Stimulation of TNF-a production by 2-(1-adamantylamino)

Adam Master
1,
Karolina Świtaj
2,
Magdalena Skrzypczak
1,
Piotr Zaborowski
2,
Andrzej Płucienniczak
1
Diagnostyka genetyczna Toxoplasma gondii
mgr Adam Master, mgr Magdalena Skrzypczak, prof. dr hab. Andrzej Płucienniczak
1-Instytut Badań DNA, Warszawa, ul. Rakowiecka 36, tel. (022) 606 36 18, [email protected]
lek. Karolina Świtaj, prof. dr hab. med. Piotr Zaborowski
2- Klinika Chorób Odzwierzęcych i Tropikalnych Instytutu Chorób Zakaźnych Akademii Medycznej
w Warszawie, ul. Wolska 37, tel. (022) 632 06 84, [email protected]
Streszczenie
Materiał i metody
Toksoplazmoza jest chorobą wywoływaną przez pierwotniaka Toxoplasma gondii, bezwzględnego pasożyta
wewnątrzkomórkowego powszechnie zarażającego wiele ssaków w tym ludzi. W Polsce zarażeni stanowią
ponad 59% populacji, a każdego roku odnotowuje się 200-400 przypadków toksoplazmozy wrodzonej. Jak
dotąd nie ma wystandaryzowanej procedury szybkiego i pewnego wykrywania zarażeń T. gondii. Autorzy
niniejszego doniesienia prezentują metodę genetycznej diagnostyki zarażeń poprzez wykrywanie i analizę
DNA pasożyta izolowanego bezpośrednio z krwi pacjenta. W badaniach zastosowano techniką PCR
w połączeniu z elektroforezą kapilarną i laserową detekcją fluorescencji. Identyfikacja pasożyta oparta jest
na wykrywaniu sekwencji wielokopijnych: genu B1 (35 kopii/genom) oraz sekwencji 529 pz (200-300
kopii/genom), wysoce specyficznych dla T. gondii. Szczegółowa charakterystyka pasożyta bazuje na analizie
genetycznej fragmentów genu GRA6 (jednokopiowy gen kodujący antygen gęstej ziarnistości wydzielanej
przez pasożyta odpowiedzialnej za przeżycie pasożyta wewnątrz komórki), HSP70 (jednokopiowy gen,
kodujący białko należące do rodziny białek szoku cieplnego o średniej masie molekularnej 68-78 kDa) oraz
wybranych sekwencji STR, wykazujących polimorfizm determinujący przynależność do określonego
szczepu. Metodę przetestowano na próbkach kontrolnych: zawiesiny płynu otrzewnowego pobranego
od myszy zarażonych szczepem RH T. gondii (kontrola pozytywna) oraz wymazu z jamy ustnej niemowlęcia,
u którego matki nie stwierdzono obecności przeciwciał przeciwko pasożytowi (kontrola negatywna).
W kontroli pozytywnej wykryto produkty o oczekiwanych długościach, charakterystycznych dla sekwencji B1
oraz 529 pz, natomiast analiza produktów PCR ze starterami specyficznymi dla GRA6 i HSP70 wykazała
obecność fragmentów o długościach charakterystycznych dla szczepu RH. W próbce kontroli negatywnej nie
wykryto żadnych produktów PCR. Próg wykrywalności DNA pasożyta oszacowano na 1/10 ekwiwalentu
genomowego. Wstępne badania próbek pełnej krwi obwodowej pacjentów z oczną postacią toksoplazmozy
w okresie reaktywacji choroby wykazały obecność DNA pasożyta. Uzyskane wyniki świadczą o przydatności
metody do wczesnej, szybkiej, swoistej, czułej i jednoznacznej diagnostyki zarażeń wywoływanych przez
T. gondii i jej potencjalnym szerokim zastosowaniu w medycynie i weterynarii nie tylko w zwalczaniu, ale
i badaniach przesiewowych.
Materiał: płyn otrzewnowy myszy zarażonych szczepem RH T.gondii (kontrola pozytywna),
nabłonek jamy ustnej niemowlęcia niezarażonego T. gondii (kontrola negatywna), krew
obwodowa pacjentów z aktywną postacią oczną zarażenia T.gondii.
Metody: Izolacja materiału genetycznego na złożach krzemionkowych w wysokim stężeniu soli
chaotropowych. Amplifikacja wybranych fragmentów genomu T.gondii wybranych spośród
sekwencji genu B1, sekwencji 529, genu GRA6 oraz HSP70 w PCR z udziałem specyficznych
starterów znakowanych fluorescencyjnie. Elektroforeza kapilarna i laserowa detekcja produktów
przy użyciu sekwenatora.
Identyfikator wg NCBI Oznaczenie starterów
Długość produktu
(p.z.)
Znacznik
fluorescencyjny
Kolor linii
barwnikowej
AF179871
B1
349
6-FAM
Niebieski
AF146527
529A
175
6-FAM
Niebieski
AF146527
529B
221
TET
Zielony
L33814
GRA 6
230 (szczep RH)
6-FAM
Niebieski
U85648
HSP 70
173 (szczep RH)
TET
Zielony
W35487
M1 (EST)
104
6-FAM
Niebieski
AY572691
M2 (myosin A)
123
6-FAM
Niebieski
M20025
M3 (tubulin beta)
128
TET
Zielony
AA519150
M4 (EST)
144
6-FAM
Niebieski
Kot-żywiciel ostatecznyToxoplasma gondii
Elektroforetogram badanych fragmentów DNA Toxoplasma gondii
-wykrywanie oraz oznaczanie szczepu Toxoplasma gondii, z wykorzystaniem techniki PCR oraz znakowanych fluorescencyjnie starterów.
Wykrywanie Toxoplasma gondii
Oznaczanie szczepu Toxoplasma gondii
Elektroforetogramy znakowanych fluorescencyjnie fragmentów genu B1 i sekwencji 529
Toxoplasma gondii
Elektroforetogram znakowanych fluorescencyjnie fragmentów genów GRA6 i HSP70
oraz sekwencji mikrosatelitarnych (M1, M2, M3 i M4) Toxoplasma gondii
Cysta z bradyzoitami
i tachyzoity T. gondii.
(Zmodyfikowano na podstawie:
http://www.ufrgs.br/para-site/Imagensatlas/Protozoa/Toxoplasma.htm)
Tachyzoity T. gondii z płynu
otrzewnowego zarażonych myszy
(Zmodyfikowano na podstawie:
http://www.ufrgs.br/para-site/Imagensatlas/Protozoa/Toxoplasma.htm)
Obraz dna oka
w toksoplazmozie ocznej
Tachyzoity T. gondii w porównaniu z
elementami morfotycznymi krwi.
(Zmodyfikowano na podstawie:
http://www.escelsanet.com.br/sitesaude/artigos_cadastrados/artigo.asp?art=204)
(Zmodyfikowano na podstawie: http://www.ulb.ac.be/sciences/biodic/ImProto0002.html)
Wykrywanie Toxoplasma gondii
we krwi obwodowej pacjentów
Wyznaczanie dolnej granicy wykrywalności DNA Toxoplasma gondii, z wykorzystaniem
starterów flankujących fragment genu B1 –elektroforetogramy produktów PCR,
uzyskanych z szeregu rozcieńczeń DNA pasożyta
Elektroforetogram fragmentu genu B1 Toxoplasma gondii,
wyizolowanego z krwi obwodowej pacjentów z reaktywacją postaci
ocznej toksoplazmozy
Wnioski
1. W
badanej
hodowli
Toxoplasma
potwierdzono obecność szczepu RH.
gondii
2. Metoda oparta na amplifikacji wielokopijnego
genu B1 umożliwia wykrycie DNA w ilości 1/10
ekwiwalentu genomowego Toxoplasma gondii.
3. Uzyskane wyniki wskazują na możliwość
zastosowania metody w szybkiej i czułej
diagnostyce zarażeń Toxoplasma gondii w
medycynie i weterynarii.
Podziękowania
Dziękujemy panu dr Piotrowi Borkowskiemu za pośrednictwo w kontakcie z pacjentami z toksoplazmozą oczną.
Dziękujemy również kierownictwu oraz pracownikom Instytutu Badań DNA za finansowanie prac i pomoc w realizacji projektu.