Lakazy bakteryjne
Transkrypt
Lakazy bakteryjne
Anna Pawlik Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie Wydział Biologii i Biotechnologii, Instytut Biologii i Biochemii, Zakład Biochemii ul. Akademicka 19 20-033 Lublin [email protected] Lakazy bakteryjne Głównym narzędziem biotechnologii są enzymy, których właściwości (różnorodność katalizowanych reakcji, specyficzność działania, brak produktów ubocznych, efektywność i energooszczędność) skłaniają do przewidywania, ze już wkrótce zastąpią, w wielu przypadkach, tradycyjne katalizatory chemiczne. Szersze wykorzystanie enzymów jest jednak ciągle ograniczone głównie dostępnością i stosunkowo wysoką ich ceną. Wśród licznych biokatalizatorów, które stanowią podstawę różnorodnych zastosowań w bioprocesach biotechnologicznych lakazy reprezentują jeden z przyjaznych środowisku enzymów o niezwykłych właściwościach i wszechstronnych możliwościach aplikacyjnych. Jak dotąd, enzymy te używane są w przemyśle spożywczym, papierniczym, odzieżowym oraz nanobiotechnologii. Na szczególna uwagę zasługuje ich udział w degradacji ksenobiotyków oraz odpadów przemysłowych, klarowaniu wina, soków i piwa, produkcji kosmetyków i etanolu. W ostatnich latach duże zainteresowanie wzbudza praktyczne wykorzystanie lakaz do konstrukcji biosensorów w diagnostyce klinicznej i ochronie środowiska, bioogniw paliwowych oraz w medycynie. Lakazy (benzenodiol: tlen oksydoreduktazy, EC 1.10.3.2) stanowią zróżnicowaną grupę miedzioproteidów katalizujących utlenianie związków aromatycznych, a w szczególności substratów fenolowych.W centrum aktywnym enzymu znajdują się cztery atomy miedzi, które warunkują aktywność katalityczną lakazy. Ogromna liczba obecnie znanych i scharakteryzowanych oksydaz fenolowych pochodzi z organizmów grzybowych. Obecność enzymów o aktywności lakazy zidentyfikowano również u owadów. Stosunkowo niedawno lakazy zostały opisane u organizmów prokariotycznych, głównie jako enzymy biorące udział w pigmentacji, sporulacji, odporności na promieniowanie ultrafioletowe, nadtlenek wodoru oraz związki fenolowe wydzielane przez rośliny. Pomimo wiedzy o występowaniu lakaz bakteryjnych jak dotąd udało się w pełni scharakteryzować i oczyścić zaledwie kilka enzymów, min. pochodzących z Azospirillum lipoferum czy Bacillus subtilis. Obecnie wydajnym źródłem lakazy z biotechnologicznego punktu widzenia są organizmy grzybowe, jednak ich stosowanie limitowane jest niską aktywnością w procesach przemysłowych. Obiecujące wyniki wdrożeniowe uzyskuje się w przypadku lakaz prokariotycznych. W przeciwieństwie do lakaz grzybowych ich bakteryjne odpowiedniki wykazują unikalne, a zarazem ciekawe właściwości fizyko – chemiczne, np. wysoka termostabilność lakazy B. subtilis, czy alkaliczna pH-stabilność enzymu pochodzącego z γ-proteobakterii JB, co miałoby praktyczne zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu i pozwoliłoby na wykorzystanie enzymów bakteryjnych na szerszą skalę. Warty uwagi jest również fakt, iż bakterie cechuje duża szybkości wzrostu i łatwość hodowli w warunkach laboratoryjnych, co pozwala na uzyskanie w krótkim czasie preparatów enzymatycznych o wysokiej aktywności. Jednak ze względu na brak pełnej charakterystyki preparatów katalitycznych ich potencjał biotechnologiczny nie został w pełni wykorzystany. Ze względu na potencjalne możliwości zastosowania lakaz bakteryjnych w biotechnologii uzasadnione wydają się być badania mające na celu opracowanie metod selekcji, modyfikacji i hodowli tych mikroorganizmów pod kątem produkcji lakazy oraz pozyskania jak największych ilości aktywnego białka, a także charakterystyka uzyskanych preparatów enzymatycznych. W związku z powyższym, praca doktorska obejmuje badania screeningowe, mające na celu znalezienie szczepu bakteryjnego zdolnego do syntezy przemysłowych ilości aktywnego białka. W celu intensyfikacji syntezy enzymu zostanie przeprowadzona optymalizacja składu podłoża i warunków hodowli bakterii. Następnie w celu uzyskania wysokoaktywnych preparatów enzymatycznych zostanie opracowana metoda oczyszczania lakazy prokariotycznej. Pozwoli to na określenie właściwości biochemicznych i katalitycznych lakazy oraz jej charakterystykę molekularną, co w efekcie umożliwi ocenę przydatności biotechnologicznej enzymu. W ostatnim etapie przeprowadzona zostanie również ekspresja heterologiczna genów kodujących lakazę w innych organizmach w celu stworzenia szczepu syntetyzującego enzym o potencjalnie najwyższej wartości biotechnologicznej. Implikacją powyższej pracy jest opracowanie metody biosyntezy lakazy bakteryjnej, co pozwoli na upowszechnienie zastosowania biokatalizatorów zastępujących dotychczas stosowane w przemyśle klasyczne metody chemiczne. Analizy zaproponowane w pracy doktorskiej przyczynią się również do poszerzenia ogólnego stanu wiedzy z zakresu biochemii i genetyki prokariotycznych oksydaz fenolowych. Uzyskane wyniki staną się punktem wyjścia do dalszych badań strukturalnych i wdrożeniowych enzymu.