Streszczenie

Streszczenie
Nasienie knura różni się wieloma parametrami makro- i mikroskopowymi od nasienia
innych gatunków zwierząt. Wiąże się to z koniecznością przechowywania go do celów
inseminacyjnych w postaci niezamrożonej. Jednakże, przechowywane w temperaturze
15 – 17ºC nasienie zachowuje zdolności zapładniające zaledwie przez kilka dni (1 – 5)
z powodu postępującej degradacji plemników będącej wynikiem niekorzystnie działających
czynników środowiska zewnętrznego.
Celem pracy było opracowanie metody wytwarzania stabilnego, antyoksydacyjnego
preparatu enzymatycznego przeznaczonego do przedłużania zdolności zapładniających
plemników nasienia knura przechowywanego w stanie niezamrożonym.
Materiałem do badań był czosnek jadalny (Allium sativum L.), z którego wyizolowano
roślinną dysmutazę ponadtlenkową, enzymy pochodzenia zwierzęcego - SOD z erytrocytów
wołowych i katalazę (CAT) wątroby wołowej, które zastosowano w procesie tworzenia
koniugatów enzymatycznych oraz plemniki do testów biologicznych pobrane od knurów rasy
PBZ (Polska Biała Zwisłoucha).
Roślinna SOD, tanio i wydajnie wyizolowana z czosnku, występuje w postaci
aktywnego monomeru o masie molekularnej około 14 kDa. Zastosowanie dwuetapowego
oczyszczania pozwoliło uzyskać jednorodny preparat zawierający 4-krotnie oczyszczony
enzym o aktywności 3101 USOD/mg białka. W przypadku katalazy dwuetapowe oczyszczanie
pozwala uzyskać
jednorodny preparat,
1,65-
krotnie oczyszczony o
aktywności
9330 UCAT/mg. Katalaza ma masę molekularną około 125 kDa i jest aktywnym dimerem.
Proces tworzenia koniugatu CAT i SOD przeprowadzono przy użyciu aldehydu
dekstranu (AD). Otrzymaną mieszaninę produktów CAT-AD-SOD frakcjonowano na sicie
molekularnym. Obecność białka oraz obu aktywności enzymatycznych w tej samej frakcji
potwierdzały obecność koniugatu. W koniugatach CAT i SOD łączyły się ze sobą
w zmiennym stosunku molowym leżącym w granicach od 0,08 do 1,00. Najliczniejszą grupę
połączeń stanowiły związki, w których na dwa monomery katalazy przypadał jeden monomer
dysmutazy ponadtlenkowej i koniugaty, w których na jeden monomer katalazy przypadał
jeden monomer dysmutazy.
Wolne enzymy CAT i SOD oraz ich koniugaty CAT-AD-SOD zamykano
w strukturach liposomowych zbudowanych z lecytyny i cholesterolu (Lec/Chol). Najlepszą
wydajność zamykania białka w strukturze liposomów Lec/Chol uzyskano dla liposomów
z większą zawartością cholesterolu (Lec/Chol 6:4, mol/mol), formowanych w roztworze
o większej zawartości białka (5 mg/ml) przy zastosowaniu procedury FAT-MLV-VET400 nm.
We wszystkich przypadkach enzymy pozostawały aktywne. Tak otrzymane enzymosomy,
przechowywane w temperaturze 4°C, pozostawały stabilne przez co najmniej 2 miesiące.
Do zbadania skuteczności działania antyoksydacyjnego wykonanych enzymosomów
wybrano nasienie knura, pobierane rutynowo do inseminacji, które w odróżnieniu od nasienia
innych gatunków, z powodu dużej wrażliwości na niskie temperatury nie może być
przechowywane w stanie zamrożonym. Do 1 ml nasienia zawieszonego w rozrzedzalniku
dodawano taką ilość enzymosomów, która odpowiadała aktywności 200 UCAT, 150 USOD
i w przypadku koniugatu 200/150 UCAT/USOD. Tak przygotowane próby były przechowywane
w temperaturze 17°C przez 12 dni. Po zakończeniu 4., 8. i 12. dnia inkubacji w każdej próbie
mierzono aktywność oddechową plemników przy pomocy elektrody tlenowej Clark’a.
Uzyskane wyniki potwierdziły negatywny wpływ czasu na aktywność aparatu ruchu
plemników knura przechowywanych przez 12 dni, i wykazały, że zmiany te należy wiązać
z procesem utraty integralności wewnętrznej błony mitochondriów wstawki plemników.
Wzbogacenie rozrzedzalnika enzymosomami zawierającymi koniugat katalazy
i dysmutazy ponadtlenkowej zabezpiecza plemniki przed uszkodzeniem ich aparatu ruchu, nie
ograniczając jednocześnie aktywności enzymów mitochondrialnego systemu transportu
elektronów.