1 Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk Anna Piasecka

Instytut Genetyki Roślin
Polskiej Akademii Nauk
Anna Piasecka
Zmiany profili fenolowych metabolitów wtórnych u roślin jęczmienia
(Hordeum vulgare L.) poddanych stresowi niedoboru wody
AUTOREFERAT
Praca doktorska wykonana pod kierunkiem
dra hab. Piotra Kachlickiego prof. IGR PAN
w Instytucie Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk
Poznań, 2013
1
1. Streszczenie
Badania w przedstawionej pracy skupiły się na analizie fenolowych metabolitów
wtórnych w metanolowym ekstrakcie otrzymanym z liści 9 odmian jęczmienia jarego oraz
100 linii wsobnych mieszańców F1 powstałych ze skrzyżowania odmian Maresi×CamB1.
Jednym z etapów pracy było profilowanie metabolitów przy użyciu ultrasprawnej
chromatografii cieczowej UPLC. Wygenerowany duży zestaw danych metabolomicznych,
poddano zaawansowanym transformacjom matematycznym do formy umożliwiającej dalsze
analizy statystyczne. Efektem połączonych prac metabolomicznych, matematycznych i
statystycznych była wizualizacja dynamiki zmian zawartości badanych metabolitów w
różnych warunkach niedoboru wodny.
Profilowanie fenolowych metabolitów wtórnych zostało użyte także do klasyfikacji
chemotaksonomicznej 9 odmian jęczmienia pochodzących z różnych rejonów geograficznych
i znalezienia markerów metabolomicznych różnicujących odmiany w czasie suszy i w
warunkach pełnego uwodnienia na różnych etapach rozwoju.
Równolegle prowadzono identyfikację metabolitów u 9 odmian jęczmienia.
Niskorozdzielczy spektrometr mas z pułapką jonową dostarczył szczegółowych danych o 165
metabolitach jęczmienia, w tym wielu nieznanych dotąd u tego gatunku. Potwierdzeniem
uzyskanych informacji strukturalnych były analizy przy użyciu wysokorozdzielczego
tandemowego spektrometru mas oraz spektroskopu magnetycznego rezonansu jądrowego,
dzięki któremu ustalono struktury 5 metabolitów, w tym 3 nie opisywanych dotąd u
jęczmienia. W celu uzyskania prób do analiz NMR opracowano metodę chromatografii
preparatywnej z wykorzystaniem dwóch rodzajów złóż, poliamidu oraz RP C18, co poprawiło
znacznie wydajność rozdziału.
Analiza strukturalna przy użyciu wyżej wymienionych systemów została rozszerzona
o identyfikację kolejnych 109 metabolitów występujących w śladowych ilościach jak również
45 związków indukowanych pod wpływem niedoboru wody. Efektem prac było znaczne
poszerzenie dotychczasowej wiedzy na temat metabolomu jęczmienia i bogactwa fenolowych
metabolitów wtórnych u różnych odmian jęczmienia.
2. Wstęp
Jęczmień, zwłaszcza jego forma jara, jest w Polsce uprawiany na szeroką skalę.
Główny rynek zbytu dla tych upraw tworzą firmy produkujące pasze dla zwierząt. Jęczmień
konsumpcyjny wykorzystywany jest do produkcji płatków i kasz. Niestety obserwuje się
2
spadek wykorzystania jęczmienia w tym kierunku. Miejsce to stopniowo zajmują odmiany
browarne z przeznaczeniem do produkcji słodu. Następuje też wzrost zainteresowania
produktami jęczmiennymi zaliczanymi do żywności witalizującej.
W ostatnich latach coraz częściej pojawia się w polskim rolnictwie problem strat w
plonach z powodu suszy, dlatego prace mające na celu zdobycie kompleksowej wiedzy na
temat mechanizmów tolerancji na suszę u roślin są kluczowe dla stabilizacji produktywności
zbóż w niekorzystnych warunkach środowiskowych.
Niedobór wody u roślin pojawia się, gdy obniżona jest aktywność wody w
środowisku. Dzieje się tak w przypadku utrudnionego zaopatrzenia korzeni w wodę albo przy
bardzo wysokim poziomie transpiracji. Pobieranie wody może być także ograniczone przez
niską temperaturę, zasolenie, niedotlenienie lub uszkodzenie systemu korzeniowego.
Odporność roślin na suszę jest niezwykle złożonym zjawiskiem, które obejmuje cały
szereg zmian genetycznych, fizjologicznych i morfologicznych. Jednym z przejawów suszy
są zmiany w zawartości metabolitów fenolowych, które mogą w stresie pełnić funkcje
fotoochronne, antyoksydacyjne, osmoprotekcyjne, sygnalizacyjne oraz regulacyjne.
3. Cel pracy
Niniejsze badania stanowią część wielodyscyplinarnego projektu mającego na celu
kompleksowe zbadanie mechanizmów tolerancji zbóż na niedobór wody. Analizy
zaplanowano z założeniem, iż w jęczmieniu występuje duże, nieodkryte dotąd bogactwo
metabolitów wtórnych oraz przynamniej niektóre z nich uczestniczą w odpowiedzi roślin na
niedobór wody oraz w procesach aklimatyzacyjnych. Głównym celem tu opisanych badań jest
metabolomiczne
podejście
do
poznania
molekularnego
fenotypu
jęczmienia
oraz
poszukiwania charakterystycznego wzoru zmian profili fenolowych metabolitów wtórnych w
liściach roślin tego gatunku związanych z odpowiedzią na stres suszy. Obecność, brak lub
zwiększona akumulacja określonych metabolitów w połączeniu z danymi genetycznymi i
proteomicznymi może w przyszłości dostarczyć cennych markerów selekcji w programach
hodowlanych jęczmienia odpornego na stresy środowiskowe.
Realizacja wyżej wymienionych celów wymagała zaangażowania metod z zakresu
biologii, chemii analitycznej, matematyki, informatyki i statystyki, co nadaje pracy charakter
multidyscyplinarny. W pracy dążono do podsumowania obecnej wiedzy na temat metabolomu
wtórnego u jęczmienia oraz poszerzenia jej w jak największym zakresie o nowe elementy
dotyczące regulacji ich biosyntezy w warunkach stresu środowiskowego.
3
4. Materiały i metody
Materiał roślinny
Przepadano 9 odmian dwurzędowego jęczmienia jarego (Hordeum vulgare L.)
uprawianych w trzech kolejnych latach 2009-2011 w szklarni IGR PAN. Są to odmiany
pochodzące z: Europy - Georgia (Anglia), Maresi (Niemcy), Lubuski, Stratus (Polska),
Sebastian (Dania); Stanów Zjednoczonych - Morex; Syrii - CamB1/C1, Harmal, MaresDingo.
Dodatkowo w 2011 roku analizy prowadzono na 100 liniach RIL wyprowadzonych z
mieszańców Maresi×CamB1.
W poszczególnych latach stosowano suszę na różnych etapach rozwoju:
 Susza 1. (S1) - 5%-6% wilgotności gleby od stadium 3-listnej siewki przez 10 dni
 Susza 2. (S2) - 5%-6% wilgotności od stadium liścia flagowego przez 14 dni
 Susza 3. (S3) - susza łączona. 5%-6% wilgotności gleby od stadium 3-listnej siewki
przez 10 dni, po czym przywrócenie uwodnienia do stanu kontrolnego i kolejne
zaprzestanie podlewania w stadium liścia flagowego aż do uzyskania wilgotności
gleby 5%-6% i utrzymywanie takiej wilgotności przez kolejne 14 dni
Fenolowe metabolity wtórne wyizolowano również w skali preparatywnej z 1,4 kg
liści odmiany Maresi, poddanej suszy według parametrów S2.
Procedury przygotowywania ekstraktów roślinnych, parametry akwizycji danych
chromatograficznych oraz spektrometrycznych dostępne są w artykułach:
1. Sawikowska A., Swarcewicz B., Piasecka A., Kuczyńska A., Krystkowiak K.,
Ogrodowicz P., Mikołajczak K., Kachlicki P., Krajewski P., Stobiecki M. (2013). A
data analysis protocol for monitoring metabolomic changes in multifactorial
experiments: a study of barley (Hordeum vulgare) leaves under drought stress.
Analytical & Bioanalytical Chemistry. Złożone do druku
2. Wojakowska A., Piasecka A., García-López P.M., Zamora-Natera F., Krajewski P.,
Marczak Ł., Kachlicki P., Stobiecki M. (2013). Structural analysis and profiling of
phenolic secondary metabolites of Mexican lupine species using LC-MS techniques.
Phytochemistry, DOI: 10.1016/j.phytochem.2013.04.006
3. Stobiecki M., Staszków A., Piasecka A., Garcia-Lopez P.M., Zamora-Natera F.,
Kachlicki P. (2010). LC-MSMS profiling of flavonoid conjugates in wild Mexican
lupine Lupinus reflexus. J. Nat. Prod., 73: 1254-1260
Analizy instrumentalne
Platformą do przeprowadzania analiz strukturalnych w głównej mierze był układ
wysokosprawnego
chromatografu
cieczowego
z
detektorem
UV
sprzężonego
z
niskorozdzielczym spektrometrem mas wyposażonym w pułapkę jonową HPLC-UV-ESI4
MSn. Dodatkowo, dla wybranych prób przeprowadzono analizy na wysokorozdzielczym
spektrometrze mas z kwadrupolową komorą kolizyjną UPLC-micrOTOF-Q znajdującym się
w Instytucie Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu. Analizy te zostały przeprowadzone w
celu potwierdzenia wcześniej uzyskanych wyników.
Do rozdziału preparatywnego mieszaniny ekstrakcyjnej wykorzystano dwa rodzaje
wypełnień chromatograficznych o odmiennym sposobie adsorpcji związków fenolowych:
poliamidu oraz RP C18. Wyizolowane i oczyszczone metabolity uzyskane w największych
ilościach poddano następnie analizom magnetycznego rezonansu jądrowego NMR w
Środowiskowym Laboratorium Unikalnej Aparatury Chemicznej Uniwersytetu im. Adama
Mickiewicza w Poznaniu oraz w Zespole Biomolekularnego NMR Instytutu Chemii
Bioorganicznej PAN w Poznaniu.
Ultrasprawny chromatograf cieczowy z detektorem fotodiodowym PDA-UPLC służył
do otrzymania chromatogramów UV reprezentujących profile związków fenolowych w
poszczególnych
próbach.
Profile
te
poddano
zaawansowanym
transformacjom
matematycznym umożliwiającym ujęcie statystyczne zawartych w nich danych jakościowych
i półilościowych. Obliczenia chemometryczne wykonała dr Aneta Sawikowska z Zakładu
Biometrii i Bioinformatyki IGR PAN. Analizy statystyczne wykonane zostały przez prof.
Pawła Krajewskiego z Zakładu Biometrii i Bioinformatyki IGR PAN oraz dr Anetę
Sawikowską i obejmowały analizy zmian fenolowych metabolitów wtórnych pod wpływem
niedoboru wody oraz grupowanie odmian na podstawie zawartości fenolowych metabolitów
wtórnych w warunkach kontrolnych dla chromatogramów roślin z doświadczenia 2010 r
oddzielnie dla kontroli z 1 dnia suszy w stadium siewki oraz dla kontroli z 1 dnia suszy w
stadium liścia flagowego.
5
Poniższy schemat obrazuje szczegółowo etapy analiz strukturalnych oraz sposób badania reakcji na deficyt wody u jęczmienia
Materiał roślinny
Ekstrakt fenolowy
Identyfikacja strukturalna
Chromatografia
preparatywna (złoże
poliamidowe)
UPLC-micrOTOF-Q
(potwierdzenie danych
HPLC-UV-ESI-MSn)
HPLC preparatywna
(złoże RP C18)
NMR (potwierdzenie danych
HPLC-UV-ESI-MSn)
Reakcje na deficyt wody
HPLC-UV-ESI-MSn
Metabolity w
warunkach
kontrolnych
Metabolity w śladowych
ilościach
PDA-UPLC
Metabolity
indukowane pod
wpływem suszy
Analiza
chemotaksonomiczna
Zmiany pod
wpływem niedoboru
wody
Przetwarzanie
matematyczne
Analizy statystyczne
i wizualizacja
statystyk
7
5. Wyniki
Dwuetapowa chromatografia preparatywna i NMR
Chromatografia preparatywna umożliwiła wyizolowanie 10 związków w ilościach
pozwalających na analizy NMR. Uzyskane widma protonowe NMR pozwoliły określić
struktury aglikonów jako apigeninę, luteolinę oraz chryzoeriol. Widma korelacyjne NMR
posłużyły do określenia struktur 6-C-[2”-O-glikozylo]-glikozydów oraz 7-O-glikozylo-6-Cglikozydów flawonów.
Identyfikacja metabolitów różnych odmian jęczmienia
Analizy spektrometryczne metabolitów 9 odmian jęczmienia u roślin rosnących w
warunkach kontrolnych w doświadczeniach z lat 2009 oraz 2010. W roku 2011 włączono
odmiany Maresi i Cam B1 a także losowo wybrane linie RIL: 24, 26, 68, 86, 111, 119, 128
uzyskane z ich skrzyżowania. Łącznie zidentyfikowano 165 metabolitów należących do
trzech klas związków fenolowych: kwasy hydroksycynamonowe i ich pochodne, acylowane
poliaminy oraz flawonoidy.
U jęczmienia zidentyfikowano pochodne kwasu p-kumarowego, ferulowego,
hydroksyferulowego,
kawowego
oraz
synapinowego,
które
występują
głównie
w
połączeniach z cukrami lub kwasem chinowym (kwasy chlorogenowe).
Wśród acylowanych poliamin zinterpretowano widma hordatyn A oraz B oraz ich
prekursorów, p-kumaroiloagmatyny oraz feruloiloagmatyny. Wykryto także glikozydy
hordatyn. Dodatkowo u wszystkich odmian, z wyjątkiem syryjskiej odmiany Harmal,
zidentyfikowano trzeci rodzaj hordatyny, nieopisany wcześniej w literaturze. W niektórych
liniach RIL obserwowano również jony glikozydu tejże hordatyny.
Przeważającą część związków fenolowych zidentyfikowanych u jęczmienia stanowią
flawonoidy. Najczęściej pojawiają się glikozydy flawonów, wśród których zidentyfikowano:
apigeninę, luteolinę, chryzoeriol oraz trycynę. Dodatkowo wykryto pochodne flawonoli
kwercetyny oraz izoramnetyny a także flawanonu naringeniny. Tworzą one struktury
związane z cukrami: glukozą, ramnozą oraz arabinozą. Cukry przyłączają się do aglikonów w
postaci mono-, dwu-, lub trójglikozydów połączonych ze sobą wiązaniem 1→6
glikozydowym. Przyłączenie do aglikonu ma dwojaki charakter: wiązania O-glikozydowego
lub C-glikozydowego, przy czym w cząsteczkach obok siebie mogą występować oba typy
wiązań. Zinterpretowano także widma masowe należące do 6,8-dwu-C-glikozydów
apigeniny, chryzoeriolu oraz luteoliny.
Glikozydy flawonoidów, podobnie jak poliaminy, u jęczmienia występują w
połączeniu z kwasami hydrokosycynamonowymi: p-kumarowym, kawowym, ferulowym,
7
hydroksyferulowym oraz synapinowym, a połączenia te są bardzo różnorodne. U odmian
syryjskich M. Dingo i Harmal, oraz polskiej Lubuski i amerykańskiej Morex znaleziono także
kilka flawonoidów acylowanych alifatycznym kwasem malonowym.
Identyfikacja metabolitów występujących w śladowych ilościach
W poszczególnych frakcjach uzyskanych dzięki chromatografii preparatywnej
zidentyfikowano 109 metabolitów nie wykrywanych w standardowych analizach HPLC-MSn.
Wśród nich znajdowały się metabolity nieopisywane dotąd w literaturze.
Wykryto 6 pochodnych putrescyny oraz hydroksyputrescyny acylowanych kilkoma na
raz kwasami hydroksycynamonowymi. Zidentyfikowano także struktury 6-C-[6”-Oglikozylo]-glikozydy flawonoidów. Metabolity należące do tych klas nie notowano dotąd u
jęczmienia.
Identyfikacja metabolitów indukowanych pod wpływem suszy
W roślinach poddanych suszy zaobserwowano 45 metabolitów, które nie występowały
w roślinach kontrolnych.
Dla próbek zebranych 5 dnia S1 większość indukowanych metabolitów stanowiły trójlub tetraglikozydy flawonoidów. Na koniec S1 pojawiły się związki acylowane kwasami
ferulowym, hydroksyferulowym oraz synapinowym. W suszy S3 u odmiany Maresi pojawiły
się związki podwójnie acylowane.
Ocena zmian fenolowych metabolitów wtórnych jęczmienia w odpowiedzi na suszę
Analizy numeryczne pozwoliły wykryć 104 statystycznie istotne sygnały we
wszystkich chromatogramach z 9 odmian analizowanych w 2010 r.
Analiza wariancji wszystkich sygnałów pokazała istotność trzech interakcji: zmian
sygnałów zależnych od wariantu nawadniania a niezależnych od odmiany i dnia suszy – W,
zmian zależnych od odmiany i wariantu nawadniania – OW oraz zmian zależnych od
odmiany, dnia suszy oraz wariantu nawadniania – OTW.
Susza S1 w stadium 3-listnej siewki, wywoływała zmiany w zawartości największej
liczby sygnałów - 42. Reakcje te były mało specyficzne dla odmiany. W stadium liścia
flagowego
reagowało
dwa
razy
mniej
metabolitów.
Reakcje
odmianowo-
i
czasowospecyficzne metabolitów w S1, różnicują odmiany na wyraźne grupy. W końcowej
fazie suszy Maresi wykazywała najmniej podobną reakcje do pozostałych odmian, natomiast
zmiany w metabolitach u odmiany Stratus, Cam B1 i Morex były zbliżone.
Dla suszy aplikowanej w stadium liścia flagowego reakcje metabolitów różniły się od
tych obserwowanych dla suszy w stadium siewki. Dla modelu OW po wstępnym wzroście
8
ilościowej zawartości metabolitów w liściach prawie wszystkich badanych odmian w trakcie
upływu czasu obserwowano zmniejszanie ich ilości.
W S3 wszystkie zmiany były odmianowo-specyficzne i dotyczyły 32 sygnałów.
Większość reakcji związana była ze zwiększaniem zawartość metabolitów.
W doświadczeniu 2011 r analizy statystyczne dotyczyły wizualizacji zmian
poszczególnych metabolitów dla całej populacji MCam łącznie. Wśród badanych lini RIL
najczęstszą reakcją roślin na suszę S1 była zmiana zawartości związków, w których strukturze
występowały kwasy hydroksycynamonowe jako podstawniki.
Charakterystyka chemotaksonomiczna badanych odmian jęczmienia
Dwie odmiany syryjskie, Harmal i M. Dingo wykazywały podobieństwo zawartości
metabolitów fenolowych niezależnie od stadium rozwojowego. Odmiana syryjska Cam B1,
oraz Morex ze Stanów Zjednoczonych, wykazywały właściwości zbliżone do odmian
europejskich. Różnice w składzie metabolitów fenolowych nie były tak widoczne na
wczesnym etapie rozwoju jak w późniejszej fazie.
6. Dyskusja
Najpełniejszy opis flawonoidów u jęczmienia do tej pory znaleziono u Ferreres’a i in.
(2008). Flawonoidy u jęczmienia cechują się dużą różnorodnością miejsc glikozylacji. Fakt
ten może świadczyć o aktywności całej puli pozycyjno-specyficznych glikozylotransferaz.
Wydaje się, iż aktywność glukozylotransferaz odpowiedzialnych za glikozylacje 2”-OH
zwiększa się w późniejszych fazach rozwojowych.
Acylacje
flawonoidów
kwasami
hydroksycynamonowymi
są
szeroko
rozpowszechnione u roślin, również u jęczmienia. Wartością dodaną obecnych analiz jest
identyfikacja szeregu metabolitów zawierających kwas 5-hydroksyferulowy. Za obecnością
takiej izoformy przemawia występowanie u jęczmienia O-metylotransferaz, dla których
substratem jest kwas 5-hydroksyferulowy (Lee i in., 1997).
Acylacje 6-C-glukozydów flawonoidów tworzących struktury 6-C-[2”-O-glikozylo6”-acylo]-glikozydów występują jedynie w mieszańcach Maresi×CamB1, co może być
związane z uruchomieniem dodatkowych aktywności enzymatycznej w liniach wsobnych.
23 zidentyfikowane związki posiadają acyle przyłączone bezpośrednio do aglikonu.
Tego typu struktury nie zostały dotąd opisane u jęczmienia, niemniej bezpośrednie acylacje
aglikonów flawonoidów spotykane są u roślin (Stobiecki i in., 2010). Jednak dla ostatecznego
potwierdzenia dokładnych struktur konieczne jest przeprowadzenie analiz NMR.
9
Obecne badania pozwoliły na wykrycie 13 pochodnych trycyny dotąd nie znanych u
jęczmienia. Obecność tych związków może wynikać z właściwości grup metoksylowych,
licznie występujących w ich strukturach. Przykładowy związek 7-O-[6”-synapoilo]-glukozyd
trycyny zawiera łącznie 4 grupy metoksylowe.
Nowością w stosunku do danych literaturowych jest również zidentyfikowanie u
jęczmienia malonylowanych pochodnych flawonoidów. Acylacja kwasem malonowym
związana jest z transportem i przechowywaniem flawonoidów oraz chroni je przed
enzymatyczną degradacją glikokoniugatów (Zhao i in., 2011). Choć nie ma w literaturze
opisu malonylotransferazy u jęczmienia, dobrze scharakteryzowany jest enzym o takiej
aktywności u ryżu (Kim i in., 2009).
W literaturze brak informacji na temat bardziej złożonych acylacji poliamin u
jęczmienia. Struktury takie zidentyfikowano natomiast u A. thaliana (Handrick i in., 2010).
Dokładniejsze zbadanie tych intrygujących metabolitów wymaga przeprowadzenia analiz w
dodatnim trybie jonowym i modyfikacji parametrów rozdziału chromatograficznego ze
względu na ich dużą hydrofilowość.
Nie ma w literaturze informacji na temat zmian metabolitów fenolowych u jęczmienia
pod wpływem niedoboru wody. Kompleksowość badań nad ich zachowaniem w czasie suszy
u jęczmienia wymagała monitoringu ich zmian ilościowych oraz nowych metabolitów
pojawiających się w suszy.
Indukcja nowych metabolitów ukazuje kierunek zmian w biosyntezie fenolowych
metabolitów wtórnych, jakie zachodzą w komórkach pod wpływem suszy i daje możliwość
dyskusji na temat pełnionych przez nie funkcji. Początek suszy jest sygnałem dla roślin
jęczmienia do wzmożonej syntezy glikozydów flawonoidów. Glikozylacje są niezbędne do
transportu tych związków oraz ich akumulacji w wakuolach. Z drugiej strony glikozylacje
powodują zablokowanie reaktywnych grup hydroksylowych, co chroni flawonoidy przed
autooksydacją (Burda i Oleszek, 2001). Być może nagromadzona pula glikozylowanych
związków wykorzystywana jest do procesów acylacji pojawiających się w długotrwałej suszy.
Wart podkreślenia jest fakt, iż wszystkie pojawiające się acyle zawierają grupy metoksylowe.
Obecność metabolitów z grupami metoksylowymi rozszerza zakres pochłaniania najbardziej
energetycznych długości fal UV-B oraz UV-A i dzięki temu mogą efektywniej zapobiegać
powstawaniu wolnych rodników tworzonych pod wpływem UV. Z kolei połączenie tych acyli
z flawonoidami znacznie wzmaga intensywność absorpcji (Stochmal i Oleszek, 2007).
Biosynteza flawonoidów acylowanych w czasie suszy ma związek ze zwiększeniem
wydajności fotoochrony zwłaszcza przeciw UV-B. Uzyskane dane potwierdzają wnioski z
10
pracy Schmitz-Hoerner i Weissenböck, (2003). Powyższe fakty sugerują krzyżowanie się
mechanizmów tolerancji na suszę i UV-B, co zgodne jest z wnioskami innych badaczy (He i
in., 2011; Kilian i in., 2007; Schmidt i in., 2000). Wnioski te stanowią wkład w wiedzę na
temat fizjologii jęczmienia i roli flawonoidów w czasie suszy u roślin.
Badania przeprowadzone podczas realizacji tej pracy i dokonane identyfikacje
fenolowych metabolitów wtórnych znacznie wzbogacają wiedzę na temat metabolomu
jęczmienia uprawnego. Dzięki przebadaniu różnorodnych genotypów zidentyfikowano cały
szereg związków nieznanych dotąd u tego gatunku. Dużą rolę w identyfikacji tych
metabolitów odegrało prowadzenie analiz metodą spektrometrii mas zarówno w jonizacji
ujemnej jak i dodatniej, a także przy użyciu instrumentu o wysokiej rozdzielczości, dzięki
czemu uzyskano komplementarne informacje o budowie związków i pozwoliło rozróżnić
podstawniki acylowe od glikozydowych. Należy podkreślić, że identyfikacja metabolitów
była możliwa także dzięki zastosowaniu ich oczyszczaniu w skali preparatywnej i
przeprowadzeniu analiz NMR.
Analizy statystyczne dały szereg informacji o zachowaniu się wtórnych metabolitów
fenolowych w czasie niedoboru wody u jęczmienia. Różnorodność reakcji wśród odmian
jęczmienia świadczy o dużym zróżnicowaniu mechanizmów obronnych każdej z nichoraz
może być skorelowana z różną tolerancją poszczególnych odmian na deficyt wody.
Zawartość kwasów hydroksycynamonowych i ich nieflawonoidowych pochodnych nie
zmieniała się w czasie trwania suszy S1 i S2. Stan taki mógł być spowodowany wyrównaniem
się procesów ich biosyntezy z jednoczesnym wykorzystaniem ich jako substratów do różnych
procesów, w tym metylacji i acylacji flawonoidów. Wyjątek stanowiła synapoiloglukoza, dla
której notowano spadek zawartości u większości odmian. Jest ona substratem dla niektórych
acylotransferaz, a obserwowany spadek poziomu tego związku u większości odmian może
świadczyć o korelacji z syntezą acylowanych flawonoidów mających udział w odpowiedzi
roślin na suszę, a także wykorzystaniem tego związku jako składnika ścian komórkowych.
Podobne zjawisko spadku zawartości glikozydu kwasu synapinowego przy jednoczesnym
braku reakcji dla pozostałych kwasów hydroksycynamonowych opisywano w literaturze u
innych roślin (Ceoldo i in., 2009).
Spadek zawartości metabolitów obserwowany w S2 może mieć związek z
intensywniejszym wykorzystywaniem innych mechanizmów odpowiedzi na niedobór wody
rozwiniętych w czasie rozwoju roślin. Natomiast przez cały okres trwania S3 występowały
reakcje dodatnie dla wszystkich odmian, co sugeruje udział tych metaboitów w procesach
aklimatyzacji, podobny efekt obserwowano dla sosny (Watkinson i in., 2003). Za
11
potwierdzeniem tej hipotezy przemawia specyficzność odmianowa reakcji związków
fenolowych u jęczmienia w drugim etapie S3.
Postulowanymi metabolitami biorącymi udział w mechanizmach aklimatyzacyjnych,
wykazującymi zwiększoną zawartość po przejściu pierwszego etapu suszy są kwasy
hydroksycynamonowo-chinowe, których udział w aklimatyzacji do podwyższonego poziomu
promieniowania słonecznego był tematem kilku publikacji (Grace i in., 1998; Kolb i in.,
2001).
Ponadto niniejsza praca wskazuje na wzmożoną akumulację glukozydu hordatyny we
wszystkich wariantach suszy. Wzrost zawartości poliamin obserwowano w stresach
abiotycznych (Watson i Malmberg, 1996; Evans i Malmberg, 1989). Z kolei Liu i in. (2000)
zasugerowali regulacyjną rolę poliamin w działaniu aparatów szparkowych. Kluczowe
znaczenie w określeniu funkcji acylowanych poliamin mają ich właściwości strukturalne, o
czym świadczy odmienność reakcji izomerycznych glikozydów hordatyn. Zawartość
niektórych metabolitów wzrastała zarówno w roślinach poddanych suszy jak i kontrolnych.
Niewykluczone, iż zmiany te związane są z regulacją hormonalną (Treutter, 2006; Ballizany i
in., 2012).
W obrębie linii RIL w porównaniu z poszczególnymi odmianami obserwowano
zwiększeniu poziomu reakcji. Niezwykle interesujące jest zagadnienie występowania wśród
reakcji na suszę w 2011 r. obu izomerów hordatyn oraz pojawienie się odpowiedzi hordatyny
C, nienotowanej w poprzednich doświadczeniach. Odmienność reakcji różnych izomerów
hordatyn potwierdza przypuszczenia, co do wieloaspektowego oddziaływania tych
metabolitów w czasie suszy.
Analizy chemotaksonomiczne są powszechnie uważane za wartościowe źródło
informacji na temat zależności międzygatunkowych lub międzyodmianowych (Wojakowska i
in., 2013). Zaobserwowane różnice w składzie fenolowych metabolitów wtórnych u
jęczmienia nie odzwierciedlały geograficznego pochodzenia poszczególnych odmian jak
stwierdzono w pracy Frost i in., (1977). 15 metabolitów różnicowało odmiany w stadium
siewki a 22 w stadium liścia flagowego. Siedem z nich było istotnych dla obu stadiów
rozwojowych i wydaje się, że są one kluczowymi znacznikami chemicznymi dla odmian.
Związki te zawierają acylacje kwasami synapinowym oraz ferulowym. Są to pochodne
glikozydowe głównie izowiteksyny, ale też metoksylowanych flawonów trycyny oraz
chryzoeriolu. Obserwowano także związek 18 metabolitów różnicujących odmiany w
warunkach kontrolnych z reakcjami w suszy
12
6. Wnioski
1. Rośliny jęczmienia jarego (Hordeum vulgare L.) syntetyzują znaczną liczbę
fenolowych metabolitów wtórnych. Wielkie zróżnicowanie międzyodmianowe
ilościowej i jakościowej zawartości tych związków świadczy o istnieniu złożonych
mechanizmów regulacyjnych ich biosyntezy, transportu i akumulacji.
2. Niektóre pochodne kwasów hydroksycynamonowych, hordatyn i flawonów
zaangażowanie są w procesy aklimatyzacji roślin do stosowanego stresu
środowiskowego.
3. Mechanizmy odpowiedzi roślin jęczmienia na deficyt wody, związane ze zmianami
zawartości związków fenolowych, zależą od ich genotypu oraz fazy rozwojowej.
4. W czasie niedoboru wody zmianom ulega zawartość glikozydów flawonów i ich
acylowanych pochodnych a także glikozydów hordatyn konstytutywnie istniejących
w tkankach oraz następuje biosynteza nowych związków, które mogą pełnić funkcje
fotoochronne i antyoksydacyjne.
5. Zwiększanie się akumulacji w liściach jęczmienia związków o właściwościach
fotoochronnych takich jak metoksylowane formy kwasów fenylopropenowych,
flawonów oraz ich koniugatów podczas niedoboru wody wskazuje na złożone reakcje
roślin na stresy abiotyczne.
6. Zastosowanie chemicznych metod analitycznych opartych na spektrometrii mas i
wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z zaawansowanymi
metodami numerycznymi i bioinformatycznymi stanowi bardzo dobre narzędzie w
poszukiwaniu markerów biologicznych odpowiedzi roślin na stresy.
1. Literatura
Ballizany W.L., Hofmann R.W., Jahufer M., Zulfiqhar Z., Barrett B.A. (2012).
Multivariate associations of flavonoid and biomass accumulation in white clover
(Trifolium repens) under drought. Functional Plant Biology, 39: 167–177
Ceoldo S., Toffali K., Mantovani S., Baldan G., Levi M., Guzzo F. (2009). Metabolomics
of Daucus carota cultured cell lines under stressing conditions reveals interactions
between phenolic compounds. Plant Science, 176: 553–565
Evans P.T., Malmberg R.L. (1989). Do polyamines have roles in plant development?
Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology, 40:235-269
Frost S., Harborne J.B., King L. (1977). Identification of the flavonoids in five chemical
races of cultivated barley. Hereditas, 85: 163-168
Grace S.C., Logan B.A., Adams W.W. (1998). Seasonal differences in foliar content of
chlorogenic acids -phenylpropanoid antioxidant in Mahonia repens. Plant, Cell and
Environment, 21: 513-521
13
He L, Jia X, Gao Z.L.R., Li R. (2011). Genotype-dependent responses of wheat (Triticum
aestivum L.) seedlings to drought, UV-B radiation and their combined stresses. Afr. J.
Biotechnol., 10: 4046–4056
Kilian J., Whitehead D., Horak J., Wanke D., Weinl S., Batistic O. (2007). The
AtGenExpress global stress expression data set: protocols, evaluation and model data
analysis of UV-B light, drought and cold stress responses. Plant Journal., 50: 347–363
Kolb C.A., Kaser M.A., Kopecky J., Zotz G., Riederer M., Pfundel E.E. (2001). Effects of
natural intensities of visible and ultraviolet radiation on epidermal ultraviolet screening
and photosynthesis in grape leaves. Plant Physiology, 127: 863-875
Lee J., Vogt T., Hause B., Lobler M. (1997). Methyl jasmonate induces an Omethyltransferase in barley. Plant Cell Physiol., 38(7): 851-862
Liu K., Fu H., Bei Q., Luan S. (2000). Inward potassium channel in guard cells as target
for polyamine regulation of stomatal movements. Plant Physiology, 124:1315-1326
Schmidt A.M., Ormond D.P., Livingston N.J., Misra S. (2000). The interaction of
ultraviolet-B radiation and water deficit in two Arabidopsis thaliana genotypes. Ann. Bot.,
85: 571–575
Schmitz-Hoerner R., Weissenböck G. (2003). Contribution of phenolic compounds to the
UV-B screening capacity of developing barley primary leaves in relation to DNA damage
and repair under elevated UV-B levels. Phytochemistry, 64(1): 243-255
Stobiecki M., Staszków A., Piasecka A., Garcia-Lopez P.M., Zamora-Natera F., Kachlicki
P. (2010). LC-MSMS profiling of flavonoid conjugates in wild Mexican lupine Lupinus
reflexus. J. Nat. Prod., 73: 1254-1260
Stochmal A., Oleszek W. (2007). Effect of acylation of flavones with hydroxycinnamic
acids on their spectral characteristics. Natural Product Communications, 2(5): 571-574
Treutter D. (2006). Significance of flavonoids in plant resistance: a review. Environ
Chem. Lett., 4:147–157
Watkinson J.I., Sioson A.A., Vasquez-Robinet C., Shukla M., Kumar D., Ellis M., Heath
L.S., Ramakrishnan N., Chevone B., Watson L.T., van Zyl L., Egertsdotter U., Sederoff
R.R., Grene R. (2003). Photosynthetic acclimation is reflected in specific patterns of gene
expression in drought-stressed loblolly pine. Plant Physiology, 133(4): 1702-1716
Watson M.B., Malmberg R.L. (1996). Regulation of Arabidopsis thaliana (L.) arginine
decarboxylase by potassium deficiency stress. Plant Physiology, 111: 1077-1083
Wojakowska A., Piasecka A., García-López P.M., Zamora-Natera F., Krajewski P.,
Marczak Ł., Kachlicki P., Stobiecki M. (2013 C). Structural analysis and profiling of
phenolic secondary metabolites of Mexican lupine species using LC-MS techniques.
Phytochemistry, DOI: 10.1016/j.phytochem.2013.04.006
14