Ćwiczenie 9

EKSTRAKCJA DNA Z WĄTROBY METODĄ KAY’A
Porcję ok. 3 g świeżej, wychłodzonej wątroby pokroić na szalce Petriego, przenieść do zlewki o
objętości 50 ml i następnie:
1) zhomogenizować w 30 ml SSC przez 2 min. przy niskich obrotach,
2) homogenat przelać do probówki o objętości 30 ml i odwirować 5 min. przy 3500 rpm/min
3) supernatant odrzucić, osad zawiesić w 30 ml SSC, przenieść go do zlewki o obj. 50 ml
i łagodnie zhomogenizować przez 1 min.,
4) homogenat przenieść do probówki i odwirować 10 min. przy 3500 rpm/min.
5) supernatant odrzucić, uzyskany osad zawiesić w 30 ml SSC, przenieść do zlewki o obj.
50 ml i łagodnie zhomogenizować przez 30 sek.
6) do homogenatu dodać 3 ml roztworu SDS i mieszać bagietką przez 8-10 min.
w temperaturze pokojowej,
7) dodać ok. 2 g NaCl, mieszać przez 10 min. (końcowe stężenie roztworu NaCl powinno
wynosić 1 M),
8) roztwór przelać do probówki odwirować 15 minut przy 5000 rpm/min.
9) supernatant zlać do probówki 0 obj. 50 ml, a osad białkowy odrzucić,
10) do supernatantu dodać powoli schłodzonego 96% C2H5OH, powstałe nitki DNA nawinąć
na bagietkę,
Izolacja genomowego DNA przy użyciu zestawu Genomic Mini firmy A&A
Biotechnology
Zestaw przeznaczony jest do izolacji genomowego DNA z bakterii, hodowli komórkowych i
tkanek stałych. Proces oczyszczania opiera się na zdolności wiązania się DNA do złóż
krzemionkowych. Komórki i tkanki poddawane są lizie w roztworze lizującym zawierającym
sole chaotropowe i detergenty niejonowe. Dodatkowo w procesie lizy uczestniczy proteaza.
Procedura izolacji DNA:
1. Około 10-15 mg wątroby przenieść do probówki o objętość 1,5 ml i dodać: 100 µl buforu
Tris, 50 µl roztworu lizującego LT, 20 µl roztworu Proteinazy K.
2. Całość wymieszać przez worteksowanie i inkubować w temperaturze 50C, aż do
całkowitego strawienia tkanki. Próbkę mieszać od czasu do czasu przez worteksowanie.
3. Po inkubacji dodać 150 µl roztworu lizującego LT.
4. Próbkę intensywnie worteksować 20 s.
5. Wirować 3 min. przy 12 000 RPM.
6. Pobrać supernatant i nanieść na minikolumnę do oczyszczanie genomowego DNA.
7. Wirować 1 min. przy 12 000 RPM
8. Następnie dodać do kolumny 500 µl roztworu płuczącego A1.
9. Wirować 1 min przy 12 000 RMP.
10. Przenieść minikolumnę do nowej probówki 2 ml i dodać 400 µl roztworu płuczącego A1.
11. Wirować 2 min przy 12 000 RPM.
12. Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce o obj. 1,5 ml i do złoża znajdującego
się na dnie kolumny dodać 100 µl wody destylowaną uprzednio ogrzaną do temp. 75C.
13. Inkubować próbkę przez 5 min. w temperaturze pokojowej.
14. Wirować 1 min. przy 10 000 RPM.
15. Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA przechowywać w lodówce do czasu dalszych
analiz.
Ocena ilościowa i jakościowa ekstraktów DNA metodą spektrofotometryczną
Jednym ze sposobów wyznaczenia stężenia DNA i jego czystości jest pomiar absorbancji światła
UV.
Absorbancja przy 260 nm dla dwuniciowego o stężeniu 50 µg/ml wynosi 1. Stosunek wartości
absorbancji A260 do A280 świadczy o zanieczyszczeniu ekstraktów kwasów nukleinowych
białkami. Wartość współczynnika A260/A280 pomiędzy 1,8-2,0 wskazuje, iż ekstrakty DNA są
wystarczająco oczyszczone.
Przygotowanie próbki:
Wyizolowany z wątroby przy użyciu zestawu do izolacji DNA genomowy rozcieńczyć 50 krotnie
(20 µl ekstraktu + 980 µl wody).
Wykonanie:
Pomiary wykonać w kuwetach kwarcowych o drodze optycznej 10 mm. Spektrofotometr
wykalibrować na wodzie. Sporządzić widmo w zakresie 200-350 nm.
Następnie odczytać wartość absorbancji punktowo dla 260, 280 i 320 nm.
Stężenie wyizolowanego ekstraktu obliczyć wg wzoru:
C[µg/ml] = (A260 – A320)×50×rozcieńczenie
A320 – wartość absorbancji tła
Wyznaczyć czystość ekstraktu na podstawie stosunku A260/A280
Zagadnienia do przygotowania:
1. Zasady purynowe – rodzaje, numeracja atomów pierścienia purynowego.
2. Zasady pirymidynowe – rodzaje, numeracja atomów pierścienia pirymidynowego.
3. Nukleozydy – budowa, podział, nazewnictwo.
4. Nukleotydy – budowa, podział, nazewnictwo.
5. Budowa i rodzaje DNA
6. Rola DNA
7. Metody ekstrakcji DNA
Obowiązująca literatura:
1. Kwasy nukleinowe [w] Ćwiczenia z biochemii pod red. Kłyszejko-Stefanowicz L., str. 360470
2. Struktura i funkcja kwasów nukleinowych [w] Biochemia Harpera, str. 443-455
3. Nukleotydy [w] Bańkowski E. Biochemia, Podręcznik dla studentów uczelni medycznych,
str. 386-394
4. Kwasy nukleinowe, [w] Bańkowski E. Biochemia, Podręcznik dla studentów uczelni
medycznych,str. 422-442
5. Chemiczne właściwości DNA i RNA [w] Kędryna T., Gałka-Walczak M., Ostrowska B.
Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej z ćwiczeniami, str. 321-346.