MultiMix - Agilent
Transkrypt
MultiMix - Agilent
MultiMix™ Dual-Colour Reagent Anti-Human CD45/FITC Anti-Human CD14/RPE Nr kat. FR700 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. FR700 jest przeznaczony do stosowania w cytometrii przepływowej. CD45 jest najpowszechniej występującą glikoproteiną na powierzchni leukocytów, a jej ekspresję wykazują wyłącznie komórki układu krwiotwórczego oraz ich komórki macierzyste (1). Przeciwciało przeciw antygenowi CD14 odgrywa ważną rolę w szczegółowej analizie limfocytów T ze względu na wykluczanie monocytów CD14-dodatnich (2, 3). Połączenie antygenów CD45 i CD14 umożliwia równoczesne dalsze różnicowanie leukocytów na limfocyty, monocyty i granulocyty. Interpretację wyników powinien przeprowadzić pracownik uprawniony do wykonywania takich badań w oparciu o historię choroby pacjenta oraz inne testy diagnostyczne. Odczynnik dostarczony FR700 składa się z dwóch następujących, starannie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych: Przeciwciało Monoclonal Mouse Anti-Human CD45, Clone T29/33, skoniugowane z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Przeciwciało Monoclonal Mouse Anti-Human CD14, Clone TÜK4, skoniugowane z R-fikoerytryną (RPE). Oba koniugaty FR700 zostały wyprodukowane z izotypów kappa oczyszczonych mysich przeciwciał monoklonalnych IgG1(CD45) i IgG2a (CD14). FR700 jest dostarczany w postaci płynnej w buforze zawierającym 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3 o pH 7,2. Każda fiolka zawiera 50 testów (10 µL koniugatu przeznaczone jest dla maksymalnie 106 leukocytów z normalnej ludzkiej krwi obwodowej). Swoistość Przeciwciałon r kat. Fluorochrom Nr kat. odczynnika kontrolnego FR700 FITC i RPE X0949 Przeciwciało Anti-CD45, T29/33, włączono do programu Trzecich i Czwartych Międzynarodowych Warsztatów i Konferencji: Ludzkie antygeny różnicowania leukocytów (International Workshops and Conferences on Human Leucocyte Differentiation Antigens). Na Trzecich Warsztatach przeciwciało zaliczono do grupy przeciwciał antygenu CD45, reagujących ze wszystkimi znanymi izotypami rodziny CD45, zwanej również rodziną wspólnych antygenów leukocytowych (4). Na Czwartych Warsztatach wykazano ekspresję CD45 w szeregu krwiotwórczych linii komórkowych oraz jego brak w niekrwiotwórczych liniach komórkowych. Co istotne, komórki szpiczaka oraz plazmatyczna linia komórkowa U-266 wykazywały ekspresję CD45 na bardzo niskim poziomie (5). Przeciwciało Anti-CD14, TÜK4, włączono do programu Czwartych, Piątych i Szóstych Międzynarodowych Warsztatów i Konferencji: Ludzkie antygeny różnicowania leukocytów (International Workshops and Conferences on Leucocyte Differentiation Antigens), a badania przeprowadzone przez liczne laboratoria potwierdziły jego reaktywność z antygenem CD14 (6-8). Przeciwciało Anti-CD14, TÜK4, wchodzi w silne reakcje z monocytami krwi obwodowej i wykazuje wysoką reaktywność na granulocyty. Reaguje również z makrofagami okołonaczyniowymi. Przeciwciało znakuje 50% komórek Langerhansa w zawiesinach komórek naskórka i dlatego jest charakteryzowane jako słabo reaktywne (8). Środki ostrożności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stężeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, może reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych należy stosować prawidłowe procedury postępowania. Przechowywanie Przechowywać w ciemnym miejscu w temp. 2-8°C. Nie używać po dacie ważności podanej na etykiecie fiolki. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane powyżej, użytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na utratę stabilności produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pacjenta należy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. Jeśli wystąpi nieoczekiwany wzór barwienia, którego nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, że przyczyną może być problem z przeciwciałem, należy niezwłocznie skontaktować się z działem pomocy technicznej naszej firmy. Wykonanie odczynu 1. Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej o wymiarach 12 mm x 75 mm. 2. Dodać 10 µL FR700 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym. 3. Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub przez 15–30 minut w temperaturze pokojowej (20–25°C). (106752-003) FR700/PL/OKJ/11.03.05 p. 1/3 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · Nr CVR 33 21 13 17 4. Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym pomieszczeniu. 5. Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym pomieszczeniu. 6. Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go, pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy. 7. Dodać do probówki 2 mL PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę komórek za pomocą mieszadła wibracyjnego. 8. Powtórzyć etap 6. 9. Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS. 10. Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności i temperaturze 2–8°C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia. Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie wykonywania odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem. Uwagi dotyczące procedury Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne w celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek. Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą się zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w każdym laboratorium. Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być dopasowany do izotypów i fluorochromów sprzężonego przeciwciała. Zalecanym dwubarwnym odczynnikiem kontrolnym dla FR700 jest odczynnik Dako o numerze kat. X0949. Etapy 4 i 5: Jeśli używany jest inny odczynnik do lizy komórek, należy przy jego doborze kierować się poniższymi zaleceniami. Należy zauważyć, że jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza (np. Dako EasyLyse™, nr kat. S2364) PBS w kroku 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba że próbka zostanie przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy. Etap 10: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej ilości komórek, w których zachodzi ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca ekspresji antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów. Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru. Piśmiennictwo (106752-003) 1. Leong AS-Y, Cooper K, Leong FJW-M. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. Londyn: Oxford University Press; 2003. str. 121-4. 2. Centers for disease control. Guidelines for the performance of CD4+ T-cell determinations in persons with human immunodeficiency virus infection. MMWR 1992;41 (Nr RR-8);001. Data publikacji przez CDC 05/08/1992. 3. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Document. Clinical applications of flow cytometry: Quality assurance and immunophenotyping of peripheral blood lymphocytes. H42-T 1992;12:1-76. 4. Cobbold S, Hale G, Waldmann H. Non-lineage, LFA-1, and leucocyte common antigens: new and previously defined clusters. In: McMichael AJ, Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch FM, et al., editors. Leukocyte typing III. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd International Workshop and Conference; 1986, Sep 21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1987. p. 788-803. 5. Schwinzer R. N7. Cluster report: CD45/CD45R. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, et al., editors. Leukocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th International Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1989. p. 628-34. 6. Goyert SM, Haziot A, Jiao D, Katz IR, Kruger C, Ross J, Schütt C. M4. CD14 cluster workshop report. In: Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, Ritz J, et al., editors. Leucocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the Fifth International Workshop and Conference; Held in Boston, USA, 3-7 November 1993. Volume One. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1995. p. 778-82. 7. Goyert SM, Cohen L, Gangloff SC, Ashmun R, Haeffner-Cavaillon N. MC4. CD14 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996, Nov 10-14; Kobe, Japonia. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997.p. 963-5. 8. Goyert SM, Tesio L, Ashman LK, Ball E, Bazil V, Garrido F, Hogg N, Horejsi V, et al. M3.1. Report on the CD14 cluster workshop. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, von dem Borne AEG, editors. Leucocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens; 1989, February 21-25, Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1989. p. 789-94. FR700/PL/OKJ/11.03.05 p. 2/3 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · Nr CVR 33 21 13 17 Objaśnienie symboli (106752-003) Numer katalogowy Zakres temperatur Urządzenie medyczne do diagnostyki in vitro Nr serii Przed użyciem zapoznać się z instrukcjami Termin ważności Producent FR700/PL/OKJ/11.03.05 p. 3/3 Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · Nr CVR 33 21 13 17