100,0% (191/191) (18/18) 100,0% 100,0% (5/5) (17/17) 100,0% 100,0% (186/186) (1/1) 99,7% 96,3% (5028/5041) (334/347) 100,0% 100,0% (46/46) (217/217) 99,7% 90,0% (4982/4995) (117/130) COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 98,3% (910/926) 100,0% (4/4) 98,3% (906/922) 99,2% (827/834) 100,0% (5/5) 99,2% (822/829) 99,5% (730/734) 66,7% (2/3) 96,6% (728/731) 99,8% (575/576) 100,0% (10/10) 99,8% (565/566) 99,3% (977/984) 83,3% (5/6) 99,4% (972/978) 97,6% (818/838) 71,4% (15/21) 98,3% (803/817) 100,0% (191/191) 100,0% (5/5) 100,0% (186/186) 98,9% (5028/5083) 85,2% (46/54) 99,1% (4982/5019) 25/30 Tabela 3. Skuteczność testu COBAS® AMPLICOR® MTB na próbkę z wewnętrzną kontrolą Ośrodek Kategoria próbki Wszystkie próbki 1 2 3 4 5 6 7 OGÓŁEM 26/30 N 1025 Rozmaz + 63 Rozmaz – 962 Wszystkie próbki 893 Rozmaz + 37 Rozmaz – 856 Wszystkie próbki 762 Rozmaz + 11 Rozmaz – 751 Wszystkie próbki 585 Rozmaz + 12 Rozmaz – 573 Wszystkie próbki 1046 Rozmaz + 57 Rozmaz – 989 Wszystkie próbki 910 Rozmaz + 69 Rozmaz – 841 Wszystkie próbki 209 Rozmaz + 22 Rozmaz – 187 Wszystkie próbki 5430 Rozmaz + 271 Rozmaz – 5159 Częstość występowania Zahamowanie 8,7% (89/1025) 79,4% (50/63) 4,1% (39/962) 6,2% (55/893) 81,1% (30/37) 2,9% (25/856) 4,2% (32/762) 81,8% (9/11) 3,1% (23/751) 1,5% (9/585) 16,7% (2/12) 1,2% (7/573) 5,6% (59/1046) 80,7% (46/57) 1,3% (13/989) 10,0% (91/910) 78,3% (54/69) 4,4% (37/841) 8,1% (17/209) 77,3% (17/22) 0,0% (0/187) 6,5% (352/5430) 76,8% (208/271) 2,8% (144/5159) 4,8% (49/1025) 0,0% (0/63) 5,1% (49/962) 4,0% (36/893) 0,0% (0/37) 4,2% (36/856) 1,4% (11/762) 0,0% (0/11) 1,5% (11/751) 1,5% (9/585) 0,0% (0/12) 1,6% (9/573) 1,5% (16/1046) 0,0% (0/57) 1,6% (16/989) 2,5% (23/910) 1,4% (1/69) 2,6% (22/841) 4,3% (9/209) 0,0% (0/22) 4,8% (9/187) 2,8% (153/5430) 0,4% (1/271) 2,9% (152/5159) W porównaniu do hodowli Czułość Swoistość 80,2% (69/86) 100,0% (50/50) 52,8% (19/36) 88,9% (48/54) 100,0% (30/30) 75,0% (18/24) 87,5% (28/32) 88,9% (8/9) 87,0% (20/23) 88,9% (8/9) 100,0% (2/2) 85,7% (6/7) 88,1% (52/59) 97,8% (45/46) 53,8% (7/13) 78,0% (71/91) 88,9% (48/54) 62,2% (23/37) 100,0% (17/17) 100,0% (17/17) – (0/0) 84,2% (293/348) 96,2% (200/208) 66,4% (93/140) 96,6% (854/884) 30,8% (4/13) 97,6% (850/871) 98,5% (730/741) 71,4% (5/7) 98,8% (725/734) 100,0% (706/706) 100,0% (2/2) 100,0% (704/704) 99,8% (554/555) 100,0% (10/10) 99,8% (544/545) 99,1% (954/963) 50,0% (5/10) 99,6% (949/953) 99,9% (791/792) 100,0% (14/14) 99,9% (777/778) 99,5% (182/183) 100,0% (5/5) 99,4% (177/178) 98,9% (4771/4824) 73,8% (45/61) 99,2% (4726/4763) W porównaniu do wyników zweryfikowanych Czułość Swoistość PPV NPV 86,4% (89/103) 100,0% (59/59) 68,2% (30/44) 90,9% (60/66) 100,0% (32/32) 82,4% (28/34) 87,5% (28/32) 88,9% (8/9) 87,0% (20/23) 90,0% (9/10) 100,0% (2/2) 87,5% (7/8) 89,4% (59/66) 98,1% (51/52) 57,1% (8/14) 78,3% (72/92) 88,9% (48/54) 63,2% (24/38) 100,0% (18/18) 100,0% (17/17) 100,0% (1/1) 86,6% (335/387) 96,4% (217/225) 72,8% (118/162) 98,9% (863/873) 100,0% (4/4) 98,8% (859/869) 100,0% (791/791) 100,0% (5/5) 100,0% (786/786) 100,0% (719/719) 100,0% (2/2) 100,0% (717/717) 100,0% (566/566) 100,0% (10/10) 100,0% (556/556) 99,7% (961/964) 100,0% (5/5) 99,7% (956/959) 100,0% (795/795) 100,0% (14/14) 100,0% (781/781) 100,0% (182/182) 100,0% (5/5) 100,0% (177/177) 99,7% (4877/4890) 100,0% (45/45) 99,7% (4832/4845) COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 89,9% (89/99) 100,0% (59/59) 75,0% (30/40) 100,0% (60/60) 100,0% (32/32) 100,0% (28/28) 100,0% (28/28) 100,0% (8/8) 100,0% (20/20) 100,0% (9/9) 100,0% (2/2) 100,0% (7/7) 95,2% (59/62) 100,0% (51/51) 72,7% (8/11) 100,0% (72/72) 100,0% (48/48) 100,0% (24/24) 100,0% (18/18) 100,0% (17/17) 100,0% (1/1) 96,3% (335/348) 100,0% (217/217) 90,1% (118/131) 98,4% (863/877) 100,0% (4/4) 98,4% (859/873) 99,2% (791/797) 100,0% (5/5) 99,2% (786/792) 99,4% (719/723) 66,7% (2/3) 99,6% (717/720) 99,8% (566/567) 100,0% (10/10) 99,8% (556/557) 99,3% (961/968) 83,3% (5/6) 99,4% (956/962) 97,5% (795/815) 70,0% (14/20) 98,2% (781/795) 100,0% (182/182) 100,0% (5/5) 100,0% (177/177) 98,9% (4877/4929) 84,9% (45/53) 99,1% (4832/4876) 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test Piśmiennictwo 1. Tuberculosis Elimination Revisited: Obstacles, Opportunities, and a Renewed Commitment—Advisory Council for the Elimination of Tuberculosis (ACET). Morbidity and Mortality Weekly Reports 1999. (RR09); 1-13. 2. Metchock, B.G., Nolte, F.S. and Wallace, R.J. 1999. Mycobacterium, pp. 339-437: In: Manual of Clinical Microbiology, 7th ed., eds. Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A. et al. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Bloom, B.R. and Murray, C.J.L. 1992. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer. Science 257:1055-1063. 4. Böttger, E.C. 1991. Detection, differentiation, and systematics of bacterial pathogens - the family Mycobacteriaceae. Immunitat und Infection 19:143152. 5. World Health Organization (WHO). 1995. WHO Report on the Tuberculosis Epidemic, 1995. 6. Daniel, T.M. 1990. The rapid diagnosis of tuberculosis: a selective review. Journal of Laboratory Clinical Medicine 116:277-282. 7. Hermans, P.W.M., Schuitema, A.R.J., Soolingen, D.V. et al. 1990. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 28:1204-1213. 8. Butler, W.R., Jost, K.C. and Kilburn, J.O. 1991. Identification of mycobacteria by high-performance liquid chromatography. Journal of Clinical Microbiology 29:2468-2472. 9. Huang, C.H. and Jungkind, D.L. 1991. Non-radioactive probe for the rapid identification of Mycobacterium avium complex from clinical specimens. Molecular and Cellular Probes 5:277-280. 10. Pfyffer, G.E., Kissling, P., Jahn, E.M.I. et al. 1996. Diagnostic performance of amplified Mycobacterium tuberculosis direct test with cerebrospinal fluid, other nonrespiratory, and respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology 34:834-841. 11. Miller, N., Hernandez, S.G. and Cleary, T.J. 1994. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and PCR for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology 32:393-397. 12. Yuen, K., Yam, W., Wong, L. et al. 1997. Comparison of two automated DNA amplification systems with a manual one-tube nested PCR assay for diagnosis of pulmonary tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 35:1385-1389. 6/2007, Revision 4.0 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 27/30 13. Walker, G.T., Nadeau, J.G., Linn, C.P. et al. 1996. Strand displacement amplification (SDA) and transient-state fluorescence polarization detection of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Chemistry 42:9-13. 14. Smith, J.H., Buxton, D., Cahill, P. et al. 1997. Detection of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum by using a prototype automated Q-Beta replicase assay. Journal of Clinical Microbiology 35:1477-1483. 15. Brisson-Noel, A., Aznar, C., Chareau, C. et al. 1991. Diagnosis of tuberculosis by DNA amplification in clinical practice evaluation. The Lancet 338:364-366. 16. Eisenach, K.D., Sifford, M.D., Cave, M.D. et al. 1991. Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain reaction. American Review of Respiratory Diseases 144:1160-1163. 17. De Wit, D., Steyn, L., Shoemaker, S. et al. 1990. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens by DNA amplification. Journal of Clinical Microbiology 28:2437-2441. 18. Sjobring, U., Mecklenburg, M., Andersen, A.B. et al. 1990. Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 28:2200-2204. 19. Cousins, D.V., Wilton, S.D., Francis, B.R. et al. 1992. Use of polymerase chain reaction for rapid diagnosis of tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 30:255-258. 20. Sritharan, V. and Barker Jr., R.H. 1991. A simple method for diagnosing M. tuberculosis infection in clinical samples using PCR. Molecular and Cellular Probes 5:385-395. 21. Ichiyama, S., Iinuma, Y., Tawada, Y. et al. 1996. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and Roche PCR-microwell plate hybridization method (AMPLICOR® Mycobacterium) for direct detection of mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology 34:130-133. 22. Kox, L.F., van Leeuwen, J., Kniper, S. et al. 1995. PCR assay based on DNA coding for 16S rRNA for detection and identification of mycobacteria in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology 33:3225-3233. 23. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F. et al. 1985. Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350-1354. 24. Mullis, K.B. and Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155:335-350. 25. Kent, P.T. and Kubica, G.P. 1985. US DHHS. Public Health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta, GA. 28/30 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0 Mycobacterium tuberculosis Test 26. Zolnir-Dovc, M., Poljak, M., Seme, K. et al. 1995. Evaluation of two commercial amplification assays for detection of Mycobacterium tuberculosis complex in respiratory specimens. Infection 23:216-221. 27. Taquet, A. and Tison, F. 1996. L’utilisation des détergents pour l’isolement des mycobactéries. Bulletin International Union de Tuberculose 38:59-67. 28. Tevere, V.J., Hewitt, P.L., Dare, A. et al. 1996. Detection of Mycobacterium tuberculosis by PCR amplification with pan-Mycobacterium primers and hybridization to an M. tuberculosis-specific probe. Journal of Clinical Microbiology 34:918-923. 29. Stahl, D.A. and Urbance, J.W. 1990. The division between fast- and slowgrowing species corresponds to natural relationships among the mycobacteria. Journal of Bacteriology 172:116-124. 30. Böddinghaus, B., Rogall, T., Flohr, T. et al. 1990. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rRNA. Journal of Clinical Microbiology 28:1751-1759. 31. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128. 32. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 33. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005. 34. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp. 35. Zolg, W.J. and Philippi-Schulz, S. 1994. The superoxide dismutase gene; a target for detection and identification of mycobacteria by PCR. Journal of Clinical Microbiology 32:2801-2812. 36. Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. CLSI Document EP5-A2 Villanova, PA:CLSI, 1999. 6/2007, Revision 4.0 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 29/30 " Distributed by Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, 08876 USA Członek Grupy Roche Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256, USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800 526 1247) Roche Diagnostics H7V4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433) Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz Roche Diagnostics F-38240 Meylan Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora ROCHE, AMPLICOR, AMPLILINK, AMPLIPREP, AMPLITAQ, TAQMAN, AMPERASE i COBAS są znakami handlowymi firmy Roche. ROCHE RESPONSE CENTER jest zarejestrowanym znakiem serwisowym firmy Roche. Cząsteczki paramagnetyczne Dynabeads® są przedmiotem licencji od właściciela patentów Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia. Dynabeads® jest zarejestrowanym znakiem handlowym Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia, na który udzielono licencji firmie Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. Eppendorf Multipette® i Eppendorf Combitip® są zastrzeżonymi znakami towarowymi Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Niemcy. ProClin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Rohm and Haas Company. Copyright 2007, Roche Molecular Systems, Inc. Wszelkie prawa zastrzeżone. 6/2007 (00058003575-03ENGL) 05217130049-01 30/30 COBAS® AMPLICOR® Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0