TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3
Transkrypt
TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3
PRACE ORYGINALNE Magdalena BODNAR1 £ukasz SZYLBERG1 Wojciech KAMIERCZAK2 Andrzej MARSZA£EK1,3 Ocena ekspresji tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) jako czynników prognostycznych w raku p³askonab³onkowym krtani Evaluation of expression of tissue inhibitors of etalloproteinases (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) as a prognostic markers in laryngeal squamous cell carcinoma Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej, Uniwersytet Miko³aja Kopernika, Toruñ, Collegium Medicum, Bydgoszcz Kierownik: Dr hab. Andrzej Marsza³ek prof. UMK 1 Katedra i Klinika Otolaryngologii, Uniwersytet Miko³aja Kopernika, Toruñ, Collegium Medicum, Bydgoszcz Kierownik: Prof. dr hab. Henryk Kamierczak 2 Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ Kierownik: Prof. dr hab. Przemys³aw Majewski 3 Dodatkowe s³owa kluczowe: rak p³askonab³onkowy krtani tkankowe inhibitory metaloproteinaz immunohistochemia Additional key words: laryngeal squamous cell carcinoma tissue inhibitors of matrix metalloproteinases immunohistochemistry Adres do korespondencji: Dr hab. Andrzej Marsza³ek, prof. UMK Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej Uniwersytet Miko³aja Kopernika w Toruniu Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy ul. M. Sk³odowskiej-Cuire 9 85-094 Bydgoszcz Tel.: 52 585 42 00; Faks: 52 585 40 49 e-mail: [email protected] 678 Raki krtani wci¹¿ stanowi¹ powa¿ny problem terapeutyczny, wynikaj¹cy g³ównie z pónego rozpoznania nowotworu. Utrzymanie równowagi miêdzy aktywnoci¹ enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów odgrywa istotn¹ rolê w utrzymaniu prawid³owej struktury tkanek oraz zapobiega degradacji sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej. Nadmierna ekspresja enzymów proteolitycznych oraz brak aktywnoci odpowiednich inhibitorów prowadzi do destabilizacji wspomnianej powy¿ej równowagi, co w konsekwencji u³atwia migracjê komórek nowotworowych. Celem niniejszej pracy by³a ocena lokalizacji i poziomu ekspresji tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) w raku p³askonab³onkowym krtani. Badania immunohistochemiczne przeprowadzono na 78 reprezentatywnych wycinkach tkankowych obejmuj¹cych 60 wycinków z rakiem p³askonab³onkowym krtani oraz 18 wycinków prawid³owej b³ony luzowej. Stwierdzono ekspresjê oznaczanych czynników zarówno w komórkach nowotworowych, jak i podcielisku nowotworu. Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ ekspresjê oznaczanych bia³ek, odpowiednio w 91% (71/78) dla TIMP-1, 22% (17/ 78) TIMP-2, 100% (78/78) TIMP-3 przypadków raka p³askonab³onkowego krtani. Stwierdzono ró¿nicê istotn¹ statystycznie pomiêdzy ekspresj¹ TIMP1, TIMP-2 oraz TIMP-3 pomiêdzy ekspresj¹ tych parametrów w komórkach nowotworu a podcieliskiem (p<0,05). Uwzglêdniaj¹c stopieñ zajêcia wêz³ów ch³onnych (N0 vs. N+) wykazano ró¿nice istotne statystycznie w poziomach ekspresji TIMP-1 i TIMP-3 w zrêbie. Natomiast dla poziomów ekspresji TIMP-1, TIMP-2 TIMP-3 w nowotworze nie stwierdzono ró¿nic istotnych statystycznie pomiêdzy pacjentami N0 vs. N+. Ocena wzajemnych interakcji pomiêdzy wyszczególnionymi paramePrzegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 Laryngeal cancer is still a therapeutic problem mainly become of late diagnosis. Balance between the activity of proteolytic enzymes and their inhibitors plays an important role in maintaining normal tissues structure and prevents the degradation of extracellular matrix components. Proteolytic enzymes overexpression and/or lack of activity of their inhibitors lead to destabilization of tissue structure, which in turn facilitates the migration of cancer cells. The aim of this study was to assess the localization and level of expression of tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-1, TIMP2, TIMP-3) in lanyngeal squamous cell carcinoma. The immunohistochemical study was performed on 78 representative tissue samples including: 60 sections of squamous cell carcinoma of the larynx and 18 sections of normal mucosa. Expression of determined parameters was found in both tumor cells and tumor stroma. We have found cytoplasmic expression of studied proteins, respectively in 91% (71/78) for TIMP-1, 22% (17/78) for TIMP-2, 100% (78/78) for TIMP-3 cases of squamous cell carcinoma of the larynx. Statistically significant difference between the expression of TIMP-1, TIMP-2 and TIMP-3 was found between tumor cells and tumor stroma (p<0.05). Analyzing the lymph node involvement (N0 vs. N +) we found statistically significant difference (p<0.05) in the levels of expression of TIMP-1 and TIMP-3 between those groups in the primary tumor stroma. However, for expression levels of TIMP-1, TIMP-2 TIMP-3 in the tumor cells there was no statistically significant differences between patients N0 vs. N +. Assessment of interactions between parameters involved in the process of tumor invasion may contribute to the development of therapies based on the inhibition of invasion. Understanding the mechanisms M. Bodnar i wsp. trami, w procesie inwazji nowotworowej, mo¿e przyczyniæ siê do rozwoju terapii opartej na dzia³aniu przeciwinwazyjnym, a poznanie mechanizmów interakcji dzia³ania okrelonych metaloproteinaz oraz ich inhibitorów mo¿e mieæ istotny wp³yw na strategie terapeutyczne. Wstêp Rak krtani wci¹¿ pozostaje istotnym problemem diagnostycznym jak i terapeutycznym. W obszarze krtani, najczêciej wystêpuj¹cym nowotworem jest rak p³askonab³onkowy, stanowi¹cy ok. 90% rozpoznawanych nowotworów z³oliwych w tej lokalizacji. Etiologia tego nowotworu cile zwi¹zana jest z ekspozycj¹ na czynniki rodowiskowe, wród których podkrela siê palenie tytoniu oraz nadu¿ywanie wysokoprocentowych alkoholi [2,32]. W Polsce w 2008 roku odnotowano 2075 nowych zachorowañ na raka krtani oraz 1423 zgony spowodowane tym typem nowotworu u mê¿czyzn. U kobiet dane te w 2008 roku przedstawia³y siê nastêpuj¹co: 308 nowych zachorowañ i 182 zgony spowodowane rakiem krtani [Krajowy Rejestr Nowotworów]. Przerzuty powstaj¹ce w wyniku procesu transformacji nowotworowej stanowi¹ jedn¹ z g³ównych przyczyn zgonów. W procesie tworzenia przerzutów istotn¹ rolê odgrywa zdolnoæ komórek do migracji, która uwarunkowana jest degradacj¹ sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej determinowana obecnoci¹ ró¿nych enzymów nale¿¹cych do rodziny endopeptydaz (tzw. metaloproteinaz, MMP). W szczególnoci podkrela siê rolê MMP-2 oraz MMP-9. Udowodniono lokalizacjê tych enzymów nie tylko na powierzchni komórek nowotworowych, ale tak¿e zdolnoæ ich wydzielania przez komórki podcieliska nowotworu [13,19]. W licznych badaniach wskazano na interakcje zachodz¹ce pomiêdzy komórkami nowotworowymi a otaczaj¹cym je mikrorodowiskiem, tzw. tumor host-reactions (interakcja guz-gospodarz), podkrelaj¹c, ¿e nie tylko sam nowotwór powoduje przekszta³cenie mikrorodowiska, ale tak¿e reaguje na czynniki pochodz¹ce z podcieliska [13]. Mikrorodowisko bierze udzia³ w promocji mutagenezy komórek nowotworowych oraz wp³ywa na modyfikacje komórek wchodz¹cych w sk³ad podcieliska guza [10,31]. Podkrelaj¹c udzia³ komórek mikrorodowiska guza, zaproponowano model mikrorodowiskowej inwazji nowotworu (tumor microenviroment invasion model), wed³ug której na ka¿dym etapie tworzenia przerzutów nastêpuje aktywacja okrelonych genów wspomagaj¹cych ten proces [11,12,31]. Aktywacja MMP mo¿e odbywaæ siê na dwóch poziomach: zewn¹trz i wewn¹trzkomórkowo. Wiêkszoæ enzymów proteolitycznych aktywowana jest zewn¹trzkomórkowo. Metaloproteinazy wytwarzane i wydzielane s¹ w postaci nieaktywnych proenzymów, a aktywacja MMP zachodzi poprzez usuniêcie prodomeny, co prowadzi do ods³oniêcia aktywnego miejsca enzymu. Zmiany te zachodz¹ pod wp³ywem specyficznych aktywatorów oraz inhibitorów dzia³aj¹cych na poziomie: ekspresji genów, aktywacji pro-MMP, a tak¿e poprzez udzia³ specyficznych i niespecyficznych inhibitorów zaktyPrzegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 of interaction between several metalloproteinases and their inhibitors may have a significant impact on therapeutic strategies in the future. wowanych metaloproteinaz [7,28]. W warunkach fizjologicznych aktywnoæ i iloæ MMPs regulowana jest poprzez endogenne inhibitory metaloproteinaz, czyli tzw. tkankowe inhibitory metaloproteinaz (ang. tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, TIMPs). Dotychczas znane s¹ cztery typy inhibitorów tkankowych, odpowiednio: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4. £¹cz¹ siê one z fragmentem C-koñcowym cz¹steczki MMP wi¹zaniami niekowalencyjnymi. Powinowactwo poszczególnych inhibitorów do odpowiednich enzymów jest zró¿nicowane. Udowodniono, ¿e TIMP-1 wykazuje zwiêkszone powinowactwo do MMP-9, w porównaniu z powinowactwem do MMP-2. Natomiast TIMP-2 wykazuje znacznie wiêksze zdolnoci zahamowania aktywnoci MMP-2, w porównaniu do efektu w przypadku pozosta³ych enzymów wchodz¹cych w sk³ad tej rodziny [16]. Udowodniono, ¿e TIMPs pe³ni¹ tak¿e funkcje ligandów dla receptorów czynników wzrostu oraz cytokin. Wywieraj¹ tak¿e wp³yw na regulacjê aktywnoci komórek nowotworowych, niezale¿nie od aktywnoci MMPs [4]. Ponadto tkankowe inhibitory metaloproteinaz zaanga¿owane s¹ w degradacjê macierzy zewn¹trzkomórkowej poprzez zdolnoæ do eliminacji MMPs, jak równie¿ zdolnoæ do hamowania aktywacji tych enzymów. Tworz¹ wi¹zania zarówno z formami aktywnymi jak i latentnymi MMPs, powoduj¹c zablokowanie mo¿liwoci od³¹czenia koñca N okrelonych metaloproteinaz, co uniemo¿liwia ich aktywacjê [4,16]. G³ówn¹ funkcj¹ TIMPs, oprócz zdolnoci do hamowania aktywnoci MMPs, jest zdolnoæ do stymulowania rozwoju nowotworów. Stwierdzono, ¿e TIMPs bior¹ udzia³ zarówno w procesach degradacji jak i syntezy macierzy pozakomórkowej reguluj¹c oba te procesy. W wyniku nadmiernego wydzielania MMPs, m.in. przez komórki nowotworowe, dochodzi do zwiêkszonego wydzielania TIMP. Ponadto w przebiegu procesu nowotworowego, wzrost syntezy MMPs, zarówno w komórkach guza, jak i podcielisku nowotworu, zwi¹zany jest ze zwiêkszon¹ syntez¹ inhibitorów metaloproteinaz. Nadmierna syn- teza MMPs, w porównaniu do syntezy inhibitorów tkankowych, powoduje nasilenie procesów degradacyjnych, co z kolei mo¿e powodowaæ zwiêkszon¹ migracjê komórek guza [7,13,15]. Celem niniejszej pracy by³a ocena lokalizacji i poziomu ekspresji tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) jako czynników zwi¹zanych z aktywacj¹ enzymów proteolitycznych nale¿¹cych do ¿elatynaz. Ponadto podjêto próbê opisania przebudowy podcieliska nowotworu w trakcie jego powstawania i rozwoju, na przyk³adzie raka p³askonab³onkowego krtani poprzez ocenê lokalizacji i poziomu ekspresji tych parametrów w obszarze prawid³owej b³ony luzowej i raku p³askonab³onkowym krtani. Materia³ i metody Grupa badana: Badania wykonano na materiale pochodz¹cym od 31 mê¿czyzn oraz 6 kobiet, którym wykonano laryngektomiê w Katedrze i Klinice Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej CM UMK, Szpitala Klinicznego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. Wiek pacjentów waha³ siê od 44 do 77 lat, tj. u mê¿czyzn od 44 do 77 lat (rednia wieku: 57 lat), a u kobiet od 50 do 69 lat (rednia wieku: 60 lat). Na badania otrzymano zgodê lokalnej Komisji Bioetycznej. W zgromadzonym materiale rozpoznano raka p³askonab³onkowego krtani, co zosta³o zweryfikowane poprzez dwukrotn¹ ocenê materia³u tkankowego przeprowadzon¹ przez dwóch lekarzy patologów. Ustalono stopnieñ z³oliwoci histologicznej. Stopieñ G3 zdiagnozowano u 2 pacjentów, G2 u 32, a G1 u 3 pacjentów. Dokonano oceny klinicznego stopnia zaawansowania procesu nowotworowego zgodnie z klasyfikacj¹ TNM (wg IUAC). Dwóch pacjentów zakwalifikowano do stadium T2, 24 pacjentów do T3, a 11 pacjentów do T4. U dwudziestu pacjentów nie stwierdzono przerzutów do wêz³ów ch³onnych. Przerzuty do okolicznych wêz³ów ch³onnych zdiagnozowano u 17 chorych (jedenastu chorych z N1, trzech w N2, trzech w N3). W analizowanej grupie nie stwierdzono przerzutów odleg³ych. Wszyscy pacjenci z grupy badanej palili papierosy. Dwudziestu omiu pali³o do 20 papierosów dziennie, a dziewiêciu ponad 20 papierosów dziennie. Ponadto 29 chorych nadu¿ywa³o alkoholi wysokoprocentowych. Materia³ tkankowy podzielono na nastêpuj¹ce grupy badawcze: 1. grupê badan¹ stanowi³y wycinki tkankowe z rakiem p³askonab³onkowym: 60 wycinków tkankowych. 2. grupê kontroln¹ stanowi³ obszar prawid³owej b³ony luzowej: 18 wycinków tkankowych. Tabela I Skala oceny reakcji immunohistochemicznej wg Remmele-Stegner w modyfikacji w³asnej. The immunohistochemical reaction scale of Remmel-Stegner with own modification. Intensywnoæ ekspresji Komórki/obszar o pozytywnej ekspresji [SI] [PP] 0 brak ekspresji 0 = brak komórek Skala IRS 1 s³aba ekspresja 1 = < 5% komórek [SI] x [PP] 2 umiarkowana ekspresja 2 = 6 - 20% komórek 3 silna ekspresja 3 = 21 - 50% komórek 4 = 51 - 80% komórek 5 = > 81% komórek 679 Badanie immunohistochemiczne Przeprowadzono badania immunohistochemiczne postêpuj¹c wg standardowej procedury opisanej we wczeniejszych publikacjach [1]. Wykorzystano pierwszorzêdowe przeciwcia³a skierowane przeciwko TIMP-1; Dako, Denmark, klon VT7, 1:50; TIMP-2, Abcam, klon 3A4, 1:50; TIMP-3, Abcam, klon Loop1, 1:500. Ocenê poziomu ekspresji wykonano stosuj¹c zasady oceny morfometrycznej. Do oceny poziomu ekspresji oznaczanych czynników zastosowano zmodyfikowan¹ skalê (0-15) wg Remmele-Stegner [21] (tabela I). Zbadano zgodnoæ poszczególnych zmiennych z rozk³adem normalnym wykorzystuj¹c test Ko³mogorowaSmirnowa z poprawk¹ istotnoci Lillieforsa oraz testem Shapiro-Wilka. Jednorodnoæ wariancji oceniono za pomoc¹ testu Levene'a. Rozk³ad uzyskanych wyników odbiega³ od rozk³adu normalnego, dlatego analizê statystyczn¹ przeprowadzono za pomoc¹ testów nieparametrycznych. Do oceny ró¿nic istotnych statystycznie, miêdzy dwoma grupami (uwzglêdniaj¹c lokalizacjê tj. w komórkach prawid³owego nab³onka versus komórkach nowotworu oraz podcielisku [zrêbie] w prawid³owej b³onie luzowej oraz w utkaniu nowotworu), wykorzystano test nieparametryczny U Manna-Whitneya. Ocenê ekspresji oznaczanych parametrów wzglêdem lokalizacji i obecnoci lub nie, przerzutów do wêz³ów ch³onnych (cecha N) wykonano za pomoc¹ testu Kruskala-Wallisa. W celu porównañ statystycznych analizowanych zmiennych w niniejszej pracy wykorzystano modu³ budowy i analizy drzew klasyfikacyjnych, z zastosowaniem testu zgodnoci Chi kwadrat. Za ró¿nicê istotn¹ statystycznie przyjêto wartoci p<0,05. Wyniki Stwierdzono spadek przeciêtnych wartoci ekspresji dla TIMP-1 oraz TIMP-2 zarówno w zrêbie jak i nowotworze u pacjentów pal¹cych powy¿ej 20 papierosów dziennie w porównaniu z grupa osób pal¹cych do 20 papierosów dziennie. Natomiast przeciêtne wartoci ekspresji TIMP-3 w obu grupach znajdowa³y siê na zbli¿onym poziomie. Najwy¿sze wartoci ekspresji stwierdzono dla TIMP-3, natomiast najni¿sz¹ ekspresjê odnotowano dla TIMP-2 w obu analizowanych grupach. Jednak¿e ze wzglêdu na zbyt du¿¹ ró¿nicê w liczebnoci poszczególnych grup (uwzglêdniaj¹c liczbê wypalanych dziennie papierosów) nie przeprowadzono analizy statystycznej. W niniejszej pracy zwrócilimy uwagê na ocenê ekspresji oznaczanych parametrów podczas procesu biologicznego, zw³aszcza interakcji pomiêdzy nowotworem a podcieliskiem w raku krtani - nowotworze, którego patogeneza cile zwi¹zana jest z ekspozycj¹ na dym tytoniowy. Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ ekspresjê oznaczanych parametrów (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) w prawid³owym nab³onku oraz otaczaj¹cym je utkaniu ³¹cznotkankowym (ekspresja obecna w komórkach nacieku zapalnego). Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ ekspresjê oznaczanych bia³ek, odpowiednio w 91% (71/78) dla TIMP-1, 22% (17/78) TIMP-2, 100% (78/78) TIMP-3 przypadków raka p³askonab³onkowego krtani. Zaobserwowano wy¿sz¹ ekspresjê oznaczanych inhibitorów tkankowych w utkaniu nowotworu, w porównaniu z podcieliskiem. Najwy¿sz¹ ekspresjê zarówno w nowotworze jak i zrêbie stwierdzono dla TIMP-3 (odpowiednio: 8 i 6). Natomiast najni¿sz¹ ekspresjê stwierdzono w badaniu TIMP-2, w komórkach nowotworu 0,5 i 0 w zrêbie nowotworu (tabela II). 680 Tabela II Porównanie poziomów ekspresji badanych antygenów pomiêdzy grup¹ kontroln¹ a badan¹ w nab³onku, nowotworze i zrêbie. Comparison of the expression levels of studied antigens between the control group and epithelium, tumor cells and tumor stroma. Grupa kontrolna Oznaczany param etr TIM P-1 TIM P-2 TIM P-3 Grupa badana Lokalizacja M ediana Lokalizacja M ediana Istotnoæ staty sty czna P nab³onek 10 now otw ór 4 0,000 * zr¹b 4 zr¹b 4 0,795 nab³onek 5 now otw ór 0,5 0,000 * zr¹b 0 zr¹b 0 0,000 * nab³onek 12 now otw ór 8 0,000 * zr¹b 9 zr¹b 6 0,000 * * ró¿nica istotna statystycznie Tabela III Wyniki analiz statystycznych ekspresji oznaczanych parametrów z uwzglêdnieniem obecnoci lub braku przerzutów do wêz³ów ch³onnych za pomoc¹ testu Kruskala-Wallisa. The results of statistical analysis of expression of determined parameters including lymph node involvement using Kruskal-Wallis test. NOWOTWÓR ZR ¥ B N0 N1 N2 N3 Istotnoæ staty sty czna: N0 v s. N+3 N0 N1 N2 N3 Istotnoæ staty sty czna: N0 v s. N+3 6 4 6 1 ns 6 4 1,5 1 p<0,05 TIM P-2 1 0,5 0 1 ns 0 0 0 1 ns TIM P-3 8 8 7 10 ns 8 8 7 10 p<0,05 TIM P-1 Rycina 1 Ekspresja tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w poszczególnych stopniach zajêcia wêz³ów ch³onnych w nowotworze. Expression of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in various degrees of lymph nodes involvement in the tumor cells. Porównuj¹c poziom ekspresji oznaczanych antygenów w komórkach nab³onka grupy kontrolnej i badanej, w analizie statystycznej stwierdzono istotne statystycznie ró¿nice dla oznaczanych parametrów: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3. Oceniaj¹c poziom ekspresji badanych antygenów w zrêbie stwierdzono ró¿nice istotne statystycznie pomiêdzy ekspresj¹ TIMP-2 i TIMP-3 pomiêdzy grup¹ Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 kontroln¹ a grup¹ badan¹. Nie stwierdzono ró¿nic istotnych statystycznie w przypadku porównania poziomów ekspresji TIMP-1 w zrêbie oraz kontroli grupy badanej. Ponadto wykorzystuj¹c test nieparametryczny U Manna-Whitneya stwierdzono ró¿nicê istotn¹ statystycznie pomiêdzy ekspresj¹ TIMP1, TIMP-2 oraz TIMP-3 w komórkach nowotworu a podcieliskiem (p<0,05). M. Bodnar i wsp. Rycina 2 Ekspresja tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w poszczególnych stopniach zajêcia wêz³ów ch³onnych w zrêbie. Expression of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in various degrees of lymph nodes involvement in tumor stroma. Uwzglêdniaj¹c stopieñ zajêcia wêz³ów ch³onnych, pacjentów podzielono na nastêpuj¹ce grupy: bez przerzutów do wêz³ów ch³onnych (N0), z przerzutami do wêz³ów ch³onnych (odpowiednio: N1, N2, N3) i przeprowadzono analizê ró¿nic ekspresji badanych parametrów. Wykazano ró¿nice istotne statystycznie (test Kruskala-Wallisa) w poziomach ekspresji TIMP-1 i TIMP-3 w zrêbie zmiany pierwotnej porównuj¹c materia³ od pacjentów z przerzutami lub bez przerzutów do wêz³ów ch³onnych. Natomiast dla poziomów ekspresji TIMP-1, TIMP-2 TIMP3 w nowotworze nie stwierdzono ró¿nic istotnych statystycznie pomiêdzy pacjentami z N+ (³¹cznie N1-N3) lub bez przerzutów do wêz³ów ch³onnych W wyniku analizy ekspresji oznaczanych parametrów uwzglêdniaj¹cej stopieñ zajêcia wêz³ów ch³onnych zaobserwowano w obrêbie pierwotnego nowotworu spadek ekspresji TIMP-1 oraz TIMP-2 wraz ze wzrostem stopnia zajêcia wêz³ów ch³onnych. Wartoci TIMP-1 w nowotworze dla poszczególnych grup wynosi³y odpowiednio N0 - 6, N1 - 4 i N3 - 1. Dla TIMP-2 w nowotworze wynosi³y: N0 - 1,0, N1 - 0,5 oraz N2 - 0. Natomiast w przypadku ekspresji TIMP3 stwierdzono wzrost wartoci ekspresji oznaczanego parametru, porównuj¹c pacjentów bez przerzutów do wêz³ów ch³onnych N0 - 8 i pacjentów w stopniu N3 - 10 (rycina 1). Ponadto w zrêbie nowotworu zaobserwowano spadek ekspresji TIMP-1 u pacjentów, u których stwierdzono przerzuty do wêz³ów ch³onnych (N1 - 4, N2 - 1,5, N3 - 1) w porównaniu z ekspresj¹ oznaczanego enzymu w stadium N0 - 6. Podobn¹ tendencjê stwierdzono analizuj¹c poziom ekspresji TIMP-3. U pacjentów, u których nie stwierdzono przerzutów do wêz³ów ch³onnych, przeciêtne wartoci ekspresji TIMP-3 by³y wy¿sze (N0 - 6) w porównaniu z eksPrzegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 presj¹ tego antygenu u pacjentów z przerzutami do wêz³ów ch³onnych (N2 - 4, N3 - 4) (rycina 2). Dyskusja Transformacja nowotworowa jest procesem z³o¿onym i wieloetapowym. Z biologicznego punktu widzenia naturalna historia nowotworu rozpoczyna siê pojawieniem pierwotnego ogniska guza. Nastêpnie obserwujemy miejscowy wzrost guza. Natomiast kluczowym etapem w procesie dalszego rozwoju jest uwolnienie komórek nowotworowych z pierwotnego utkania guza. Rozwój tego stadium uzale¿niony jest od nabycia przez komórki nowotworowe tzw. fenotypu inwazyjnego. Zjawisko to w konsekwencji determinuje zdolnoæ komórek nowotworowych do naciekania otaczaj¹cych tkanek i ostatecznie daje mo¿liwoæ tworzenia przerzutów. Inwazja komórek nowotworowych do podcieliska staje siê mo¿liwa dziêki zdolnoci do degradacji b³on podstawnych, które stanowi¹ podstawow¹ barierê chroni¹c¹ przed ekspansj¹ komórek guza. Powstawanie przerzutów odleg³ych w ró¿nych narz¹dach jest wynikiem zró¿nicowanych interakcji pomiêdzy komórkami nowotworowymi a nowym mikrorodowiskiem [9]. Proces inwazji nowotworowej zwi¹zany jest g³ównie z degradacj¹ macierzy zewn¹trzkomórkowej (ECM) otaczaj¹cej nowotwór [13]. Doniesienia licznych autorów wskazuj¹ na ekspresjê MMPs w ró¿nych typach nowotworów z³oliwych, w tym tak¿e w rakach p³askonab³onkowych obszaru g³owy i szyi [5]. W niniejszej pracy dokonano szczegó³owej oceny ekspresji poszczególnych parametrów zarówno w komórkach raka p³askonab³onkowego krtani, jak i w podcielisku nowotworu. Zrozumienie oraz poznanie wielostronnych interakcji zachodz¹cych pomiêdzy utkaniem guza a jego podcieliskiem oraz wskazanie dominuj¹cych zale¿noci pomiêdzy guzem a podcieliskiem umo¿liwi³oby lepsze poznanie biologii nowotworu. Do jednych z g³ównych enzymów proteolitycznych zaanga¿owanych w proces degradacji podcieliska nowotworu, a przede wszystkim proteolizy sk³adników b³on podstawnych (kolagenu typu IV), nale¿¹ metaloproteinazy zaliczane do grupy ¿elatynaz: ¿elatynaza-A (MMP-2) oraz ¿elatynaza-B (MMP-9) [15]. Wydzielane s¹ w postaci nieaktywnych form, tzw. zymogenów, a ich aktywacja regulowana jest na kilku poziomach, tj. zarówno na poziomie transkrypcji, jak i na poziomie posttranslacyjnym. Na poziomie posttranslacyjnym aktywnoæ wyszczególnionych enzymów proteolitycznych kontrolowana jest w macierzy zewn¹trzkomórkowej, poprzez koordynowanie aktywacji i wydzielania proenzymów oraz interakcji aktywnych form enzymów proteolitycznych z ich inhibitorami [8,15]. Do najwa¿niejszych nale¿¹ TIMP-1 oraz TIMP-2. £¹cz¹ siê one w stosunku stechiometrycznym (1:1). Ponadto ¿elatynazy (zarówno MMP-2, jak i MMP-9) s¹ jedynymi enzymami proteolitycznymi wród wszystkich MMPs, które wykazuj¹ zdolnoæ do interakcji z odpowiednimi dla nich inhibitorami zarówno w formie aktywnej, jak i w postaci zymogenów [5,15]. W warunkach fizjologicznych aktywnoæ i iloæ MMPs regulowana jest poprzez endogenne inhibitory metaloproteinaz (TIMP). Dotychczas znane s¹ cztery TIMP, odpowiednio: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4. Tkankowe inhibitory metaloproteinaz tak¿e s¹ zaanga¿owane w degradacjê macierzy zewn¹trzkomórkowej poprzez zdolnoæ do eliminacji MMPs oraz zdolnoæ do hamowania aktywacji tych enzymów. Tworz¹ wi¹zania zarówno z formami aktywnymi jak i latentnymi MMPs powoduj¹c zablokowanie mo¿liwoci od³¹czenia koñca N-terminalnego okrelonych metaloproteinaz, co uniemo¿liwia ich aktywacjê. Biologiczna funkcja tkankowych inhibitorów metaloproteinaz jest ró¿norodna. Z jednej strony odpowiedzialne s¹ za zahamowanie syntezy oraz aktywnoci enzymów proteolitycznych, natomiast z drugiej strony wykazuj¹ w³aciwoci antyapoptotyczne oraz proproliferacyjne [30]. G³ówn¹ funkcj¹ TIMPs, oprócz zdolnoci do hamowania aktywnoci MMPs, jest tak¿e zdolnoæ do stymulowania wzrostu nowotworów. Stwierdzono, ¿e TIMPs bior¹ udzia³ zarówno w procesach degradacji, jak i syntezy macierzy pozakomórkowej reguluj¹c oba te procesy.W wyniku nadmiernego wydzielania MMPs, m.in. przez komórki nowotworowe, dochodzi do zwiêkszonego wydzielania TIMP. Ponadto w przebiegu procesu nowotworowego wzrost syntezy MMPs, zarówno w komórkach guza jak i podcielisku nowotworu, zwi¹zany jest ze zwiêkszon¹ syntez¹ inhibitorów metaloproteinaz. Nadmierna synteza MMPs, w porównaniu do syntezy inhibitorów tkankowych, powoduje nasilenie procesów degradacyjnych, co z kolei powoduje zwiêkszon¹ migracjê komórek guza [30]. Wed³ug niektórych autorów TIMP-1 wydzielany jest g³ównie przez komórki zrêbu, natomiast TIMP-2 zarówno przez podcielisko jak i komórki nowotworowe [17,27,29]. Ponadto w badaniach innych autorów, opie681 raj¹c siê na badaniach immunohistochemicznych, wykazano, ¿e ekspresja tych parametrów by³a wy¿sza w porównaniu z ekspresj¹ ¿elatynaz, co mo¿e sugerowaæ ich aktywnoæ hamujac¹ w stosunku do enzymów proteolitycznych [5]. W niniejszej pracy wykazano niewielkie ró¿nice w ekspresji MMP-2 i MMP-9 a odpowiadaj¹cym im inhibitorom w utkaniu guza (dane niepublikowane). Zaobserwowano natomiast znacznie wy¿sze wartoci ekspresji MMP-2 w zrêbie nowotworu w porównaniu z ekspresj¹ TIMP-2 w tej samej lokalizacji. Ponadto wykazano zale¿noæ pomiêdzy ekspresj¹ MMP-9 a TIMP-1 (dane niepublikowane). Ocena lokalizacji tkankowych inhibitorów metaloproteinaz pozostaje wci¹¿ nierozstrzygniêta. Istniej¹ doniesienia stwierdzaj¹ce, ¿e ekspresja TIMP-1, TIMP-2 zachodzi wy³¹cznie na powierzchni komórek nowotworowych [18]. Natomiast wyniki badañ Sutinena i wsp. [27] oraz innych autorów [29] wskazuj¹ na ekspresjê TIMP-2 w zlokalizowanych bezporednio przy utkaniu guza komórkach zrêbu. W wyniku badañ przedstawionych w niniejszej pracy wykazano ekspresjê oznaczanych parametrów zarówno w komórkach nowotworowych jak i w podcielisku nowotworu. Warto podkreliæ, i¿ zaobserwowano wy¿sz¹ ekspresjê oznaczanych inhibitorów tkankowych w utkaniu nowotworu w porównaniu z otaczaj¹cym do podcieliskiem. W niniejszej pracy wykazano ekspresjê TIMP-1 w 91% przypadków SCC i TIMP-2 w 22% przypadkach SCC, natomiast TIMP-3 w 100% badanych prób. Ponadto dla TIMP-3 odnotowano najwy¿sz¹ ekspresjê zarówno w nowotworze jak i zrêbie. Natomiast najni¿sze poziomy ekspresji stwierdzono w przypadku TIMP-2. Analizuj¹c ekspresjê badanych czynników w podcielisku, zaobserwowano zmniejszon¹ ekspresjê bezporednio przy froncie naciekania nowotworu (w fibroblastach), natomiast siln¹ ekspresjê stwierdzono w nacieku zapalnym. Ponadto nie zaobserwowano ekspresji inhibitorów w podcielisku znajduj¹cym siê wewn¹trz utkania nowotworu. W wietle dostêpnych danych literaturowych jest to nowe stwierdzenie, które mo¿e czêciowo t³umaczyæ zjawisko promocji nowotworu przez naciek zapalny. Dotychczas naciek zapalny by³ traktowany jako silne ród³o czynników wzrostowych wzmagaj¹cych proliferacjê komórek nowotworu. W wietle wyników niniejszej pracy naciek zapalny wokó³ nowotworu, poprzez wydzielanie inhibitorów enzymów degraduj¹cych podcielisko, jest tak¿e czynnikiem hamuj¹cym powstanie przerzutów. W aspekcie obrony organizmu przed nowotworem (tumor-host interaction) w wiêkszoci dostêpnego pimiennictwa naciek zapalny jest opisywany jako wyk³adnik immunologicznego zwalczania komórek nowotworowych. Wyniki niniejszych badañ wskazuj¹ na mo¿liwoæ istnienia tak¿e innych mechanizmów obronnych przed progresj¹ nowotworow¹. Christopoulos i wsp. [5] wykazali prawie dwukrotnie wy¿sz¹ ekspresjê oznaczanych parametrów (TIMP) w tkance nowotworowej ni¿ w materiale kontrolnym. Zjawisko to wskazuje na pewn¹ zale¿noæ sugeruj¹c¹, i¿ wy¿sze stê¿enia tkankowych inhibitorów w utkaniu 682 guza maj¹ za zadanie przygotowaæ tkankê do inwazji nowotworowej. Autorzy wskazuj¹ na zdolnoæ syntezy TIMP-2 nie tylko przez komórki podcieliska, ale tak¿e przez komórki nowotworowe, zw³aszcza w pónych etapach rozwoju nowotworu [5]. Cytoplazmatyczn¹ ekspresjê tkankowego inhibitora-1 stwierdzono w wielu typach nowotworów m.in. w raku piersi [33], p³uc [34], ¿o³¹dka [25], a tak¿e w raku p³askonab³onkowym krtani [8]. Badania Görötha i wsp. [8] wskazuj¹ na supresorowe w³aciwoci tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2) w stosunku do inwazji oraz wzrostu nowotworu. Badania autorów wykaza³y tak¿e, ¿e zwiêkszenie ekspresji na poziomie transkrypcyjnym inhibitorów TIMP-1 i TIMP-2 w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia aktywnoci enzymatycznej MMPs, podlegaj¹cych regulacji okrelonym inhibitorom. Ponadto badania Sato i wsp. [22-24] wykaza³y, ¿e w wyniku aktywacji MMPs, dochodzi jednoczenie do syntezy tkankowych inhibitorów metaloproteinaz przez komórki zrêbu. Immunohistochemiczna analiza ekspresji TIMP-3, przeprowadzona przez Miyazaki i wsp. wykaza³a ekspresjê oznaczanego parametru w utkaniu nowotworu, zaznaczaj¹c jej brak przy froncie naciekania guza. Ci sami autorzy stwierdzili obni¿on¹ ekspresjê w centralnej czêci, wskazuj¹c na wzrost ekspresji TIMP-3 w zewnêtrznej czêci utkania nowotworu [14]. Znamienn¹ korelacjê spadku ekspresji TIMP-3 z nasileniem stopnia inwazji oraz obecnoci¹ przerzutów do wêz³ów ch³onnych, potwierdzaj¹ nasze obserwacje. Analiza ekspresji TIMP-3 wykaza³a spadek rednich wartoci TIMP-3 w podcielisku oraz w komórkach nowotworowych w stadium N2 w stosunku do N0. Natomiast w N3 odnotowano wzrost ekspresji tego inhibitora. Ponadto liczni autorzy podkrelili znaczenie prognostyczne TIMP-3, wskazuj¹c, i¿ pacjenci, u których obserwowano spadek ekspresji tkankowego inhibitora-3 charakteryzowali siê krótszym czasem prze¿ycia, w porównaniu z pacjentami z wy¿sz¹ ekspresj¹ TIMP-3. Badania te sugeruj¹ znaczenie TIMP-3 jako czynnika wykazuj¹cego w³aciwoci supresorowe w stosunku do wzrostu nowotworów oraz procesu angiogenezy [20,26]. Na podstawie przedstawionej powy¿ej dyskusji mo¿na wysun¹æ hipotezê, ¿e w ró¿nych typach raków p³askonab³onkowych obszaru g³owy i szyi, istniej¹ zró¿nicowane mechanizmy zwi¹zane z procesem transformacji nowotworowej uzale¿nione od MMPs i ich inhibitorów. Utrzymanie równowagi miêdzy aktywnoci¹ enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów odgrywa istotn¹ rolê w utrzymaniu prawid³owej struktury tkanek oraz zapobiega degradacji sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej. Nadmierna ekspresja enzymów proteolitycznych oraz brak aktywnoci odpowiednich inhibitorów prowadzi do destabilizacji równowagi pomiêdzy okrelonymi bia³kami, co w konsekwencji u³atwia migracjê komórek nowotworowych. Natomiast nadekspresja tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w stosunku do enzymów proteolitycznych prowadzi do zahamowania migracji komórek oraz tworzenia przerzutów odlePrzegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 g³ych [15]. Rozwój wiedzy dotycz¹cej roli metaloproteinaz oraz ich inhibitorów, podkrela znaczenie szlaków aktywacji MMP2 i MMP-9 [3,6,28]. Ponadto ocena wzajemnych interakcji pomiêdzy wyszczególnionymi parametrami, w procesie inwazji nowotworowej, mo¿e przyczyniæ siê do rozwoju terapii opartej na dzia³aniu przeciwinwazyjnym, a poznanie mechanizmów interakcji dzia³ania okrelonych metaloproteinaz oraz ich inhibitorów mo¿e mieæ istotny wp³yw na strategie terapeutyczne. Pimiennictwo 1. Bodnar M, Rekwirowicz H, Burduk P. i wsp.: Impact of tobacco smoking on biologic background of laryngeal squamous cell carcinoma. Przegl. Lek. 2009, 66, 598. 2. Bieñ S., Kamiñski B., ¯y³ka S. i wsp.: Ewolucja obrazu epidemiologicznego i klinicznego raka krtani i krtaniowej czêci gard³a w Polsce w latach 19912001. Otolaryngol. Pol. 2005, 59, 169. 3. Birkedal-Hansen B., Pavelic Z.P., Gluckman J.L. et al.: MMP and TIMP gene expression in head and neck squamous cell carcinomas and adjacent tissues. Oral Dis. 2000, 6, 376. 4. Blavier L., Henriet P., Imren S. et al.: Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in cancer. Ann. N Y Acad. Sci. 1999, 878, 108. 5. Christopoulos T.A., Papageorgakopoulou N., Ravazoula P. et al.: Expression of metalloproteinases and their tissue inhibitors in squamous cell laryngeal carcinoma. Oncol. Rep. 2007, 18, 855. 6. Clark I.M., Swingler T.E., Young D.A.: Acetylation in the regulation of metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression. Front Biosci. 2007, 12, 528. 7. Egeblad M., Werb Z.: New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat. Rev. Cancer. 2002, 2, 161. 8. Göröth T., Beier U.H., Bäumken J. et al.: Metalloproteinases and their inhibitors: influence on tumor invasiveness and metastasis formation in head and neck squamous cell carcinomas. Head Neck. 2006, 28, 31. 9. Gupta G.P., Massagué J.: Cancer metastasis: building a framework. Cell. 2006, 127, 679. 10. Hunter K.W.: Host genetics and tumor metastasis. Br. J. Cancer 2004, 90, 752. 11. Jodele S., Blavier L., Yoon J.M. et al.: Modifying the soil to affect the seed: role of stromal-derived matrix metalloproteinases in cancer progression. Cancer Metastasis Rev. 2006, 25, 35. 12. Kalluri R., Zeisberg M.: Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer 2006, 6, 392. 13. McAllister S.S., Wienberg R.A.: Tumor-host interactions: a far-reaching relationship. J. Clin. Oncol. 2010, 28, 4022. 14. Miyazaki T., Kato H., Nakajima M. et al.: An immunohistochemical study of TIMP-3 expression in oesophageal cell carcinoma. Br. J. Cancer. 2004, 91, 1556. 15. Murphy G., Nagase H.: Progress in matrix metalloproteinase research. Mol. Aspects Med. 2008, 29, 290. 16. Nakopoulou L., Tsirmpa I., Alexandrou P. et al.: MMP-2 protein in invasive breast cancer and the impact of MMP-2/TIMP-2 phenotype on overall survival. Breast Cancer Res. Treat. 2003, 77, 145. 17. Oberg A., Höyhtyä M., Tavelin B. et al.: Limited value of preoperative serum analyses of matrix metalloproteinases (MMP-2, MMP-9) and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMP-1, TIMP2) in colorectal cancer. Anticancer Res. 2000, 20, 1085. 18. Ohashi K., Nemoto T., Nakamura K. et al.: Increased expression of matrix metalloproteinase-7, and -9 and membrane type matrix metalloproteinase in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer. 2000, 88, 2201. 19. Oppenheimer S.B.: Cellular basis of cancer metastasis: A review of fundamentals and new advances. Acta Histochem. 2006, 108, 327. 20. Qi J.H., Ebrahem Q., Moore N. et al.: A novel function for tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3): inhibition of angiogenesis by blockage of M. Bodnar i wsp. VEGF binding to VEGF receptor-2. Nat. Med. 2003, 9, 407. 21. Remmele W., Stegner H.E.: Vorschlag zur einheitlichen Definition eines immunoreactiven Score (IRS) für den Immunohistochemischen Ostrogenrezeptor - Nachwies (ER-ICA) im Mammakarzinomgewebe. Pathologe. 1987, 8, 138. 22. Sato H., Kida Y., Mai M. et al.: Expression of genes encoding type IV collagen-degrading metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in various human tumor cells. Oncogene 1992, 7, 77. 23. Sato H., Takino T., Kinoshita T. et al.: Cell surface binding and activation of gelatynase A induced by expression of membranr-type-1- matrix metallo-proteinase (MT1-MMP). FEBS Lett. 1996, 385, 238. 24. Sato H., Takino T., Okada Y. et al.: A matrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumor cells. Nature. 1994, 370, 61. 25. Shim K.N., Jung S.A., Joo Y.H. et al.: Clinical sig- Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 nificance of tissue levels of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in gastric cancer. J. Gastroenterol. 2007, 42, 120. 26. Spurbeck W.W., Ng C.Y., Strom T.S. et al.: Enforced expression of tissue inhibitor of matrix metallo-proteinase-3 affects functional capillary morphogenesis and inhibits tumor growth in a murine tumor model. Blood. 2002, 100, 3361. 27. Sutinen M. Kainulainen T., Hurskainen T. et al.: Expression of matrix metalloproteinase (MMP-1 and -2) and their inhibitors (TIMP-1, -2, and -3) in oral lichen planus, dysplasia, squamous cell carcinoma and lymph node metastasis. Br. J. Cancer. 1998, 77, 2239. 28. Vihinen P., Käkäri V.M.: Matrix metalloproteinases in cancer: prognostic markers and therapeutic targets. Int. J. Cancer 2002, 99, 157. 29. Visscher W., Höyhtyä M., Ottosen S.K. et al.: Enhanced expression of tissue inhibitor of metalo-proteinase-2 (TIMP-2) in the stroma of breast carcinoma correlates with tumor recurrence. Int. J. Cancer 1994, 59, 339. 30. Visse R., Nagase H.: Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ. Res. 2003, 92, 827. 31. Wang W., Goswami S., Sahai E. et al.: Tumor cells caught in the act of invading: their strategy for enhanced cell motility. Trends Cell Biol. 2005, 15, 138. 32. Wierzbicka M., Szyfter W., Bieñ S. i wsp.: Zalecenia diagnostyczno-terapeutyczne dla wybranych nowotworów g³owy i szyi. Rak krtani. Wspó³cz. Onkol. 2006, 5, 195. 33. Wu Z.S., Wu Q., Yang J.H. et al.: Prognostic significance of MMP-9 and TIMP-1 serum and tissue expression in breast cancer. Int. J. Cancer. 2008, 122, 2050. 34. Ylisirnio S., Hoyhtya M., Turpeenniemi-Hujanen T.: Serum matrix metalloproteinase-2, -9 and tissue inhibitors of metalloproteinase-1, -2 in lung cancerTIMP-1 as prognostic marker. Anticancer Res. 2000, 20, 1311. 683