COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0

Transkrypt

COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR®
HCV Test, version 2.0
PCX
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
Informacje dotyczące zamawiania
COBAS® AmpliPrep/
COBAS® AMPLICOR®
HCV Test, v2.0
COBAS® AmpliPrep System
Wash Reagent
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
PCX
96 Tests
P/N: 03576698 190
PWR
4 Liters
P/N: 03309380 123
500 Tests
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
Przeznaczenie
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® Hepatitis C Virus (HCV),
wersja 2.0 (v2.0) jest jakościowym testem in vitro, który umożliwia wykrycie RNA
wirusa zapalenia wątroby typu C w ludzkiej surowicy i osoczu za pomocą aparatu
COBAS® AmpliPrep, przeznaczonego do obróbki próbki, oraz analizatora COBAS®
AMPLICOR®, służącego do amplifikacji i detekcji. Obecność HCV RNA świadczy
o aktualnym zakażeniu HCV u chorych wykazujących kliniczne i/lub biochemiczne
cechy choroby wątroby. W tym teście wykorzystuje się odwrotną transkrypcję
docelowego RNA do generacji komplementarnego DNA (cDNA), amplifikację
docelowego cDNA na drodze reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR – Polymerase
Chain Reaction) oraz hybrydyzację kwasu nukleinowego do detekcji HCV RNA
w surowicy lub osoczu ludzkim.
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, nie jest
przeznaczony do badań przesiewowych krwi lub produktów krwiopochodnych na
obecność wirusa zapalenia wątroby typu C.
Na całym świecie wirusem wirusowego zapalenia wątroby typu C (Hepatitis C
Virus) jest zakażonych 170 milionów ludzi. Zakażenie tym wirusem opisano jako
zakażenie pandemiczne; częstość jego występowania jest pięciokrotnie większa niż
częstość zakażenia wirusem HIV-11. HCV to wirus zawierający pojedynczy
łańcuch sensowny RNA, którego genom zawiera około 10 000 nukleotydów
kodujących 3000 aminokwasów2. Jako wirus występujący we krwi, HCV może być
przenoszony przez krew i produkty krwiopochodne. Powszechnie przyjęte badania
przesiewowe krwi w kierunku obecności wirusa HCV doprowadziły do znacznego
obniżenia ryzyka zapalenia wątroby związanego z transfuzjami. Największa
częstość zakażeń wirusem HCV występuje w związku z nadużywaniem
01/2012, Revision 7.0
COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV Test, v2.0
1/48
P/N: 05230306 190
Podsumowanie i objaśnienie testu
narkotyków dożylnych oraz – w mniejszym stopniu – z innymi rodzajami
przezskórnej ekspozycji4. Ogólnoświatowa częstość występowania zakażenia HCV,
ustalonego za pomocą badania immunoserologicznego, waha się w granicach
6–28% w Egipcie, 1,8% w USA1 oraz 1,1–1,2% we Francji3. Od 75% do 80%
pacjentów serododatnich jest także w wiremii1,3.
Z uwagi na obecność przeciwciał anty-HCV u pacjentów zakażonych HCV
opracowano testy immunoserologiczne swoiste dla tych przeciwciał4,5.
Wprowadzenie tego typu testów zmniejszyło na całym świecie częstość
występowania poprzetoczeniowego zapalenia wątroby. Dodatkowe oznaczenia
uzupełniające w celu dokładniejszej oceny próbek, które wielokrotnie wykazywały
pozytywny wynik w teście przesiewowym dla przeciwciał, wykonywano przy
użyciu testu typu RIBA (recombinant immunoblot assay). Niedawne doniesienia
wskazują, że interpretacja tego dodatkowego badania jest zależna od grupy ryzyka
danego pacjenta. Na przykład w populacji dawców krwi niskiego ryzyka zakażenie
potwierdza się przy użyciu testu HCV RNA tylko w 50% próbek reaktywnych
w badaniu RIBA6,7,8. Zatem dodatni wynik testu RIBA nie stanowi rzeczywistego
wskaźnika aktywnej infekcji HCV, ponieważ chorzy po przebytym wirusowym
zapaleniu wątroby typu C mogą przez wiele lat wykazywać dodatni wynik testu
anty-HCV5. Ponadto obserwuje się nieokreślone wyniki dodatkowych testów
zarówno u osób niedawno zakażonych, będących w fazie serokonwersji, jak i u osób
z przewlekłym zakażeniem HCV9,10.
Badanie immunoserologiczne świadczy o aktualnej i/lub wcześniejszej ekspozycji
na zakażenie HCV, ale nie jest w stanie rozróżnić tych dwóch przypadków. W chwili
obecnej nie istnieje test immunologiczny pozwalający na bezpośrednie wykrywanie
antygenu wirusa HCV. Co więcej, w przypadkach ostrego zakażenia HCV chorzy
mogą nie wytworzyć przeciwciał skierowanych przeciwko HCV11, co uniemożliwia
rozpoznanie aktualnego zakażenia HCV przy użyciu metod immunoserologicznych.
Ewentualnie wykrycie HCV RNA przy użyciu testów oznaczających kwas
nukleinowy może dostarczyć dowodów aktualnie trwającego zakażenia. Przy
zastosowaniu testów na kwasy nukleinowe możliwe jest wykrycie wiremii HCV
jeszcze przed serokonwersją immunologiczną12,13. Testy badające kwasy
nukleinowe są zdolne do wykrywania HCV RNA bezpośrednio, tj. niezależnie od
stanu immunologicznego pacjenta, dlatego test badający kwasy nukleinowe jest
przydatny w wykrywaniu HCV RNA u pacjentów z upośledzoną odpornością8.
Zasady procedury
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® Hepatitis C Virus (HCV),
wersja 2.0 (v2.0) jest testem pozwalającym na amplifikację kwasów nukleinowych,
umożliwiającym wykrycie RNA wirusa zapalenia wątroby typu C w ludzkim osoczu
lub surowicy. Przygotowanie próbki zostało zautomatyzowane dzięki zastosowaniu
aparatu COBAS® AmpliPrep, natomiast automatyczna amplifikacja i detekcja jest
możliwa dzięki analizatorowi COBAS® AMPLICOR®.
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, jest oparty na pięciu
głównych procesach: przygotowania próbki w celu uzyskania HCV RNA; odwrotnej
transkrypcji badanego RNA w celu wytworzenia komplementarnego DNA (cDNA)1;
amplifikacji PCR1 badanego cDNA przy użyciu swoistych odcinków startowych
(primerów) komplementarnych dla HCV; hybrydyzacji amplifikowanych produktów
z oligonukleotydowymi sondami swoistymi dla badanego materiału oraz wykrywania
amplifikowanych produktów związanych z sondami przy użyciu pomiarów
kolorymetrycznych.
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, pozwala na
automatyczne przygotowanie próbki, po którym następuje automatyczna odwrotna
transkrypcja, amplifikacja PCR, hybrydyzacja oraz detekcja docelowego HCV RNA
i RNA wewnętrznej kontroli HCV. Odczynnik Master Mix zawiera parę primerów
swoistych zarówno dla HCV RNA jak i RNA z HCV Internal Control. Amplifikowany
DNA oznacza się przy użyciu oligonukleotydowych sond swoistych dla badanego
materiału, pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu zarówno HCV jak
i HCV Internal Control. Detekcja zamplifikowanego DNA kontroli wewnętrznej HCV
Internal Control jest opcjonalna i zależna od użytkownika.
2/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Wybór docelowej
sekwencji
Wybór docelowej sekwencji RNA dla HCV zależy od identyfikacji regionów, w których
genom HCV ma największą konserwatywność sekwencji dla wielu różnych
genotypów HCV14–17. Podczas przygotowywania próbki używa się różnych oligonukleotydów, aby wychwycić HCV RNA i RNA wewnętrznej kontroli HCV. Różne
oligonukleotydy są również stosowane zarówno jako primery w odwrotnej transkrypcji
i amplifikacji HCV RNA i RNA wewnętrznej kontroli HCV, jak i podczas detekcji
w celu zidentyfikowania amplikonu powstałego przez amplifikację przepisanego
w odwrotnej transkrypcji HCV RNA i RNA wewnętrznej kontroli HCV.
Zgodnie z tym właściwy wybór sondy przygotowawczej, odcinków primerowych
oraz sondy wykrywającej ma kluczowe znaczenie dla zdolności pozyskania
i detekcji wszystkich genotypów HCV w niniejszym teście. Region 5' nieulegający
translacji (5'-untranslated region – UTR) genomu HCV ma największą
konserwatywność sekwencji RNA dla wszystkich znanych genotypów HCV18,19.
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, wykorzystuje
biotynylowaną sondę przygotowawczą, ST101BP, aby wychwycić RNA podczas
przygotowywania próbki. Primery KY78 i KY80 określają sekwencję
244 nukleotydów w obrębie wysoce konserwatywnego regionu 5'-UTR genomu
HCV, umożliwiając odwrotną transkrypcję i amplifikację PCR13. Sekwencja sondy
przygotowawczej ST101BP leży poza regionem amplifikacji i jest usytuowana
w najbardziej konserwatywnej domenie w obrębie regionu 5'-UTR19.
Przygotowanie próbki
Odwrotna transkrypcja
oraz amplifikacja PCR
W teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, przygotowanie
próbki odbywa się automatycznie w aparacie COBAS® AmpliPrep przy
zastosowaniu metod wychwytywania DNA za pomocą sondy. W aparacie COBAS®
AmpliPrep wykorzystuje się podwyższoną temperaturę i środek chaotropowy, aby
oddzielić HCV RNA od innych cząstek wirusa i aby chronić RNA przed działaniem
RNaz w osoczu lub surowicy. Z odczynnikiem lizującym i odczynnikiem
zawierającym biotynylowaną sondę przygotowawczą wprowadza się do każdej
próbki znaną liczbę cząsteczek RNA kontroli wewnętrznej HCV. Temperatura ulega
następnie obniżeniu, aby umożliwić hybrydyzację HCV RNA i RNA kontroli
wewnętrznej HCV z biotynylowaną sondą przygotowawczą ST101BP. Kompleksy,
które uległy hybrydyzacji: ST101BP:HCV RNA i ST101BP:RNA wewnętrznej
kontroli HCV, wiążą się następnie z cząsteczkami magnetycznymi opłaszczonymi
streptawidyną. Aparat COBAS® AmpliPrep oddziela opłaszczone streptawidyną
cząsteczki magnetyczne ze związanym RNA od reszty mieszaniny reakcyjnej
i przepłukuje cząsteczki magnetyczne przed ponownym zawieszeniem poddanej
obróbce próbki w roztworze. Poddana obróbce próbka, zawierająca cząsteczki
magnetyczne opłaszczone steptawidyną ze związanym HCV RNA i RNA
wewnętrznej kontroli HCV, jest dodawana do mieszaniny amplifikacyjnej.
Następnie docelowy HCV RNA oraz RNA wewnętrznej kontroli HCV zostają
poddane odwrotnej transkrypcji, amplifikacji i detekcji w analizatorze COBAS®
AMPLICOR® za pomocą odczynników do amplifikacji i detekcji dostarczanych
wraz z zestawem testowym.
Odwrotna trankrypcja
Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji są przeprowadzane przy użyciu
polimerazy DNA (rTth pol), termostabilnego enzymu rekombinowanego
pochodzącego z bakterii Thermus thermophilus. W obecności jonów manganu (Mn2+)
i odpowiedniego buforu rTth pol ma aktywność zarówno odwrotnej transkryptazy, jak
i polimerazy DNA1. Pozwala to na zachodzenie reakcji odwrotnej transkrypcji
i amplifikacji PCR w tej samej mieszaninie reakcyjnej.
Przygotowane próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej znajdującej się
w probówkach amplifikacyjnych (probówkach A), w których zachodzi zarówno
odwrotna transkrypcja, jak i amplifikacja metodą PCR. Primer antysensowny (KY78)
jest biotynylowany w końcu 5'; primer sensowny (KY80) nie jest biotynylowany.
Mieszaninę reakcyjną podgrzewa się, aby umożliwić primerowi antysensownemu
swoiste związanie się z docelowym RNA HCV oraz docelowym RNA HCV Internal
Control. W obecności Mn2+ i nadmiaru trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów
(deoxynucleoside triphosphates – dNTP), włączając trifosforany dezoksyadenozyny,
dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny (zamiast tymidyny), rTth pol
wydłuża wtopiony primer formując łańcuch DNA (cDNA) komplementarny do
docelowego RNA.
01/2012, Revision 7.0
3/48
Amplifikacja sekwencji docelowej
Po odwrotnej transkrypcji docelowego HCV RNA oraz kontroli wewnętrznej HCV
RNA mieszanina reakcyjna jest ogrzewana w celu denaturacji hybryd RNA:cDNA
oraz ekspozycji sekwencji docelowych dla primerów. Po ochłodzeniu mieszaniny
i swoistym związaniu primera sensownego (KY80) z nicią cDNA rTth pol wydłuża
primer, syntetyzując drugą nić DNA. Kończy to pierwszy cykl reakcji PCR, dającej
kopię regionu docelowego HCV RNA oraz RNA kontroli wewnętrznej HCV
w postaci podwójnego łańcucha DNA. Mieszanina reakcyjna jest po raz kolejny
podgrzewana w celu rozdzielenia powstałego dwuniciowego DNA i odsłonięcia
sekwencji docelowych primerów. W miarę stygnięcia mieszaniny primery KY78
i KY80 przyłączają się do docelowego DNA. Polimeraza rTth pol w obecności Mn2+
oraz nadmiaru dNTPs wydłuża przyłączone primery wzdłuż docelowych wzorców
w celu wytworzenia cząsteczki dwuniciowego DNA zawierającej 244 pary zasad,
zwanej amplikonem. Analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie powtarza
powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich skutecznie
podwajając ilość DNA amplikonu. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana
w analizatorze COBAS® AMPLICOR®. Amplifikacja zachodzi jedynie w obszarze
genomu HCV między primerami; całość genomu nie ulega amplifikacji.
Amplifikacja kontroli wewnętrznej
W procesach amplifikacji wykorzystujących enzymy, takich jak PCR, zawartość
w badanych próbkach pewnych inhibitorów może skutkować zmniejszoną
wydajnością amplifikacji. Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR®
HCV, v2.0, uzupełniono o kontrolę wewnętrzną HCV, aby umożliwić identyfikację
poddanych obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać
amplifikację PCR. HCV Internal Control jest transkryptem RNA zawierającym obszar
wiązania primerów identyczny z badaną sekwencją HCV, losową wewnętrzną
sekwencję o długości i składzie zasad podobnej do badanej sekwencji HCV oraz
unikalny obszar wiązania primerów, który odróżnia HCV Internal Control od
badanego amplikonu. Cechy te wybrano, aby zapewnić równoważną amplifikację
kontroli wewnętrznej HCV oraz docelowego RNA HCV. RNA z kontroli wewnętrznej
HCV, wprowadzany do każdej próbki wraz z odczynnikiem lizującym, służy jako
kontrola ekstrakcji i amplifikacji dla każdej indywidualnie przygotowywanej próbki.
Amplifikacja wybiórcza
W teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, amplifikację
wybiórczą docelowego kwasu nukleinowego z próbki osiąga się dzięki zastosowaniu
enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) i trifosforanu dezoksyurydyny (dUTP).
Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających
dezoksyurydynę20, lecz nie łańcuchów DNA zawierających dezoksytymidynę.
Dezoksyurydyna nie jest obecna w występującym w naturze DNA, lecz jest zawsze
obecna w amplikonie z uwagi na użycie trójfosforanu dezoksyurydyny w miejsce
trójfosforanu tymidyny jako jednego z dNTPs w odczynniku Master Mix. Dlatego
tylko amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość
zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed
amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase zawarty w odczynniku Master
Mix katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt
dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1.
Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym w pH zasadowym odczynnika
Master Mix łańcuch amplikonu DNA pęka w pozycji dezoksyurydyny, w ten sposób
wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny
w temperaturach powyżej 55°C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego,
dlatego nie niszczy on amplikonu docelowego. Po amplifikacji każdy resztkowy
enzym jest denaturowany przez dodanie roztworu denaturującego (Denaturation
Solution). W ten sposób zapobiega się degradacji dowolnego amplikonu docelowego.
W przypadku testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0,
wykazano, że enzym AmpErase inaktywuje co najmniej 103 kopii amplikonu HCV
zawierającego dezoksyurydynę w przeliczeniu na jedną reakcję PCR.
4/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Reakcja hybrydyzacji
Po amplifikacji PCR analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie dodaje
roztwór denaturujący do probówek A w celu chemicznej denaturacji amplikonu
HCV oraz amplikonu kontroli wewnętrznej HCV i uzyskania jednoniciowego
DNA. Próbki zdenaturowanego amplikonu przenosi się następnie do naczynek D
używanych do oznaczeń. Do poszczególnych naczynek D dodaje się zawiesiny
magnetycznych cząsteczek pokrytych sondą oligonukleotydową swoistą dla
amplikonu HCV (KY150) lub amplikonu kontroli wewnętrznej HCV (SK535).
Znakowane biotyną amplikony HCV i kontroli wewnętrznej HCV ulegają
hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału sondami oligonukleotydowymi
związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Hybrydyzacja amplikonów ze swoistą
dla badanego materiału sondą zwiększa ogólną swoistość testu.
Reakcja detekcji
Bezpośrednio po reakcji hybrydyzacji analizator COBAS® AMPLICOR®
przepłukuje cząsteczki magnetyczne w naczynku D w celu usunięcia niezwiązanego
materiału, a następnie dodaje koniugat peroksydaza chrzanowa-awidyna. Koniugat
peroksydazy chrzanowej z awidyną wiąże się ze znakowanymi biotyną amplikonami,
które uległy hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału sondami
oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Analizator
COBAS® AMPLICOR® usuwa niezwiązany kompleks, płucząc cząsteczki
magnetyczne, a następnie do każdego naczynka D dodaje roztwór substratów
zawierający nadtlenek wodoru oraz 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB).
W obecności nadtlenku wodoru peroksydaza chrzanowa związana z cząsteczkami
katalizuje utlenianie TMB, tworząc barwny kompleks, którego absorbancję mierzy
analizator COBAS® AMPLICOR® przy długości fali 660 nm.
Odczynniki
PCX
COBAS® AmpliPrep/
®
®
COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0
96 testów P/N: 03576698 190
Odczynniki do przygotowywania próbki i odczynniki kontrolne
HCV CS1, v2.0
2 x 48 testów
(kaseta do oznaczeń HCV z odczynnikiem zawierającym
cząsteczki paramagnetyczne, wersja 2.0)
bufor fosforanu sodu
chlorek sodu
< 5% zawiesiny cząsteczek Dynabeads® (o właściwościach
paramagnetycznych) opłaszczonych streptawidyną
< 0,05% detergentu
0,09% azydku sodu
HCV CS2, v2.0
2 x 48 testów
(kaseta do oznaczeń HCV z odczynnikiem lizującym, wersja 2.0)
bufor Tris-HCl
44% tiocyjanianu guanidyny
2,5% ditiotreitolu
< 10% glikolu polietylenowego
< 0,5% detergentu
44% (udział wagowy) tiocyjanianu guanidyny
+
Xn
Produkt szkodliwy
01/2012, Revision 7.0
5/48
HCV CS3, v2.0
1 x 96 testów
Kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń HCV, zawierająca:
HCV PROBE, v2.0
1 x 4,8 ml
(odczynnik zawierający sondę do detekcji HCV, wersja 2.0)
bufor Tris-HCl
< 0,001% swoistej dla HCV oligonukleotydowej sondy
przygotowawczej ST101BP
EDTA
0,09% azydku sodu
HCV IC, v2.0
1 x 4,8 ml
(kontrola wewnętrzna HCV, wersja 2.0)
bufor Tris-HCl
< 0,001% kwasu aurintrikarboksylowego
< 0,001% niezakaźnego RNA (bakteryjnego), transkrybowanego in
vitro, zawierającego przygotowawczą sondę dla HCV, sekwencje
wiążące primery dla HCV oraz swoisty region wiążący sondę
wykrywającą
< 0,005% poly rA RNA (syntetycznego)
EDTA
0,09% azydku sodu
HCV DIL, v2.0
(rozcieńczalnik próbki HCV, wersja 2.0)
bufor Tris-HCl
< 0,001% kwasu aurintrikarboksylowego
< 0,005% biotyny
< 0,005% poly rA RNA (syntetycznego)
EDTA
0,09% azydku sodu
1 x 7,2 ml
HCV (+) C, v2.0
8 x 0,9 ml
(kontrola dodatnia HCV, wersja 2.0)
< 0,001% konstruktu Armored RNA® zawierającego sekwencje HCV
(niezakaźnego RNA obecnego w bakteriofagu MS2)
Osocze ludzkie dające wynik ujemny, niereaktywne w testach
licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwciał
przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu
HIV p24 oraz antygenu HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA
i HBV DNA, niewykrywalnych przy użyciu metod PCR.
0,1% substancji konserwującej ProClin® 300
CAP (–) C
8 x 0,9 ml
[COBAS® AmpliPrep ujemna próba kontrolna (osocze ludzkie)]
Osocze ludzkie dające wynik ujemny, niereaktywne w testach
licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwciał
przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu
HIV p24 oraz antygenu HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA
i HBV DNA, niewykrywalnych przy użyciu metod PCR.
6/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Odczynniki do amplifikacji i detekcji
HCV MMX, v2.0
8 x 0,7 ml
(główny rozcieńczalnik HCV Master Mix, wersja 2.0)
Bufor Bicine
16% DMSO
glicerol
< 0,01% polimerazy DNA rTth (rTth pol, bakteryjna)
octan potasu
< 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0,005% primerów KY78 i KY80 (KY78 jest biotynylowany)
< 0,01% enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) (bakteryjnego)
0,05% azydku sodu
HCV Mn2+, v2.0
(roztwór manganu HCV, wersja 2.0)
< 2% manganu
kwas octowy
barwnik amarantowy
0,05% azydku sodu
8 x 0,1 ml
CX PS1, v2.0
1 x 100 testów
(zawiesina 1 sondy HCV, wersja 2.0)
bufor MES
< 0,4% zawiesiny cząsteczek Dynabeads (o właściwościach
paramagnetycznych) pokrytych oligonukleotydową sondą
wychwytującą, swoistą dla HCV (KY150)
0,09% azydku sodu
CX4, v2.0
< 0,2% substancji ułatwiającej rozpuszczalność
42,2% tiocyjanianu sodu
42,2% (udział wagowy) tiocyjanianu sodu
+
Xn
1 x 100 testów
Produkt szkodliwy
IC PS1
1 x 100 testów
(zawiesina sondy dla kontroli wewnętrznej nr 1)
bufor MES
< 0,4% zawiesiny cząsteczek Dynabeads (o właściwościach
paramagnetycznych) pokrytych oligonukleotydową sondą
wychwytującą SK535, swoistą dla kontroli wewnętrznej
0,09% azydku sodu
IC4
< 0,2% substancji ułatwiającej rozpuszczalność
24,9% tiocyjanianu sodu
01/2012, Revision 7.0
1 x 100 testów
7/48
1 x 100 testów
DN4
(roztwór denaturujący)
1,6% wodorotlenku sodu
EDTA
błękit tymolowy
1,6% (udział wagowy) wodorotlenku sodu
+
Xi
Produkt drażniący
CN4
3 x 100 testów
(koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej)
bufor Tris-HCl
< 0,001% koniugatu awidyny i peroksydazy chrzanowej
surowicza albumina bydlęca (ssacza)
Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)
0,1% fenolu
1% substancji konserwującej ProClin® 150
SB3
(substrat A)
roztwór cytrynianu
0,01% nadtlenku wodoru
5 x 75 testów
SB
(substrat B)
0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB)
40% dimetyloformamidu (DMF)
5 x 5 ml
T
40% (udział wagowy) dimetyloformamidu (DMF)
Produkt toksyczny
R: 61-20/21-36
Może działać szkodliwie na dziecko
w łonie matki. Działa szkodliwie
przez drogi oddechowe i w kontakcie
ze skórą. Działa drażniąco na oczy.
S: 53-45
Unikać narażenia – przed użyciem
zapoznać się z instrukcją. W razie
awarii lub złego samopoczucia
niezwłocznie zasięgnij porady lekarza
– jeżeli to możliwe, pokaż etykietę.
4 litry
PWR
Wash Reagent
Odczynnik płuczący COBAS® AmpliPrep System
P/N: 03309380 123
bufor Tris-HCl
< 2% octanu potasu
< 0,05% detergentu
0,3% azydku sodu
0,3% (udział wagowy) azydku sodu
+
Xn
Produkt szkodliwy
8/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
COBAS® AMPLICOR®
WB
Wash Buffer
Bufor płuczący COBAS® AMPLICOR®
500 testów P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(10X – koncentrat płuczący)
< 2% buforu fosforanowego
< 9% chlorku sodu
EDTA
< 2% detergentu
2 x 250 testów
Ostrzeżenia i środki ostrożności
Test ten jes przeznaczony do stosowania z surowicą lub osoczem ludzkim
pobranymi jedynie na antykoagulant EDTA. Wykazano, że heparyna ma działanie
hamujące reakcję PCR i dlatego nie może być stosowana w tej procedurze.
Nie pipetować za pomocą ust.
Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się
próbkami i odczynnikami z zestawów, stosować jednorazowe rękawice, fartuchy
laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Po zakończeniu pracy z próbkami
i odczynnikami testowymi należy dokładnie umyć ręce.
Przy pobieraniu poszczególnych dawek odczynników z butelek unikać skażenia
bakteryjnego odczynników lub ich zanieczyszczenia rybonukleazą. Zaleca się
używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet wolnych od RNazy.
Nie łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii.
Nie używać w jednym przebiegu odczynników (w tym również kaset) z różnych
serii zestawów.
Nie otwierać kaset COBAS® AmpliPrep; nie wymieniać, nie mieszać, nie usuwać ani
nie dodawać butelek do kasety.
Wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
Nie używać zestawu po upływie daty ważności.
Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheets –
MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche.
Praca w laboratorium musi przebiegać w sposób jednokierunkowy – należy ją
rozpocząć w obszarze przedamplifikacyjnym i przemieszczać się jednokierunkowo
w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności
przedamplifikacyjne obejmują przygotowanie odczynników i próbek. Materiały
i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej czynności
poprzedzającej proces amplifikacji; nie wolno używać ich do innych czynności ani
przemieszczać między obszarami. W każdym obszarze konieczne jest używanie
rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru.
Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być
używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki i kontroli lub
pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA bądź innych źródeł
docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane przy czynnościach po
amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
Z próbkami badanymi i próbkami kontrolnymi należy obchodzić się jak
z materiałem zakaźnym, zgodnie z laboratoryjnymi przepisami bezpieczeństwa,
takimi jak określone w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories21
i w dokumencie CLSI M29-A322. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie
powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu
w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
01/2012, Revision 7.0
9/48
Uwaga
Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn
sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10
daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu.
PRZESTROGA: Odczynniki kontrolne CAP (–) C i HCV (+) C, v2.0 zawierają
osocze ludzkie dające wynik ujemny, uzyskane z ludzkiej krwi. Materiał źródłowy
badano przy użyciu testów zatwierdzonych przez US FDA i stwierdzono, że jest on
niereaktywny pod względem obecności przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał
przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu powierzchniowemu wirusa
zapalenia wątroby typu B (HBsAg). Dodatkowo zbadano zbiorcze jednostki od
dawców; nie wykryto RNA HIV-1, HCV RNA ani DNA HBV przy użyciu PCR,
a także przeciwciał przeciwko rdzeniowi HBV przy użyciu testu licencjonowanego
przez FDA. Nie ma znanych metod testowych mogących zapewnić całkowitą
pewność, że produkty pochodzące z krwi ludzkiej nie przenoszą czynników
zakaźnych. Dlatego każdy materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako
potencjalnie zakaźny. Z odczynnikami CAP (–) C i HCV (+) C, v2.0, należy
obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, zgodnie z laboratoryjnymi przepisami
bezpieczeństwa, takimi jak przedstawione w Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories21 i w dokumencie CLSI M29-A322. Dokładnie oczyścić
i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5%
podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
Roztwory, które wchodzą w skład HCV CS1, v2.0; HCV CS3, v2.0; HCV MMX,
v2.0; HCV Mn2+, v2.0; CX PS1, v2.0; IC PS1 i PWR, zawierają azydek sodu.
Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi
z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory
zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością
wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
Używając PWR, HCV CS2, v2.0; HCV MMX, v2.0; DN4, CX4, v2.0; IC4; CN4,
SB3, SB oraz substratu roboczego (mieszaniny odczynnika SB3 i SB), należy
założyć okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i rękawiczki jednorazowe. Unikać
kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli
dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną
podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania
wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą.
Należy unikać kontaktu SB i substratu roboczego ze skórą i błonami śluzowymi.
Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, natychmiast spłukać dużą ilością wody
z dodatkiem mydła.
SB i substrat roboczy zawierają dimetylformamid; publikowano informacje na temat
jego toksyczności w dużych dawkach doustnych. Związek ten może być szkodliwy
dla płodu. Należy unikać kontaktu ze skórą, wdychania oparów oraz spożycia. Jeżeli
dojdzie do kontaktu ze skórą, dokładnie spłukać za pomocą mydła i wody oraz
natychmiast zwrócić się o pomoc medyczną.
Nie wolno dopuścić do kontaktu HCV CS2, v2.0, zawierającego tiocyjanian
guanidyny, ani CX4, v2.0, i IC4 zawierających tiocyjanian sodu z roztworem
podchlorynu sodu (wybielacz). Mieszaniny takie mogą spowodować powstanie
silnie toksycznego gazu.
Podczas utylizacji zestawów do przygotowywania próbek COBAS® AmpliPrep
Sample Processing Units (SPU), zawierających tiocyjanian guanidyny, należy
unikać ich kontaktu z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Takie
mieszaniny mogą spowodować powstanie silnie toksycznego gazu.
10/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Wymagania dotyczące przechowywania
i użytkowania
Nie zamrażać odczynników ani kontroli.
Odczynniki HCV CS1, v2.0; HCV CS2, v2.0, i HCV CS3, v2.0, należy
przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nieużywane odczynniki zachowują
stabilność do podanej daty ważności. Po otwarciu odczynniki zachowują stabilność
przez 30 dni w temperaturze 2–8°C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego,
co nastąpi wcześniej. HCV CS1, v2.0; HCV CS2, v2.0, i HCV CS3, v2.0, mogą
być stosowane w ciągu maksymalnie 6 cykli pracy urządzenia (16 godzin na cykl),
będąc przechowywane w temperaturze 2–8°C pomiędzy cyklami lub umieszczone
nieprzerwanie w aparacie w przypadku cykli następujących bezpośrednio po sobie.
Ich łączny, maksymalny czas przebywania w aparacie COBAS® AmpliPrep wynosi
96 godzin. Pomiędzy kolejnymi cyklami pracy odczynniki należy przechowywać
w temperaturze 2–8°C.
Odczynniki kontrolne CAP (–) C i HCV (+) C, v2.0, należy przechowywać
w temperaturze 2–8°C. Jeżeli nie zostały otwarte, kontrole te zachowują stabilność do
podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania niewykorzystane do badania
odczynniki należy wyrzucić.
Odczynniki HCV MMX, v2.0, i HCV Mn2+, v2.0, należy przechowywać
w temperaturze 2–8°C. Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty
przydatności. Po otwarciu opakowania niewykorzystane do badania odczynniki
należy wyrzucić. Główną mieszaninę roboczą (przygotowaną przez dodanie
HCV Mn2+, v2.0, do HCV MMX, v2.0) należy przechowywać w temperaturze
2–8°C i użyć w ciągu 4 godzin od chwili przygotowania.
CX PS1, v2.0, i CX4, v2.0, należy przechowywać w temperaturze 2–8°C.
Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty ważności. Po zmieszaniu
CX PS1, v2.0, i CX4, v2.0, odczynnik roboczy zachowuje stabilność przez 30 dni
w temperaturze 2–8°C. Odczynnik roboczy może być używany maksymalnie przez
6 cykli pracy urządzenia (12 godzin na cykl) i pomiędzy cyklami pracy urządzenia
musi być przechowywany w temperaturze 2–8°C.
IC PS1 i IC4 należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Odczynniki te
zachowują stabilność do podanej daty ważności. Po zmieszaniu IC PS1 i IC4
odczynnik roboczy zachowuje stabilność przez 30 dni w temperaturze 2–8°C.
Odczynnik roboczy może być używany maksymalnie przez 6 cykli pracy urządzenia
(12 godzin na cykl) i pomiędzy cyklami pracy urządzenia musi być przechowywany
w temperaturze 2–8°C.
DN4 należy przechowywać w temperaturze 2–25°C. DN4 jest trwały do upływu
podanej daty ważności. Po otwarciu DN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze
2–8°C lub do upływu daty ważności (zależnie od tego, który termin jest
wcześniejszy). DN4 może być stosowany maksymalnie przez 6 cykli pracy
analizatora (12 godzin na cykl), a pomiędzy poszczególnymi cyklami musi być
przechowywany w temperaturze 2–8°C.
CN4 należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. CN4 jest trwały do upływu
podanej daty ważności. Po otwarciu CN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze
2–8°C lub do upływu daty ważności (zależnie od tego, który termin jest
wcześniejszy). CN4 może być stosowany maksymalnie przez 6 cykli pracy
analizatora (12 godzin na cykl), a pomiędzy poszczególnymi cyklami musi być
przechowywany w temperaturze 2–8°C.
SB3 i SB należy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Jeżeli nie zostały otwarte,
odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty ważności. Substrat roboczy
musi być przygotowywany codziennie przez zmieszanie SB3 z SB. Substrat
roboczy w analizatorze COBAS® AMPLICOR® zachowuje stabilność przez
16 godzin. Nie wystawiać SB3, SB ani substratu roboczego na działanie metali,
czynników utleniających ani bezpośrednio na światło.
01/2012, Revision 7.0
11/48
PWR należy przechowywać w temperaturze 2–32°C. PWR zachowuje stabilność
do podanej daty ważności. Po otwarciu odczynnik zachowuje stabilność przez 30 dni
w temperaturze 2–32°C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi
wcześniej.
WB należy przechowywać w temperaturze 2–30°C. WB jest trwały do upływu
podanej daty ważności. Zbadać WB przed rozcieńczeniem i jeśli potrzeba, ogrzać do
temperatury 30–37°C, aby rozpuścić ewentualny osad. Roboczy bufor płuczący
(1X), przygotowany przez rozcieńczenie WB wodą destylowaną lub dejonizowaną
w stosunku 1:10, musi być przechowywany w pojemniku na bufor płuczący
analizatora COBAS® AMPLICOR® w temperaturze 2–25°C. Bufor zachowuje
stabilność przez 2 tygodnie od daty przygotowania.
Pomiędzy cyklami pracy urządzenia częściowo zużyte odczynniki służące do
przygotowania i detekcji materiału w próbce należy przechowywać w temperaturze
2–8°C. Przed włożeniem do aparatu COBAS® AmpliPrep lub analizatora COBAS®
AMPLICOR® używanych, otwartych lub roboczych odczynników należy sprawdzić
ich datę ważności.
Dostarczane materiały
COBAS® AmpliPrep/COBAS®
AMPLICOR® HCV Test, v2.0
PCX
P/N: 03576698 190
Odczynniki do przygotowywania próbki i odczynniki kontrolne
HCV CS1, v2.0
(kaseta do oznaczeń HCV z odczynnikiem zawierającym cząsteczki
paramagnetyczne, wersja 2.0)
HCV CS2, v2.0
(kaseta do oznaczeń HCV z odczynnikiem lizującym, wersja 2.0)
HCV CS3, v2.0
(kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń HCV, wersja 2.0)
HCV (+) C, v2.0
(kontrola dodatnia HCV, wersja 2.0)
CAP (–) C
[COBAS® AmpliPrep ujemna próba kontrolna (osocze ludzkie)]
Odczynniki do amplifikacji i detekcji
HCV MMX, v2.0
(główny rozcieńczalnik HCV Master Mix, wersja 2.0)
HCV Mn2+, v2.0
(roztwór manganu HCV, wersja 2.0)
CX PS1, v2.0
CX4, v2.0
IC PS1
IC4
DN4
(roztwór denaturujący)
12/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
CN4
(koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej)
SB3
(substrat A)
SB
(substrat B)
PWR
Wash Reagent
Odczynnik płuczący COBAS® AmpliPrep System
P/N: 03309380 123
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
Bufor płuczący COBAS® AMPLICOR®
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
WB
(10X – koncentrat płuczący)
Materiały wymagane, lecz niedostarczane
Uwaga:
Należy zapoznać się z podręcznikiem aparatu COBAS® AmpliPrep,
współpracującego z analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48, analizatorem COBAS® AMPLICOR® lub aparatem cobas p 630 oraz
programem AMPLILINK w wersji 3.2 i wersji 3.3 Series. W przypadku używania
programu AMPLILINK w wersji 3.2 należy zapoznać się z podręcznikiem obsługi
programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series, współpracującego z z aparatem
COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48 i analizatorem COBAS® AMPLICOR®. W przypadku używania
programu AMPLILINK w wersji 3.3 należy zapoznać się z podręcznikiem obsługi
programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series, współpracującego z aparatem COBAS®
AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48,
analizatorem COBAS® AMPLICOR® lub aparatem cobas p 630.
Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania próbki i kontroli
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
01/2012, Revision 7.0
Aparat COBAS® AmpliPrep
Oprogramowanie AMPLILINK
Instrukcja użytkowania testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR®
HCV, v2.0
Stacja robocza z drukarką do programu AMPLILINK
Podręcznik aparatu COBAS® AmpliPrep, współpracującego z analizatorem
COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48, analizatorem
COBAS® AMPLICOR® lub aparatem cobas p 630 oraz podręcznik obsługi
programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series i programu AMPLILINK
w wersji 3.3 Series, współpracującego z aparatem COBAS® AmpliPrep,
analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48,
analizatorem COBAS® AMPLICOR® lub aparatem cobas p 630
Jednostki przetwarzania próbki (SPU)
Probówki wejściowe na próbki (S-tubes) z klipsami z kodem kreskowym
Statywy z wyjściowymi probówkami
Statywy z końcówkami K
Pipetory z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania
wolnymi od RNazy (pojemność 1000 µl)*
Mieszadło wibracyjne
Rękawice jednorazowe bezpudrowe
13/48
Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania odczynników
–
–
–
–
–
–
Pierścień A do aparatu COBAS® AMPLICOR® z wbudowanymi
12 probówkami A
Statyw pierścienia A przeznaczony do aparatu COBAS® AMPLICOR®
Pipeta Eppendorf Multipette® z końcówką 1,25 ml Combitip® (jałowa,
pojedynczo pakowana)
Pipetory (pojemność 50 µl i 100 µl) z barierą aerozolową lub końcówkami
dodatniego wypierania wolnymi od RNazy*
Zamykane plastikowe woreczki
Obszar obróbki poamplifikacyjnej – obszar amplifikacji/detekcji
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Analizator COBAS® AMPLICOR®, podłączony do stacji roboczej
oprogramowania AMPLILINK i drukarki.**
Podręcznik użytkownika analizatora COBAS® AMPLICOR®
Instrukcja użytkowania testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR®
HCV, v2.0
Podręcznik obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series,
współpracującego z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS®
TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48 i analizatorem COBAS®
AMPLICOR®, lub podręcznik obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.3
Series, współpracującego z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem
COBAS® AMPLICOR® lub aparatem cobas p 630
Statywy na naczynka D
Woda destylowana lub dejonizowana
Pipety serologiczne o pojemności 5 ml
Mieszadło wibracyjne
*
Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. We
wskazanych przypadkach należy używać pozbawionych RNazy końcówek do pipet
z barierą dla aerozoli lub dodatnim wypieraniem w celu zapobieżenia skażeniu
krzyżowemu między próbką i amplikonem.
** Jeżeli stacja robocza do oprogramowania AMPLILINK nie jest podłączona do
analizatora COBAS® AMPLICOR®, do analizatora COBAS® AMPLICOR® musi
zostać podłączona osobna drukarka.
Pobieranie, transport i przechowywanie próbek
Uwaga
Z wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie
zakaźnym.
Pobieranie próbek
Za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0,
można badać jedynie próbki osocza lub surowicy. Krew powinna być zbierana
w probówkach do separacji surowicy lub w sterylnych probówkach z EDTA
(lawendowa nakrętka) jako antykoagulantem. Próbki pobrane na heparynę nie
nadają się do badania przy użyciu tego testu. Krew pełną należy przechowywać
w temperaturze 2–25°C nie dłużej niż 6 godzin.
Należy oddzielić surowicę lub osocze od pełnej krwi w ciągu 6 godzin od pobrania
na drodze wirowania przy prędkości 1500 x g przez 20 minut w temperaturze
pokojowej. Przenieść surowicę lub osocze do jałowej probówki polipropylenowej.
Transport próbek
14/48
Krew pełna, osocze i surowica muszą być transportowane zgodnie z krajowymi,
federalnymi, stanowymi i lokalnymi przepisami dotyczącymi transportu
czynników chorobotwórczych23. Krew pełną należy transportować
w temperaturze 2–25°C i obrabiać w ciągu 6 godzin od pobrania. Osocze lub
surowicę można transportować w temperaturze 2–8°C lub zamrażać
w temperaturze -70°C bądź niższej.
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Przechowywanie próbek Próbki osocza lub surowicy można przechowywać w temperaturze 2–8°C do
72 godzin lub zamrażać w temperaturze -70°C bądź niższej. Zaleca się
przechowywanie próbek w objętościach 750–800 µl w jałowych polipropylenowych
probówkach zakręcanych o pojemności 1,5 ml (takich jak Sarstedt 72.692.005).
Próbki surowicy i osocza można dwukrotnie zamrażać i rozmrażać.
Instrukcja użytkowania
Uwaga
Szczegółowe instrukcje obsługi, drukowania wyników oraz interpretacje
znaczników, komentarze i komunikaty o błędach można znaleźć w (1)
podręczniku aparatu COBAS® AmpliPrep, współpracującego z analizatorem
COBAS® AMPLICOR® lub aparatem cobas p 630 oraz programem
AMPLILINK w wersji 3.2 Series i wersji 3.3 Series, a także (2) w podręczniku
obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.2 Series, współpracującego
z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®,
analizatorem COBAS® TaqMan® 48 i analizatorem COBAS® AMPLICOR®,
lub podręczniku obsługi programu AMPLILINK w wersji 3.3 Series,
współpracującego z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS®
TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48, analizatorem COBAS®
AMPLICOR® lub aparatem cobas p 630.
Uwaga
Wszystkie kasety z odczynnikami COBAS® AmpliPrep należy wyjąć z miejsca
przechowywania o temperaturze 2–8°C, natychmiast załadować do aparatu
COBAS® AmpliPrep i przed rozpoczęciem przygotowywania pierwszej próbki
pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej wewnątrz aparatu przez co
najmniej 30 minut. Nie dopuszczać do ogrzania kaset z odczynnikami do
temperatury pokojowej poza aparatem ze względu na możliwość skraplania
pary na etykietach z kodem kreskowym. W przypadku pojawienia się skroplonej
pary nie ścierać jej z etykiet z kodem kreskowym.
Uwaga
Próbki surowicy i osocza muszą przed użyciem osiągnąć temperaturę otoczenia.
Uwaga
Jeżeli instrukcja tego wymaga, należy stosować pipetory z barierą aerozolową
lub końcówkami o dodatniego wypierania. Zachować najdalej posuniętą
ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia.
Liczba cykli
Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające dla ośmiu cykli po 12 oznaczeń,
które można wykonywać równocześnie lub maksymalnie w sześciu oddzielnych
cyklach pracy aparatu. W każdym cyklu oznaczeń składającym się
z maksymalnie 24 próbek badanych i kontrolnych należy uwzględnić co najmniej
jedną kontrolę ujemną COBAS® AmpliPrep oraz co najmniej jedną kontrolę
dodatnią HCV, wersja 2.0 (patrz część „Kontrola jakości”).
Odczynniki do amplifikacji są pakowane w 12-oznaczeniowe fiolki jednorazowego
użytku. Aby najwydajniej wykorzystać odczynniki, próbki badane i kontrolne należy
poddawać obróbce w seriach będących wielokrotnością 12.
Przebieg pracy
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, można wykonać
w ciągu jednego lub dwóch dni. Aby przeprowadzić oznaczenie w ciągu jednego
dnia roboczego, należy kolejno wykonywać instrukcje w punktach
Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych oraz Odwrotna transkrypcja,
amplifikacja i detekcja.
Badanie można wykonać w ciągu 2 dni. Przebieg pracy dotyczący poddanej obróbce
próbki oraz próby kontrolnej, gdy praca zajmuje dwa dni, jest następujący:
Uwaga
01/2012, Revision 7.0
Poddane obróbce próbki badane i próbki kontrolne mogą być pozostawione
w aparacie COBAS® AmpliPrep na noc, do 20 godzin, lub mogą zostać wyjęte
z aparatu COBAS® AmpliPrep i umieszczone w wyjściowych probówkach
w temperaturze 2–8°C do 7 dni.
15/48
Poddane obróbce próbki badane i próbki kontrolne wyjęte z aparatu COBAS®
AmpliPrep w dniu 1 i przechowywane w temperaturze 2–8°C do 7 dni: Aby
dokonać przygotowania próbki badanej i próbki kontrolnej w dniu 1 oraz
przeprowadzić odwrotną transkrypcję, amplifikację i detekcję w dniu 2, należy
w dniu 1 postępować według instrukcji przedstawionych w punktach „Konfiguracja
aparatu COBAS® AmpliPrep” (część A) i „Uruchamianie i obsługa aparatu COBAS®
AmpliPrep” (część B) oraz wykonać czynności 1 i 2 opisane w punkcie
„Postępowanie z poddanymi obróbce próbkami badanymi i kontrolnymi” (część D),
a następnie odłożyć poddane obróbce próbki badane i kontrolne do przechowania
w warunkach określonych w części „Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych”
(część D, czynność 1). W dniu 2 należy zacząć od „Przygotowania odczynników”
(część C) oraz ogrzania poddanych obróbce próbek badanych i kontrolnych
w temperaturze pokojowej. Następnie należy kontynuować pracę zgodnie z punktami
„Postępowanie z poddanymi obróbce próbkami badanymi i kontrolnymi” (część D,
czynność 3) oraz „Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja”.
Poddane obróbce próbki badane i kontrolne pozostawione w aparacie
COBAS® AmpliPrep na noc i wyjęte w dniu 2: Aby dokonać przygotowania
próbek badanych i kontrolnych w dniu 1 oraz przeprowadzić odwrotną transkrypcję,
amplifikację i detekcję w dniu 2, należy wykonać instrukcje przedstawione
w punktach „Konfiguracja aparatu COBAS® AmpliPrep” (część A) oraz
„Uruchamianie i obsługa aparatu COBAS® AmpliPrep” (część B). W dniu 2 należy
zacząć od „Przygotowania odczynników” (część C) i kontynuować pracę zgodnie
z punktami „Postępowanie z poddanymi obróbce próbkami badanymi
i kontrolnymi” (część D) oraz „Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja”.
Przygotowanie próbki i kontroli
Część A:
Konfiguracja aparatu COBAS® AmpliPrep
Miejsce wykonania: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania
próbki i kontroli
A1. Włącz aparat COBAS® AmpliPrep (ON).
Uwaga
Aparat COBAS® AmpliPrep automatycznie przepłucze system po włączeniu.
A2. Włącz stację roboczą programu AMPLILINK za pomocą przycisku ON.
Przygotuj stację roboczą do pracy w następujący sposób:
a. Zaloguj się do systemu operacyjnego Windows XP.
b. Dwukrotnie kliknij ikonę programu AMPLILINK.
c. Zaloguj się do programu AMPLILINK, wprowadzając przydzielony
identyfikator użytkownika i hasło.
A3. Za pomocą ekranu Status sprawdź stan zaopatrzenia w odczynnik płuczący
(PWR) i uzupełnij go w razie potrzeby.
A4. Wykonaj wszystkie czynności konserwacyjne wyszczególnione w zakładce Due.
A5. W przypadku używania zamrożonych próbek rozmroź je w temperaturze
pokojowej.
A6. Określ liczbę potrzebnych kaset odczynników COBAS® AmpliPrep, zestawów
Sample Processing Units (SPU), probówek na próbki (S-tubes) oraz
końcówek K. Każda próbka badana lub kontrolna wymaga użycia jednego
zestawu SPU, jednej probówki wejściowej S, jednej końcówki K i jednej
probówki wyjściowej S.
A7. Umieść dwa odczynniki HCV CS1, v2.0, w statywie na odczynniki. Umieść
dwa odczynniki HCV CS2, v2.0, i jeden HCV CS3, v2.0, w oddzielnym
statywie na odczynniki.
16/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
A8. Włóż statyw na odczynniki zawierający HCV CS1, v2.0, w miejsce A aparatu
COBAS® AmpliPrep.
A9. Włóż statyw na odczynniki zawierający HCV CS2, v2.0, i HCV CS3, v2.0,
w miejsce B, C, D lub E aparatu COBAS® AmpliPrep.
A10. Umieść zestaw SPU w statywie (statywach) i włóż statyw (statywy) do aparatu
COBAS® AmpliPrep.
A11. Włóż odpowiednią liczbę pełnych statywów z probówkami wyjściowymi do
aparatu COBAS® AmpliPrep.
A12. Włóż odpowiednią liczbę pełnych statywów z końcówkami K w miejsca M, N,
O lub P aparatu COBAS® AmpliPrep.
A13. Do każdej pozycji statywu próbek, gdzie zostanie umieszczona próbka badana
lub kontrolna (probówka S), przymocuj klips opatrzony etykietą z kodem
kreskowym. Na każdej pozycji oznaczonej klipsem z kodem kreskowym
umieść jedną probówkę wejściową S.
A14. Włóż statyw(-y) na próbki w miejsca statywu F, G lub H w aparacie COBAS®
AmpliPrep i wydrukuj arkusz roboczy. Przypisz i zanotuj pozycje, którym będą
odpowiadać próbki badane i kontrolne na arkuszu roboczym.
A15. Wyjmij statyw(-y) na próbki z aparatu COBAS® AmpliPrep i przenieś statywy do
wyznaczonego miejsca obróbki przedamplifikacyjnej – obszaru przygotowania
próbki i kontroli w celu dodania próbki badanej i kontrolnej.
Część B:
Uruchamianie i obsługa aparatu COBAS® AmpliPrep
Miejsce wykonania: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania
próbki i kontroli
B1. Wymieszaj każdą próbkę badaną i kontrolną [CAP (–) C i HCV (+) C, v2.0] na
mieszadle wibracyjnym przez 3–5 sekund. Krótko odwiruj każdą próbkę badaną
i kontrolną w celu zebrania płynu z dolnej części probówki. Unikaj
zanieczyszczenia rękawic przy posługiwaniu się próbkami i kontrolami.
B2. Za pomocą mikropipetora z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego
wypierania wolnymi od RNazy przenieś około 700 µl, ale nie więcej niż 1,1 ml,
każdej próbki badanej i próbek kontrolnych [CAP (–) C i HCV (+) C, v2.0] do
odpowiedniej, oznaczonej kodem kreskowym probówki S. Unikaj przenoszenia
cząstek stałych i/lub skrzeplin fibrynowych z oryginalnej próbki do probówki
wejściowej S. Próbki i kontrole należy przenieść na pozycje probówek zgodnie
z przygotowanym i zapisanym w punkcie A14 arkuszem roboczym.
B3. Włóż statyw(-y) zawierające próbki badane i kontrolne w miejsca statywu F, G
lub H w aparacie COBAS® AmpliPrep.
B4. Przy użyciu stacji roboczej programu AMPLILINK ustal w zakładce Sample
kolejność próbek oraz wpisz numer serii i datę ważności zestawu do kontroli
w zakłace Quality Control.
B5. Przy użyciu programu AMPLILINK uruchom aparat COBAS® AmpliPrep.
Obróbka próbek badanych i kontrolnych odbywa się w aparacie COBAS®
AmpliPrep automatycznie.
01/2012, Revision 7.0
17/48
B6. Przed opuszczeniem obszaru przygotowywania próbek i kontroli podejmij
następujące środki ostrożności, aby uniknąć zanieczyszczenia:
– Dokładnie oczyść i odkaź wszystkie powierzchnie robocze
wykorzystywane podczas przenoszenia próbek badanych i kontrolnych
świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie
dejonizowanej lub destylowanej.
– Umyj ręce.
– Zmień rękawiczki.
– Zmień fartuch laboratoryjny.
Część C:
Przygotowanie odczynników
Miejsce wykonania: obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania
odczynników
Uwaga
Jeżeli badanie ma zostać wykonane w ciągu dwóch dni, odczynniki należy
przygotować (część C) w dniu drugim.
C1. Określ odpowiednią liczbę pierścieni A-ring potrzebnych do testowania
materiału i kontroli. Umieść pierścień(-nie) A w odpowiednim statywie
(statywach).
C2. Przygotuj główną mieszaninę roboczą, dodając 100 µl HCV Mn2+, v2.0, do
jednej fiolki z HCV MMX, v2.0. Nie jest konieczne odmierzanie objętości
odczynnika Master Mix. Dodaj 100 µl HCV Mn2+, v2.0, do pełnej fiolki
z HCV MMX, v2.0. Zamknij probówkę i wymieszaj dokładnie zawartość,
odwracając probówkę 10–15 razy. Nie mieszaj na mieszadle wibracyjnym
roboczego odczynnika Master Mix. Różowy barwnik w odczynniku
HCV Mn2+, v2.0, stosuje się do wzrokowego potwierdzenia, że HCV Mn2+,
v2.0, został dodany do HCV MMX, v2.0. Wyrzuć pozostałą część HCV Mn2+,
v2.0. Główna mieszanina robocza musi być przechowywana w temperaturze
2–8°C i zużyta w ciągu 4 godzin od przygotowania.
C3. Dodaj 50 µl głównej mieszaniny roboczej do każdej z probówek A, używając
pipetora powtarzalnego lub pipetora wyposażonego w barierę aerozolową albo
końcówkę dodatniego wypierania. W tym czasie nie należy zamykać korków
probówek A.
C4. Włóż pierścień(-nie) A zawierające główną mieszaninę roboczą do
plastikowego woreczka przeznaczonego do wielokrotnego zamykania i zamknij
go pewnie. Przenieś pierścień(nie) A do obszaru przed amplifikacją – obszaru
przygotowania próbek badanych i kontrolnych. Pierścień(-nie) A zawierające
główną mieszaninę roboczą należy przechowywać w temperaturze 2–8°C
w obszarze przed amplifikacją – obszarze przygotowania próbek badanych
i kontrolnych do czasu zakończenia przygotowywania próbek badanych
i kontrolnych w aparacie COBAS® AmpliPrep. Odczynnik roboczy Master Mix
zachowuje stabilność przez 4 godziny w temperaturze 2–8°C w probówkach A
umieszczonych w szczelnie zamkniętej torebce z tworzywa.
Część D:
Postępowanie z poddanymi obróbce próbkami badanymi i kontrolnymi
Miejsce wykonania: obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania
próbki i kontroli
Uwaga
18/48
Jeżeli badanie ma się odbyć w ciągu dwóch dni, poddane obróbce próbki
badane i poddane obróbce próbki kontrolne można pozostawić w aparacie
COBAS® AmpliPrep do 20 godzin.
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
D1. Po zakończeniu cyklu obróbki próbek badanych i kontrolnych w aparacie
COBAS® AmpliPrep wyjmij statyw(-y) zawierające poddane obróbce próbki
badane i poddane obróbce próbki kontrolne. Po wyjęciu z aparatu COBAS®
AmpliPrep poddane obróbce próbki badane i poddane obróbce próbki kontrolne
mogą być przechowywane w probówkach wyjściowych w temperaturze 2–8°C
przez okres do 7 dni.
Uwaga
Probówki wyjściowe S i klipsy z kodami kreskowymi należy trzymać razem
w statywie na próbki. Nie wolno oddzielać żadnej probówki S od jej klipsa,
z wyjątkiem momentu przeniesienia przygotowanej próbki badanej lub
przygotowanej próbki kontrolnej do probówki A.
D2. Po wyjęciu próbek z aparatu COBAS® AmpliPrep wykonaj natępujące
czynności:
a.
Znacznik
S
R
Sprawdź, czy nie pojawiły się sygnały błędu lub komunikaty o błędzie. Próbki
z sygnałami i komentarzami należy interpretować następująco:
Uwaga
Działanie
Objętość wykryta w probówce wejściowej S była albo zbyt
wysoka, albo zbyt niska. Próbka nie została poddana obróbce.
Probówka wejściowa S (probówka z półprzezroczystą nakrętką)
została zwrócona do statywu na próbki. Nie amplifikuj próbki, która
nie została poddana obróbce. Napraw błąd i ponownie poddaj próbkę
obróbce, jeżeli była ona w aparacie COBAS® AmpliPrep krócej niż
3 godziny. Jeżeli czas przebywania próbki w aparacie przekroczył
3 godziny, poddaj obróbce kolejną porcję wyjściowej próbki.
SampleInputMissing
ICIQSReagent Missing
LysisReagentMissing
ProbeReagentMissing
SpecimenDiluentMissing
Wykryto niewystarczającą objętość odczynnika. Nie amplifikuj
żadnej próbki oznaczonej sygnałem „R”. W przypadku próbki
poddanej obróbce (probówka wyjściowa z szarą nakrętką) poddaj
obróbce kolejną porcję wyjściowej próbki. W przypadku próbki,
która nie została poddana obróbce (probówka wejściowa
z półprzezroczystą nakrętką), należy poddać ją obróbce, jeżeli
była ona w aparacie COBAS® AmpliPrep krócej niż 3 godziny.
Jeżeli czas przebywania próbki w aparacie przekroczył 3 godziny,
poddaj obróbce kolejną porcję wyjściowej próbki.
I
InstrumentTempOutOfRange
ReagentTempOutOfRange
Incubation60OutOfRange
Incubations37OutOfRange
IncubationTargetReleaseOutOfRange
Temperatura cieplarki lub aparatu poza dopuszczalnym
zakresem. Nie amplifikuj żadnej próbki oznaczonej sygnałem „I”.
Skontaktuj się z lokalnym przedstawicielem firmy Roche. Używając
nowych odczynników, poddaj obróbce kolejną porcję wyjściowej
próbki.
E
TestKitExpired
Data ważności zestawu testowego została przekroczona. Nie
kontynuuj danego cyklu oznaczeń. Przed rozpoczęciem obróbki
próbek wymień przedatowany zestaw na nowy.
b.
Porównaj probówki wyjściowe poddanych obróbce próbek badanych
z probówkami wyjściowymi poddanych obróbce próbek kontrolnych:
• Poddane obróbce próbki badane i kontrolne powinny mieć
porównywalną objętość płynu w probówkach wyjściowych.
• Poddane obróbce próbki badane i kontrolne powinny mieć porównywalne
stężenie cząsteczek paramagnetycznych w probówkach wyjściowych.
Poddane obróbce próbki, których objętość i stężenie cząsteczek paramagnetycznych
jest porównywalne z próbkami kontrolnymi, można poddać amplifikacji. Poddane
obróbce próbki badane lub kontrolne o niskiej objętości wyjściowej lub obniżonym
stężeniu cząsteczek paramagnetycznych muszą zostać poddane ponownej obróbce
w aparacie COBAS® AmpliPrep. W razie ponownego uzyskania niskiej objętości
wyjściowej lub obniżonego stężenia cząsteczek paramagnetycznych przy
powtórzeniu obróbki należy pozyskać od pacjenta świeżą próbkę i ponowić test.
01/2012, Revision 7.0
19/48
Uwaga
Jeżeli przed amplifikacją poddane obróbce próbki badane i poddane obróbce
próbki kontrolne były przechowywane w temperaturze 2–8°C, przed
przystąpieniem do wykonywania czynności D3 należy je ogrzać w temperaturze
pokojowej co najmniej przez 10 minut.
D3. Wymieszaj probówkę wyjściową S, zawierającą poddaną obróbce próbkę
badaną lub poddaną obróbce próbkę kontrolną, na mieszadle wibracyjnym
przez ok. 5 sekund, aby zawiesić w roztworze cząsteczki magnetyczne
zawierające związane RNA przed przeniesieniem do probówki A.
D4. Używając pipetora wyposażonego w barierę aerozolową lub końcówkę
dodatniego wypierania, dodaj 50 µl dobrze wymieszanej, poddanej obróbce
próbki badanej lub poddanej obróbce próbki kontrolnej do odpowiedniej
probówki A, zawierającej odczynnik roboczy Master Mix, postępując według
następującej procedury. Umieść końcówkę pipety zawierającą poddaną obróbce
próbkę badaną lub poddaną obróbce próbkę kontrolną mniej więcej w połowie
odczynnika roboczego Master Mix, w środku probówki A, i wypuść roztwór,
naciskając przycisk pipety z dostateczną siłą, tak aby doszło do zmieszania
roztworów, do momentu wyczucia pierwszego oporu. Pobierz roztwór
z powrotem do końcówki. Wypuść roztwór, przyciskając przycisk pipety do
momentu wyczucia drugiej pozycji oporu. Zamknij probówkę A.
D5. Powtórz czynności z etapu D3 i D4 w odniesieniu do każdej poddawanej
obróbce próbki badanej i poddawanej obróbce próbki kontrolnej, aż do
przeniesienia każdej z nich do probówek A. Do każdej przygotowanej próbki
badanej i przygotowanej próbki kontrolnej używaj nowej końcówki.
D6. Zanotuj na mapie pierścienia A pozycje poddanych obróbce próbek badanych
i poddanych obróbce próbek kontrolnych w pierścieniu(-ach) A. Amplifikację
należy rozpocząć w ciągu 45 minut od czasu dodania przygotowanych próbek
badanych i kontrolnych do probówek A zawierających główną mieszaninę
roboczą. Przenieś pierścienie A zawierające odczynnik roboczy Master Mix
oraz poddane obróbce próbki badane i poddane obróbce próbki kontrolne do
obszaru amplifikacji/detekcji.
Uwaga
20/48
Wszystkie pozostałe, poddane obróbce próbki badane lub poddane obróbce próbki
kontrolne mogą być przechowywane w temperaturze 2–8°C przez okres do 7 dni od
daty przygotowania.
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja
Uwaga
W celu amplifikacji uprzednio przygotowanych próbek badanych i kontrolnych
najpierw wykonaj czynności opisane w punkcie „Przygotowanie odczynników”
(część C). Ogrzej przechowywane w lodówce, poddane obróbce próbki badane
i kontrolne w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut, a następnie
wykonaj czynności opisane w części „Postępowanie z poddanymi obróbce
próbkami badanymi i kontrolnymi” (część D, czynność 3).
Część E:
Konfiguracja analizatora COBAS® AMPLICOR®
Miejsce wykonania:
amplifikacji/detekcji
obszar
obróbki
poamplifikacyjnej
–
obszar
E1. Wykonaj następujące codzienne czynności serwisowe:
–
Wytrzyj stanowisko inicjalizacyjne wilgotną ściereczką niezostawiającą
włókien, a następnie wysusz.
–
Wytrzyj końcówkę statywu na pojemniki D wilgotną ściereczką
niezostawiającą włókien, a następnie wysusz.
–
Sprawdź pojemnik buforu płuczącego i napełnij go w razie potrzeby.
–
Przygotuj roboczy bufor płuczący (1X) w sposób podany poniżej. Zbadaj
WB oraz, jeżeli jest to konieczne, ogrzej w temperaturze 30–37°C w celu
ponownego rozpuszczenia ewentualnego osadu. Dodaćj 1 objętość WB do
9 objętości wody destylowanej lub dejonizowanej. Dobrze wymieszaj.
Należy dbać o to, żeby w zbiorniku buforu płuczącego przez cały czas
znajdowały się przynajmniej 3–4 litry roboczego buforu płuczącego (1X).
–
Opróżnij pojemnik na resztki.
–
Przepłucz system.
–
Podczas uruchamiania systemu sprawdź strzykawki i przewody.
–
Podczas uruchamiania sprawdź końcówkę transferową.
E2. Przed każdym przebiegiem oznaczeń:
Część F:
–
Zmień rękawiczki.
–
Sprawdź pojemnik na resztki i opróżnij go, jeśli to konieczne.
–
Sprawdź pojemnik na bufor płuczący i dodaj bufor, jeśli to konieczne.
–
Wymień używane statywy na pojemniki D.
–
Przepłucz system.
Uruchamianie i obsługa analizatora COBAS® AMPLICOR®
Miejsce wykonania: obszar obróbki poamplifikacyjnej – obszar amplifikacji/
detekcji
F1. Sprawdź ilości odczynników wewnątrz analizatora COBAS® AMPLICOR®.
Przygotuj wystarczającą liczbę kaset z odczynnikami do wykonania analizy
wprowadzonych próbek.
F2. Dokładnie wymieszaj odczynnik CX PS1, v2.0 na mieszadle wibracyjnym.
Dodaj 2,5 ml CX PS1, v2.0 do kasety zawierającej CX4, v2.0. Umieść kasetę w
statywie na odczynniki specyficzne dla określonego testu. Usuń zużytą fiolkę
CX PS1, v2.0. Zanotuj datę przygotowania odczynnika na kasecie CX4, v2.0.
01/2012, Revision 7.0
21/48
F3. Dokładnie wymieszaj IC PS1 na mieszadle wibracyjnym. Dodaj 2,5 ml IC PS1
do jednej kasety z IC4. Umieść kasetę w statywie na odczynniki specyficzne dla
określonego testu. Usuń zużytą fiolkę IC PS1. Zanotuj datę przygotowania
odczynnika na kasecie IC4.
F4. Przygotuj substrat roboczy, odmierzając za pomocą pipety 5 ml SB do pojemnika
z SB3. Aby wymieszać roztwór, kilkakrotnie nabierz i usuń płyn z pipety. Wyrzuć
użytą fiolkę SB. Na pojemniku z SB3 zanotuj datę przygotowania.
F5. Umieść substrat roboczy w statywie na roztwory podstawowe.
F6. Umieść kasety z DN4 i CN4 w podstawowym statywie na roztwory. Na każdej
kasecie odnotuj datę jej otwarcia.
F7. Oznacz statywy na odczynniki jako ogólne lub właściwe dla określonego testu,
używając klawiatury lub czytnika kodów kreskowych.
F8. Przy użyciu klawiatury lub czytnika kodów kreskowych skonfiguruj statywy na
odczynniki, wprowadzając pozycje odczynników i numery serii do analizatora
COBAS® AMPLICOR®.
F9. Włóż statywy na odczynniki do analizatora COBAS® AMPLICOR® , używając
klawiatury lub czytnika kodów kreskowych. Upewnij się, że każda kaseta
z odczynnikami znajduje się w przypisanym jej miejscu i jest mocno
zamocowana w statywie.
F10. Umieść statyw(-y) na naczynka D na platformie przeznaczonej do naczynek D.
Dla każdej reakcji detekcji wymagane jest jedno naczynko D, a dla każdej
kasety z substratem roboczym wymagane są dwa naczynka D, aby umożliwić
wyzerowanie analizatora COBAS® AMPLICOR®.
F11. Umieść pierścień(-nie) A w segmencie(-tach) termocyklera analizatora
COBAS® AMPLICOR®.
F12. Przy użyciu klawiatury lub czytnika kodów kreskowych włóż pierścień(-nie) A
do analizatora COBAS® AMPLICOR®.
F13. Utwórz listę roboczą pierścienia A.
F14. Szczelnie zamknij pokrywę segmentu(-ów) termocyklera.
F15. Uruchom analizator COBAS® AMPLICOR®.
F16. Zaczekaj, aż analizator COBAS® AMPLICOR® wyświetli komunikat
o pomyślnym sprawdzeniu systemu w czasie uruchamiania.
Uwaga
Analizator COBAS® AMPLICOR® umożliwia wykonanie do 6 oddzielnych
oznaczeń zawartości każdej probówki A. Analizator COBAS® AMPLICOR®
oblicza niezbędną ilość każdego odczynnika do detekcji, a sprawdzanie zawartości
wykonywane na początku każdego cyklu oznaczeń określa, czy jest dostępna
wystarczająca ilość odczynników do wykonania zaplanowanych badań.
F17. Analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie wykonuje odwrotną
transkrypcję, amplifikację i detekcję. Wyniki są wyrażone w postaci wartości
absorbancji dla długości fali 660 nm oraz jako wynik dodatni lub ujemny.
22/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Wyniki
Interpretacja wyników bez detekcji kontroli wewnętrznej
1.
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, sprawdź sygnały i komentarze
na właściwym dla niego wydruku. Jeśli seria oznaczeń jest niewłaściwa,
powtórz całą serię (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja).
2.
W przypadku prawidłowego cyklu wyniki próbek interpretuje się w następujący
sposób:
A660
Komentarz
Znaczenie
< 0.15
NEGATIVE
Nie wykryto HCV RNA. Wynik ujemny nie
wyklucza obecności zakażenia wirusem HCV,
gdyż wyniki zależne są od odpowiedniego
pobrania próbki, nieobecności inhibitorów
oraz obecności ilości RNA wystarczającej do
detekcji.
≥ 1.0
POSITIVE
Wykryto HCV RNA. Wynik badania
próbki na obecność HCV jest dodatni.
≥ 0.15, < 1.0
GZ 0.15 – 1.0
Niejednoznaczny. Wyniki badań na obecność
HCV RNA są niejednoznaczne. Powtórz całą
procedurę oznaczenia w dwóch powtórzeniach
przy użyciu nowej porcji próbki. W przypadku
próbek, które w obu powtórzeniach testu dały
wynik ≥ 0,15 A660, należy przyjąć, że
zawierają one HCV RNA. Próbki, których
jeden lub dwa wyniki powtórzenia testu są
< 0,15 A660, należy uznać za przypuszczalnie
pozbawione HCV RNA.
Z użyciem detekcji kontroli wewnętrznej
01/2012, Revision 7.0
1.
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, sprawdź sygnały i komentarze
na właściwym dla niego wydruku. Jeśli seria oznaczeń jest niewłaściwa,
powtórz całą serię (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja).
2.
W przypadku prawidłowego cyklu wyniki próbek z analizatora COBAS®
AMPLICOR® interpretuje się w następujący sposób:
23/48
Wynik próbki na
obecność HCV
Komentarz
A660
Wynik kontroli
wewnętrznej
A660
Komentarz
Interpretacja
< 0.15
NEGATIVE
≥ 0.15
POSITIVE
Nie wykryto HCV RNA. Wynik badania próbki na
obecność HCV jest prawdopodobnie ujemny. Wynik
ujemny nie wyklucza obecności zakażenia wirusem
HCV, gdyż wyniki zależne są od odpowiedniego
pobrania próbki, nieobecności inhibitorów oraz
obecności ilości RNA wystarczającej do detekcji.
< 0.15
NEGATIVE
< 0.15
NEGATIVE
Próbka zawierająca inhibitory. HCV RNA, jeśli
jest obecny, nie będzie wykrywalny. Przygotuj
jeszcze jedną próbkę z oryginalnie pobranego
materiału i powtórz test. Inhibitory często są
niestabilne, stąd próbki początkowo zawierające
inhibitor mogą nie wykazywać cech zahamowania
przy powtórzeniu testu. Jeżeli oryginalna próbka nie
jest dostępna, należy pobrać nową.
≥ 1.0
POSITIVE
DOWOLNY
DOWOLNY
Wykryto HCV RNA. W próbce wykryto obecność
HCV.
DOWOLNY
DOWOLNY
Niejednoznaczny. Wyniki badań na obecność HCV
RNA są niejednoznaczne. Powtórz całą procedurę
oznaczenia w dwóch powtórzeniach przy użyciu
nowej porcji próbki. W przypadku próbek, które
w obu powtórzeniach testu dały wynik ≥ 0,15 A660,
należy przyjąć, że zawierają one HCV RNA. Próbki,
których jeden lub dwa wyniki powtórzenia testu są
< 0,15 A660, należy uznać za przypuszczalnie
pozbawione HCV RNA, pod warunkiem, że wyniki
IC dla obu powtórzeń są ≥ 0,15 A660.
≥ 0.15, < 1.0 GZ 0.15 – 1.0
Kontrola jakości
Z każdą serią próbek musi być przebadany co najmniej jeden egzemplarz kontroli
kontroli ujemnej COBAS® AmpliPrep i co najmniej jeden egzemplarz kontroli
dodatniej HCV. Jak w przypadku każdej nowej procedury laboratoryjnej, nowi
operatorzy do czasu uzyskania przez nich wysokiej biegłości w prawidłowym
wykonywaniu procedury oznaczenia powinni rozważyć użycie dodatkowych
dodatnich i ujemnych prób kontrolnych podczas każdego oznaczenia. Nie ma
wymagań dotyczących położenia kontroli w pierścieniu(-ach) A.
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, sprawdź sygnały i komentarze na
właściwym dla niego wydruku.
24/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Kontrola ujemna
Interpretacja wyników kontroli ujemnej bez detekcji kontroli wewnętrznej
Wynik kontroli ujemnej
Interpretacja
A660
Komentarz
< 0,10
NEGATIVE
Przebieg testowy jest ważny.
POSITIVE
Przebieg testowy jest nieważny. Należy powtórzyć cały proces
(przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację oraz detekcję). Jeśli absorbancja
CAP (–) C jest stale większa niż 0,10, w celu otrzymania pomocy technicznej
należy skontaktować się z miejscowym biurem Roche.
≥ 0,10
Interpretacja wyników kontroli ujemnej z detekcją kontroli wewnętrznej
Wynik kontroli ujemnej
Wynik kontroli
wewnętrznej
Interpretacja
A660
Komentarz
A660
Komentarz
< 0,10
NEGATIVE
≥ 0,15
POSITIVE
(przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację oraz detekcję).
Jeśli absorbancja CAP (–) C jest stale większa niż 0,10, w celu
otrzymania pomocy technicznej należy skontaktować się z miejscowym
biurem Roche.
≥ 0,10
POSITIVE
Dowolny
wynik
Dowolny
komentarz
< 0,10
NEGATIVE
< 0,15
NEGATIVE
Kontrola dodatnia
Interpretacja wyników kontroli dodatniej bez detekcji kontroli wewnętrznej
Wynik kontroli dodatniej
Interpretacja
A660
Komentarz
≥ 1,0
POSITIVE
< 1,0
NEGATIVE
Przebieg testowy jest nieważny. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie
próbek i kontroli, amplifikację oraz detekcję). Jeśli absorbancja HCV (+) C, v2.0
jest stale mniejsza niż 1,0, w celu otrzymania pomocy technicznej należy
skontaktować się z miejscowym biurem Roche.
Interpretacja wyników kontroli dodatniej z detekcją kontroli wewnętrznej
Wynik kontroli dodatniej
Wynik kontroli
wewnętrznej
Interpretacja
A660
Komentarz
A660
Komentarz
≥ 1,0
POSITIVE
≥ 0,15
POSITIVE
≥ 1,0
POSITIVE
< 0,15
NEGATIVE
< 1,0
NEGATIVE
01/2012, Revision 7.0
Dowolny
wynik
Dowolny
komentarz
(przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację oraz detekcję). Jeśli
absorbancja HCV (+) C, v2.0 jest stale mniejsza niż 1,0, w celu
otrzymania pomocy technicznej należy skontaktować się z miejscowym
biurem Roche.
25/48
Środki ostrożności dotyczące procedury
Organizacja pracy w laboratorium musi być jednokierunkowa, rozpoczynając od
obszaru obróbki przedamplifikacyjnej (przygotowanie materiału i kontroli),
i przechodzić do obszaru obróbki postamplifikacyjnej (amplifikacja/detekcja).
Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej
czynności poprzedzającej proces amplifikacji; nie wolno używać ich do innych
czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym obszarze konieczne jest
używanie rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru.
Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być
używane przy czynnościach związanych z przygotowywaniem próbki i kontroli lub
pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA bądź innych źródeł
docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane przy czynnościach po
amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia
badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu należy zachować
wyjątkową ostrożność, aby zapewnić czystość zestawów odczynników oraz
mieszanin do amplifikacji. Należy ściśle monitorować czystość wszystkich
odczynników. Należy usunąć wszystkie podejrzane odczynniki.
Ograniczenia metody
Test ten został zatwierdzony do użytku wyłącznie w zastosowaniu z ludzką surowicą
lub ludzkim osoczem pobranym na środek antykoagulacyjny EDTA. Badanie innych
rodzajów próbek może dawać wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie.
Heparyna hamuje PCR; testu COBAS® AmpliPrep/ COBAS® AMPLICOR® HCV,
v2.0, nie można stosować do próbek pobranych przy użyciu heparyny jako środka
przeciwkrzepliwego.
Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od właściwego pobrania próbki,
transportu, przechowywania oraz procedur obróbki.
Badania analityczne wskazują, że test COBAS® AmpliPrep/test COBAS®
AMPLICOR® HCV, v2.0, wykazuje największą czułość w przypadku próbek
zawierających HCV o genotypie 1 i 6, a różnica w czułości w porównaniu
z próbkami zawierającymi HCV o genotypach 2, 3, 4 i 5 jest maksymalnie
pięciokrotna.
Detekcja wirusa HCV jest zależna od liczby cząstek wirusa obecnych w próbce
i mogą na nią mieć wpływ metoda pobrania próbki, czynniki zależne od pacjenta
(np. wiek, obecność objawów) i/lub stadium zakażenia.
Podwyższony poziom albuminy (≥ 6 mg/dl) może spowodować niecałkowite
przetworzenie próbki wywołane krzepnięciem matrycy w probówce wejściowej.
Wyniki fałszywie ujemne mogą się pojawiać na skutek hamowania polimerazy. Test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, uzupełniono o kontrolę
wewnętrzną HCV, aby umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek
zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR.
Obecność enzymu AmpErase w mieszaninie głównej HCV Master Mix zmniejsza
ryzyko skażenia amplikonu. Jednak kontaminacji z dodatnich kontroli HCV
i materiałów HCV dodatnich można uniknąć tylko przez dobre praktyki laboratoryjne
i dokładne realizowanie procedur wyszczególnionych w tej instrukcji użytkowania.
Produktu tego powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach
PCR.
Niniejszego produktu można używać wyłącznie z aparatem COBAS® AmpliPrep
i analizatorem COBAS® AMPLICOR®.
26/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Mutacje w obrębie wysoko konserwatywnego regionu genomu wirusowego,
z którym wiążą się startery i/lub sonda używane w teście COBAS®
AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV w wersji 2.0, chociaż rzadkie, mogą
spowodować niewykrycie wirusa.
Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą
stosowanych metod użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji
stosowanych metod w celu określenia jakościowych różnic występujących
pomiędzy nimi.
Ocena skuteczności w badaniach nieklinicznych
Czułość analityczna
Ocena granicy wykrywalności testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), w surowicy i osoczu pobranym na EDTA za
pomocą standardowego preparatu HCV Secondary Standard
(przygotowanego według międzynarodowego standardu WHO dla
HCV RNA, 96/790).
Czułość testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX),
określono przez analizę z użyciem standardowego preparatu HCV Secondary
Standard. Standardowy preparat HCV Secondary Standard przygotowano w firmie
Roche Molecular Systems, używając międzynarodowego standardu WHO jako
odniesienia w procesie wyznaczania wartości w jednostkach IU/ml.
Międzynarodowy standard WHO dla HCV RNA, 96/790, uzyskano dzięki
badaniom prowadzonym wspólnie przez National Institute for Biological Standards
and Control (NIBSC, Narodowy Instytut Standardów Biologicznych i Kontroli)
w Wielkiej Brytanii oraz Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood
Transfusion Service (CLB, Główne Laboratorium Służby Tansfuzji Krwi
holenderskiego Czerwonego Krzyża)24. Międzynarodowy standard WHO jest
próbką genotypu 1 HCV zawierającą 105 jednostek międzynarodowych (IU)/ml.
Rozcieńczenia standardowego preparatu HCV Secondary Standard (seria 002)
o stężeniach 150, 100, 50, 30, 20, 10 i 0 IU/ml przygotowano w ludzkim osoczu
o wyniku ujemnym dla HCV i ludzkiej surowicy o wyniku ujemnym dla HCV na
podstawie wyznaczonej wartości 21 000 IU/ml. Sześć (6) równoległych analiz dla
każdego stężenia w osoczu oraz w surowicy wykonywało dwóch (2) operatorów
w każdym z czterech (4) dni, wykorzystując dwie serie odczynników testu COBAS®
AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX) (łącznie wykonano 48
oznaczeń dla każdej matrycy). Granicę wykrywalności określono na podstawie
najniższego stężenia HCV dającego wskaźnik wykrywalności 95% lub wyższy dla
testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX). W surowicy
oraz osoczu pobranym na EDTA 95% wskaźnik wykrywalności dla testu COBAS®
AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), zaobserwowano dla stężenia
20 IU/ml. Granica wykrywalności na podstawie analizy Probit wyniosła 10 IU/ml dla
osocza pobranego na EDTA oraz 11 IU/ml dla surowicy. W tabelach 1 i 2
przedstawiono granicę wykrywalności testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), odpowiednio dla osocza pobranego na EDTA
i surowicy.
01/2012, Revision 7.0
27/48
Tabela 1
Granica wykrywalności za pomocą międzynarodowego standardu WHO dla
HCV RNA w osoczu pobranym na EDTA
HCV RNA
(IU/ml)
Powtórzenia
HCV RNA
HCV RNA
(n)
150
100
50
30
20
10
0
48
48
48
48
48
48
48
Dodatni (n)
48
48
48
48
48
44
0
Dodatni (%)
100
100
100
100
100
91,7
0
*Przedziały
ufności
94–100%
94–100%
94–100%
94–100%
94–100%
80–97,7%
0–6,1%
*Dokładne 95% dwumianowe granice ufności
Tabela 2
Granica wykrywalności za pomocą międzynarodowego
standardu WHO dla HCV RNA w surowicy
HCV RNA
(IU/ml)
**Powtórzenia
HCV RNA
HCV RNA
(n)
150
100
50
30
20
10
0
47
26
44
48
48
48
47
Dodatni (n)
47
26
44
48
48
39
0
Dodatni (%)
100
100
100
100
100
85,4
0
*Przedziały
ufności
93,8–100%
89–100%
93,4–100%
94–100%
94–100%
72,2–93,9%
0–6,2%
*Dokładne 95% dwumianowe granice ufności
**Liczba wszystkich oznaczeń jest mniejsza od 48 z powodu skrzepnięcia próbki wejściowej w aparacie COBAS® AmpliPrep.
Ocena genotypu HCV
Względną czułość testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0
(PCX), dla głównych genotypów HCV określono za pomocą analizy paneli
przygotowanych z HCV-dodatnich próbek klinicznych o znanym genotypie. Na
podstawie początkowego stężenia HCV RNA docelowe rozcieńczenia każdej
próbki przygotowano przez rozcieńczenie każdej próbki ujemnym ludzkim
osoczem lub surowicą do końcowych stężeń 10, 25, 50 i 100 IU/ml HCV RNA
(genotypy 1, 2, 3, 4) lub 20, 30, 50, 100, 150 IU/ml HCV RNA (genotypy 5, 6).
Wyniki testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0,
potwierdziły jednakową detekcję (95% wskaźnik wykrywalności) HCV RNA przy
docelowych stężeniach 100 IU/ml bez względu na genotyp. Najwyższą czułość
(95% wskaźnik wykrywalności) odnotowano dla genotypów HCV 1 (25 IU/ml)
i 6 (20 IU/ml). 95% poziom wykrywalności to 50 IU/ml dla genotypu 2 i 100 IU/ml
dla genotypów 3, 4 i 5.
Badanie paneli
serokonwersji HCV
Początkowy czas detekcji infekcji HCV za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/
COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), porównano z tradycyjnymi testami
serologicznymi za pomocą dostępnych w sprzedaży paneli serokonwersji HCV
(n = 5). Każdy panel serokonwersji HCV reprezentuje dobrze scharakteryzowaną
serię próbek pobranych na przestrzeni określonego czasu od jednej osoby przed oraz
po wytworzeniu przeciwciał anty-HCV. Każdą z próbek panelu badano trzykrotnie
za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX).
Pierwsza detekcja HCV RNA w panelach badanych przy użyciu testu COBAS®
AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), miała miejsce średnio
28/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
czterdzieści dziewięć (49) dni przed wykryciem przeciwciał przeciw HCV,
dostarczając wcześniejszego markera zakażenia HCV w porównaniu z tradycyjnymi
badaniami serologicznymi.
Swoistość analityczna
Badanie reprezentatywności genotypu HCV
Swoistość testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), dla
HCV RNA oceniano przy użyciu próbek klinicznych reprezentujących główne
genotypy HCV. Badano panel próbek klinicznych (n = 37) obejmujących
6 genotypów reprezentujących czternaście (14) podtypów HCV (1a, 1b, 1c, 2a/c, 2b,
3a, 3e, 4a, 4c, 4c/d, 4f, 4h, 5a i 6a). Wynik testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), na obecność HCV RNA był dodatni we wszystkich
próbkach klinicznych (patrz tabela 3).
Tabela 3
Reprezentatywność genotypów HCV
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Genotyp HCV
Przebadane próbki
Próbki dodatnie dla HCV RNA
1a
1b
1c
2a/c
2b
3a
3e
4a
4c
4c/d
4f
4h
5a
6a
RAZEM
5
4
1
1
8
3
1
5
3
1
1
1
1
2
37
5 (100)
4 (100)
1 (100)
1 (100)
8 (100)
3 (100)
1 (100)
5 (100)
3 (100)
1 (100)
1 (100)
1 (100)
1 (100)
2 (100)
37 (100%)
Zdolność wykluczania drobnoustrojów
Swoistość testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX),
oceniono na podstawie testów na potencjalną reaktywność krzyżową
z drobnoustrojami patogennymi oraz czynnikami kontaminującymi prawidłową
mikroflorę naskórka, które mogą znaleźć się w próbkach. Badano próbki (łącznie
n = 32) zawierające izolaty wirusów (n = 28) lub bakterii (n = 4). Wynik testu
COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), na obecność HCV
RNA był ujemny we wszystkich próbkach klinicznych (patrz tabela 4). Powyższe
wyniki wskazują, że test COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0
(PCX), jest swoisty dla HCV RNA i nie wchodzi w reakcje krzyżowe z szeregiem
wirusów i bakterii, które potencjalnie znajdują się w próbkach.
Za pomocą testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, który jest bardziej czułym
testem jakościowym dla HCV RNA wykorzystującym te same primery oraz sondy,
zbadano dwunastu różnych przedstawicieli rodziny Flaviviridae. Żaden
z wymienionych niżej przedstawicieli Flaviviridae nie wykazywał reaktywności
krzyżowej: wirus Nilu Zachodniego (West Nile, linia I i II), wirus zapalenia mózgu
z St. Louis (St. Louis Encephalitis), wirus zapalenia mózgu z doliny Murray (Murray
Valley Encephalitis), wirus Dengue typ 1, 2, 3 i 4; wirus żółtej gorączki (Yellow
Fever), wirus Zika, wirus Banzi oraz wirus Ilheus.
01/2012, Revision 7.0
29/48
Tabela 4
Swoistość analityczna: Zdolność wykluczania drobnoustrojów
Izolat/opis próbki
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Próbki
(n)
HCV RNA
Dodatni (n)
Dodatnie
dla IC (n)
Adenowirus (typy 2, 3 i 7)
Enterowirusy (m.in. Echowirus 1 i
wirus Coxsackie B1)
Wirusy Herpes [m.in. wirus Herpes Simplex
(typy 1 i 2), ludzki wirus Herpes (typ 6),
wirus cytomegalii (AD-169, Davis i Towne),
wirus ospy wietrznej]
3
2
0
0
3
2
10
0
10
HIV-1 (podtypy A–G)
HPV (typy 6a, 16 i 18)
HAV
HBV
Chlamydia trachomatis
Wirus Epstein-Barr
Propionibacterium acnes
Staphylococcus (aureus i epidermis)
Łącznie
7
3
1
1
1
1
1
2
32
0
0
0
0
0
0
0
0
0
7
3
1
1
1
1
1
2
32
Interferencja
Substancje endogenne
Szereg próbek zawierających podwyższony poziom substancji endogennych
(hemoglobiny, albuminy, trójglicerydów, immunoglobulin lub bilirubiny)
przebadano pod kątem możliwości zakłócania testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX). Próbki z podwyższonym poziomem (patrz
zakresy, tabela 5) hemoglobiny (n = 10), albuminy (n = 10), trójglicerydów (n = 10),
bilirubiny (n = 10) i immunoglobulin (n = 10) oceniano jako czyste (bez piku HCV)
i z pikiem HCV w pobliżu granicy wykrywalności (60 IU/ml) testu COBAS®
AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX).
Tabela 5
Zakresy stężeń substancji endogennych dla badań
interferencji
Substancje
o podwyższonym
stężeniu
Albumina
Bilirubina
Hemoglobina
Triglicerydy
Immunoglobuliny
Wysoki prawidłowy
Poziomy
poziom
CLSI (mg/dl)
(mg/dl)
(dla porównania)
5000
0,2
2,5
190
1200
6000
40
500
3000
6000
Zakres testu
badanych stężeń
(mg/dl)
5500 – 7000
6,0 – 24,1
40 – 1580
289 – 1432
1590 – 2440
Wszystkie próbki z pikami HCV (60 IU/ml) badano w pięciu powtórzeniach.
Dodatni wynik na obecność HCV RNA stwierdzono za pomocą testu COBAS®
AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), we wszystkich próbkach
z pikami HCV (60 IU/ml), z wyjątkiem jednej próbki o podwyższonym poziomie
triglicerydów, która po ponownym zbadaniu dała również wynik dodatni. Wyniki
wskazują, że tak podwyższony poziom substancji endogennych nie wpływa na
zdolność testu do wykrycia HCV RNA w pobliżu granicy wykrywalności.
Wszystkie próbki bez zanieczyszczenia (bez pików HCV), o podwyższonym
poziomie substancji endogennych wykazywały ujemny wynik testu w kierunku
HCV RNA przy użyciu testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV,
v2.0 (PCX), z wyjątkiem dwóch próbek z wysokim poziomem albuminy i dwóch
30/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
próbek zawierających immunoglobuliny. W próbkach zawierających podwyższony
poziom albuminy i immunoglobulin potwierdzono następnie dodatni wynik testu
w kierunku HCV RNA na podstawie różnicującej metody badania przy użyciu testu
COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0. Próbki o podwyższonym poziomie albuminy,
bilirubiny, hemoglobiny, triglicerydów i immunoglobulin nie dają fałszywie
dodatnich lub fałszywie ujemnych wyników w teście COBAS® AmpliPrep/
COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX). Badania na próbkach o podwyższonym
poziomie albuminy wykazały tendencję takich próbek do tworzenia skrzepów
przed rozpoczęciem procedury oznaczenia. W niektórych przypadkach skrzep
w próbkach przeszkadzał w przeniesieniu próbki do aparatu COBAS® AmpliPrep
i skutkował otrzymaniem nieważnych wyników. Patrz część Ograniczenia metody.
Leki egzogenne
Leki stosowane w leczeniu zakażeń HCV, HIV, HBV i CMV przebadano pod kątem
możliwości zakłócania testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0
(PCX). Interferencję badano przy braku leku (0X Cmax), a także dodając każdy lek
w trzech stężeniach (patrz tabela 6) oraz szczytowe stężenie każdego leku w osoczu
(1X Cmax) i trzykrotne szczytowe stężenie każdego leku w osoczu (3X Cmax) albo do
ludzkiego osocza o wyniku dodatnim dla HCV RNA (60 IU/ml, w pobliżu granicy
wykrywalności), albo do ludzkiego osocza o wyniku ujemnym dla HCV RNA.
Tabela 6
Podsumowanie badań interferencji leków egzogennych
Nr
Nazwa
handlowa leku
Nazwa
rodzajowa leku
Producent
1X
Cmax
3X
Cmax
Jednostka
1
CRIXIVAN®
Siarczan indynawiru
Merck & Co., Inc.
8,98
26,94
µg/ml
2
CYTOVENE®
Gancyklowir
Hoffmann-La Roche
1,18
3,54
µg/ml
3
Epivir® HBV
Lamiwudyna, 3TC
GlaxoSmithKline
1,5
4,5
µg/ml
4
FORTOVASE®
Sakwinawir
Hoffmann-La Roche
2,47
7,431
µg/ml
5
HIVID®
Zalcytabina, ddC
Hoffmann-La Roche
25,2
75,6
ng/ml
6
INFERGEN®
Interferon alfakon-1
AMGEN Inc.
0,3
0,9
ng/ml
7
INTRON® A
Interferon alfa-2b
Schering-Plough Corp.
273
819
IU/ml
8
INTRON® A/
REBETOL®
Interferon
alfa-2b/rybawiryna
Schering-Plough Corp.
3,68
11,04
µg/ml
9
NORVIR®
Rytonawir
Abbott Laboratories
11,2
33,6
µg/ml
10
Paxil®
Chlorowodorek paroksetyny
GlaxoSmithKline
61,7
185,1
ng/ml
11
PEGASYS®
Peginterferon alfa-2a
Hoffmann-La Roche
18
54
ng/ml
PROZAC®
Chlorowodorek fluoksetyny
Eli Lilly & Co.
12
13
RESCRIPTOR® Metanosulfonian delawirdyny Agouron Pharmaceuticals Inc.
302
906
ng/ml
19,3
57,9
µg/ml
14
Retrovir®
Zydowudyna
GlaxoSmithKline
1,06
3,18
µg/ml
15
ROFERON® A
Interferon alfa-2a
Hoffmann-La Roche
2,58
7,74
ng/ml
16
Symmetrel®
Chlorowodorek amantadyny
Endo Pharmaceuticals Inc.
0,51
1,53
µg/ml
17
VIDEX®
Didanozyna, ddI
Bristol-Myers Squibb Co.
2,32
6,96
µg/ml
18
VIRACEPT®
Metanosulfonian nelfinawiru
Agouron Pharmaceuticals Inc.
4
12
µg/ml
19
VIRAMUNE®
Newirapina
Roxane Laboratories, Inc.
4,5
13,5
µg/ml
20
ZADAXIN®
Tymozyna alfa 1
SciClone
100
300
ng/ml
21
ZERIT®
Stawudyna, d4T
Bristol-Myers Squibb Co.
4,15
12,45
µg/ml
22
ZOLOFT®
Chlorowodorek sertraliny
Pfizer Inc.
190,2
570,6
ng/ml
Próbki badano w trzech powtórzeniach. Leki badane w niniejszym badaniu nie
powodowały fałszywie ujemnych ani fałszywie dodatnich wyników. W teście
COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), przy każdym
stężeniu leku wszystkie próbki zawierające HCV dały dodatni wynik na obecność
HCV RNA, natomiast wszystkie próbki pozbawione HCV dały wynik ujemny. Leki
testowane w tym badaniu nie wpływają na zdolność testu COBAS® AmpliPrep/
01/2012, Revision 7.0
31/48
COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), do wykrycia HCV RNA. Z tego
względu test COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX),
można stosować do badania próbek pochodzących od pacjentów poddawanych
leczeniu za pomocą różnych środków zwalczających zakażenie HCV.
Zakażenia współistniejące z HCV
Próbki pochodzące od pacjentów z zakażeniami współistniejącymi dla HCV (HBV
i HIV) przebadano pod kątem możliwości zakłócania testu COBAS®
AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), przez te zakażenia. Badano
następujące serologicznie dodatnie próbki HCV/próbki ze współistniejącym
zakażeniem wirusowym: HIV/HCV (n = 7) i HIV/HBV/HCV (n = 2). Każdą
z próbek analizowano w trzech powtórzeniach, a do oceny próbek z wynikami testu
HCV RNA odbiegającymi od wyników badań serologicznych użyto testu COBAS®
AMPLICOR® HCV, v2.0. Dwie próbki seropozytywne dla HCV dały ujemny wynik
na obecność HCV RNA w teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR®
HCV, v2.0 (PCX): jedna próbka (1) HIV/HCV i jedna próbka (1) HIV/HBV/HCV.
Wyniki kontroli wewnętrznej dla każdej z próbek były dodatnie, co wskazuje brak
hamowania reakcji PCR i zgodność wyników testu ze specyfikacją. Dla obu próbek
wyniki badania za pomocą testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, były również
ujemne, co wskazywało na brak obecności HCV RNA. Równoczesne zakażenie
HBV i/lub HIV w próbkach seropozytywnych dla HCV nie wpływa na zdolność
testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), do wykrycia
HCV RNA. Wyniki zawarte są w tabeli 7.
Próbka w zakażeniu
współistniejącym (koinfekcja)**
1
2
HIV/HCV
HIV/HBV/HCV
Razem
Tabela 7
Wpływ zakażeń współistniejących z HCV
Próbki (n)
HCV RNA dodatni (n)
7
2
9
*6
*1
7
IC ważny (n)
7
2
9
*Dwie próbki, których wynik na obecność HCV w teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0
(PCX), był ujemny, dały również wynik ujemny na obecność HCV RNA przy użyciu testu COBAS® AMPLICOR®
HCV, v2.0 (test różnicujący).
**Zakażenia współistniejące w próbkach na podstawie wyników badań serologicznych.
Korelacja
32/48
Skuteczność w porównaniu z testem COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0
Skuteczość testów COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0,
i COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, porównano analizując próbki osocza
i surowicy od osób zakażonych HCV. Ogółem zbadano 137 próbek. Współczynnik
korelacji określono na podstawie próbek, dla których uzyskano jakościowe wyniki
zarówno za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR®, jak
i COBAS® AMPLICOR® HCV. Analizę odsetka trafień wykonano dla obu matryc,
a wyniki przedstawiono w tabeli 8. Wyniki uzyskane za pomocą testów COBAS®
AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, i COBAS® AMPLICOR® HCV,
v2.0, wykazały wysoki stopień korelacji dla każdej matrycy.
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Tabela 8
Korelacja między testem COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0,
a testem COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, dla próbek osocza i surowicy
pochodzących od chorych zakażonych HCV
Surowica
N = 70
CAP HCV
+
+
46
–
1*
–
0
23
CA HCV
EDTA
Osocze
N = 67
CAP HCV
+
+
60
–
1*
–
0
6
CA HCV
* Jedna próbka surowicy oraz jedna próbka osocza pobranego na EDTA nie zostały przeniesione do aparatu COBAS®
AmpliPrep z powodu skrzepnięcia próbki w probówce wejściowej. Nie była dostępna większa ilość materiału, aby móc
powtórzyć badanie.
Ocena kliniczna
Cele i metody
badania klinicznego
Przeprowadzono prospektywne badanie wieloośrodkowe w czterech centrach hepatologicznych w różnych regionach geograficznych Stanów Zjednoczonych,
mające na celu ocenę użyteczności klinicznej testu COBAS® AMPLICOR®
HCV, v2.0, w diagnostyce czynnego zakażenia HCV u pacjentów z objawami
biochemicznymi, klinicznymi i/lub histologicznymi choroby wątroby. Skuteczność
testu oceniano w porównaniu z dwoma badaniami standardowymi: i) badaniem
serologicznym anty-HCV oraz ii) skojarzeniem badań serologicznych anty-HCV,
poziomów ALAT w surowicy i badania histologicznego wątroby.
Oceniano dwie populacje chorych:
1.
„Grupa ogólna”. Chorzy badani pod kątem zakażenia HCV i/lub schorzenia
wątroby, którzy nie byli uprzednio leczeni z powodu zakażenia HCV i nie byli
poddani przeszczepowi wątroby.
2.
„Grupa uprzednio leczona”. Chorzy uprzednio leczeni z powodu zakażenia
HCV, którzy nie byli poddani przeszczepowi wątroby. Chorych leczonych
w ciągu 6 miesięcy od prowadzonego badania przesiewowego przy użyciu
leków przeciwwirusowych wykluczano z badania.
Lekarze oceniający chorych odnotowywali rozpoznanie kliniczne (kategorie
obejmowały przewlekłe zakażenie HCV, alkoholową chorobę wątroby, pierwotną
marskość żółciową itp.) na podstawie wywiadu chorobowego, badania fizykalnego
i wyników badań laboratoryjnych przed włączeniem do badania. W czasie badania
przesiewowego w wielu przypadkach osoby prowadzące badanie miały dostęp do
wyników badań serologicznych anty-HCV, nie znały natomiast wyników badań
w kierunku HCV RNA. U wszystkich chorych oznaczano aktywność transaminazy
alaninowej (ALAT) w surowicy. Jeżeli w przeszłości wykonywano badanie
histologiczne wątroby, uzyskiwano kopie wyników tego badania.
Do oznaczenia HCV RNA przy użyciu testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0,
oraz przeciwciał anty-HCV przy użyciu enzymatycznych badań immunologicznych
(anty-HCV EIA) pobierano próbki surowicy i/lub osocza z dodatkiem EDTA.
Wszystkie próbki wykazujące wielokrotnie dodatni wynik testu anty-HCV EIA
badano dodatkowo za pomocą testu typu RIBA. Badania przy użyciu testu RIBA
wykonywano na próbkach wykazujących dodatni wynik w teście EIA. Testu RIBA
nie wykonywano na próbkach wykazujących ujemny wynik testu EIA. Wyniki testu
anty-HCV EIA oraz RIBA interpretowano zgodnie z instrukcją dołączoną przez
producenta. Wyniki oznaczeń COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, interpretowano
na podstawie instrukcji użytkowania.
01/2012, Revision 7.0
33/48
Wyniki testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, porównywano z wynikami badań
serologicznych anty-HCV EIA i testu RIBA. W podgrupie chorych, dla których
dostępne były wyniki badań histologicznych wątroby, wyniki testu COBAS®
AMPLICOR® HCV, v2.0, oceniano dodatkowo na podstawie badań serologicznych
anty-HCV, poziomów transaminazy alaninowej (ALAT) w surowicy i wyników
badań histologicznych wątroby.
Wyniki badania
klinicznego
Łącznie uzyskano 1038 próbek od 848 chorych zakwalifikowanych do badania. Średni
wiek chorych wynosił 46 lat, mężczyźni stanowili 54,5%, a 71,8% populacji
należało do rasy białej. Powodem zgłoszenia się do kliniki hepatologicznej było
wcześniejsze rozpoznanie HCV (40,2%), badania w kierunku HCV (34,7%) oraz
badania w kierunku schorzenia wątroby (25,8%). Średnia wartość ALAT u chorych
zakwalifikowanych do badania wynosiła 95,5 IU/ml (zakres 7–668 IU/ml), wyniki
badania histologicznego dostępne były u 51,7% chorych, a 18,2% leczono uprzednio
z powodu HCV, przy czym leczenie zakończono co najmniej 6 miesięcy przed
przystąpieniem do badania. Rozpoznania kliniczne w chwili włączenia do badania
obejmowały przewlekłe zakażenie HCV (72,9%), autoimmunologiczne zapalenie
wątroby (2,2%), alkoholową chorobę wątroby (5,5%), przewlekłe zakażenie
wirusem zapalenia wątroby typu B (4,4%), pierwotną marskość żółciowa (5,3%),
a u 13,7% chorych stwierdzano inne rozpoznanie.
Liczbę, rodzaj i warunki przechowywania próbek ocenianych w trakcie badania
i zebrano w tabeli 9.
Tabela 9
Test COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0: liczba, rodzaje i warunki
przechowywania próbek uzyskanych w ośrodkach biorących udział w badaniu
Typ próbki
Ośrodek 1 Ośrodek 2 Ośrodek 3 Ośrodek 4
Razem
Surowica (od -20 do -80°C)
101
321
228
158
808
Surowica (od 2°C do 8°C)
35
0
35
0
70
EDTA (od -20°C do –80°C)
Łącznie
0
0
35
125
160
136
321
298
283
1038
Skuteczność kliniczna
w porównaniu z badaniem
serologicznym anty-HCV Skuteczność testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, w porównaniu ze skutecznością
badania serologicznego anty-HCV była podobna we wszystkich czterech ośrodkach
badawczych. W tabeli 10 podsumowane te dane dla wszystkich czterech ośrodków
biorących udział w badaniu. Tabela ta zawiera wyniki dotyczące surowicy i osocza
pobranego na EDTA dla grupy ogólnej oraz dla grupy pacjentów uprzednio
leczonych.
34/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Tabela 10
Wyniki testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, w surowicy i osoczu pobranym na EDTA w porównaniu
z badaniami serologicznymi anty-HCV ogólnej grupy chorych oraz grupy chorych uprzednio leczonych
Surowica
Wyniki badania
serologicznego
Wynik PCR dodatni Wynik PCR ujemny
(liczba próbek)
(liczba próbek)
Osocze pobrane na EDTA
Odsetek wyników
zgodnych z wynikiem EIA
Wynik PCR dodatni Wynik PCR ujemny
(liczba próbek)
(liczba próbek)
(%) (przedział ufności 95%)*
Odsetek wyników
Ogólna grupa pacjentów
EIA+/RIBA +
437
21
95,4 (93,08; 97,14)
89
5
94,7 (88,02; 98,25)
EIA+/RIBA IND
16
10
61,5 (40,57; 79,77)
2
2
50,0 (6,76; 93,24)
EIA+/RIBA –
0
1
0 (0; 97,50)
0
0
EIA –
3¥
217
98,6 (96,07; 99,72)
1
24
96,0 (79,65; 99,90)
83,8 (67,99; 93,81)
Grupa pacjentów uprzednio leczonych
EIA+/RIBA +
148
11
93,1 (87,96; 96,50)
31
6
EIA+/RIBA IND
3
0
100,0 (29,24; 100,0)
0
0
EIA+/RIBA –
0
0
0
0
EIA –
0
0
0
0
* Granice ufności na podstawie dokładnej metody dwumianowej
¥ Jedna dodatkowa próbka w badaniu wykazywała początkowo niejednoznaczny wynik, który po ponownym zbadaniu w dwukrotnym
powtórzeniu okazał się być pozytywny w PCR (powtórzony wynik 1 = negatywny, powtórzony wynik 2 = niejednoznaczny).
Spośród chorych w obu grupach z dodatnim wynikiem badania EIA potwierdzonym
testem RIBA, w większości (84–95%) próbek stwierdzono HCV RNA dla obu
matryc próbek. U chorych w grupie ogólnej wykryto HCV RNA odpowiednio u 62%
i 50% próbek surowicy i osocza pobranego na EDTA oraz u żadnego z leczonych
uprzednio chorych z niejednoznacznym wynikiem badania serologicznego RIBA.
Wszyscy chorzy z ujemnym wynikiem testu EIA należeli do grupy ogólnej,
a w większości tych próbek (odpowiednio 99% i 96% dla surowicy i osocza
pobranego na EDTA) wynik badania w kierunku HCV RNA był ujemny. Dlatego też
stwierdzono dobrą korelację między testem COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0,
i wynikami badań serologicznych anty-HCV dla surowicy i osocza pobranego na
EDTA zarówno w ogólnej grupie chorych, jak i w grupie chorych uprzednio
leczonych.
Skuteczność kliniczna
w porównaniu z wynikami
badań serologicznych,
biochemicznych
i histologicznych
Skuteczność testów COBAS® AMPLICOR® i AMPLICOR® badano następnie
w porównaniu z badaniami serologicznymi anty-HCV, stężeniem aminotransferazy alaninowej w surowicy (ALAT) oraz badaniem histologicznym
wątroby. Dane z porównania skuteczności testu COBAS® AMPLICOR® HCV,
v2.0, ze skutecznością badań serologicznych, biochemicznych i histologicznych
przedstawiono w tabeli 11.
01/2012, Revision 7.0
35/48
Tabela 11
Wyniki testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, w porównaniu z wynikami badań serologicznych,
biochemicznych i histologicznych w surowicy i osoczu pobranym na EDTA — grupa ogólna
Surowica
Wyniki badania
serologicznego
Wynik PCR
Wynik PCR
Odsetek wyników
Wynik PCR
Wynik PCR
Odsetek wyników
dodatni
ujemny
dodatni
ujemny
(liczba próbek) (liczba próbek) (%) (przedział ufności 95%)* (liczba próbek) (liczba próbek)
Podwyższone stężenie ALAT i zapalenie wątroby stwierdzone w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
162
2
98,8 (95,67; 99,85)
21
0
100,0 (83,89; 100,0)
EIA+/RIBA IND
4
0
100,0 (39,76; 100,0)
1
0
100,0 (2,50; 100,0)
EIA+/RIBA –
0
0
0
0
EIA –
0
16
0
1
100,0 (79,41; 100,0)
100,0 (2,50; 100,0)
Prawidłowe stężenie ALAT i zapalenie wątroby stwierdzone w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
57
0
100,0 (93,73; 100,0)
10
0
EIA+/RIBA IND
1
0
100,0 (2,50; 100,0)
0
0
EIA+/RIBA –
0
0
0
0
EIA –
0
9
0
0
100,0 (66,37; 100,0)
100,0 (69,15; 100,0)
Podwyższone stężenie ALAT i brak zapalenia wątroby stwierdzonego w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
3
1
EIA+/RIBA IND
0
EIA+/RIBA –
EIA –
75;0 (19,41; 99,37)
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
28
0
0
96,6 (82,24; 99,91)
100,0 (2,50; 100,0)
Prawidłowe stężenie ALAT i brak zapalenia wątroby stwierdzonego w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
1
2
33,3 (0,84; 90,57)
0
0
EIA+/RIBA IND
1
0
100,0 (2,50; 100,0)
0
0
EIA+/RIBA –
0
0
0
0
EIA –
1
32
0
1
97,0 (84,24; 99,92)
100,0 (2,50; 100,0)
* Granice ufności na podstawie dokładnej metody dwumianowej
Wśród chorych w grupie ogólnej z podwyższonymi poziomami ALAT i cechami
zapalenia wątroby w badaniu histologicznym, u których stwierdzono dodatnie
wyniki testów anty-HCV EIA i RIBA, HCV RNA, wykryto odpowiednio w 98,8%
i 100% dla surowicy i osocza pobranego na EDTA. HCV RNA wykryto w 100%
próbek surowicy i osocza pobranego na EDTA z dodatnim wynikiem testu EIA oraz
niejednoznacznym wynikiem testu RIBA. U 100% chorych w tej grupie, u których
stwierdzono ujemny wynik testu EIA, w surowicy ani osoczu EDTA nie wykryto
HCV RNA. Wprawdzie w tej grupie chorych z ujemnym wynikiem testu EIA
stwierdzano zapalenie wątroby w badaniu histologicznym, jednak jego cechy nie
były charakterystyczne dla HCV, tylko sugerowały autoimmunologiczne zapalenie
wątroby, zmiany wywołane wirusem zapalenia wątroby typu B lub nieswoiste
zmiany zapalne wątroby.
Wśród chorych w grupie ogólnej z prawidłowymi poziomami ALAT i cechami
histologicznymi zapalenia wątroby wykryto HCV RNA w 100% próbek surowicy
i osocza pobranego na EDTA w przypadku dodatnich wyników testu EIA
potwierdzonych testem RIBA. W 100% próbek surowicy w przypadku ujemnych
wyników testu EIA nie stwierdzono HCV RNA. Brak było próbek osocza pobranego
36/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
na EDTA od chorych z tej kategorii. HCV RNA wykryto w surowicy jednego chorego
z dodatnim wynikiem testu EIA i niejednoznacznym wynikiem testu RIBA. Cechy
histologiczne zapalenia wątroby u chorych z ujemnym wynikiem testu EIA również
sugerowały schorzenia inne niż zakażenie HCV.
Wśród chorych z podwyższonymi poziomami ALAT i brakiem cech zapalenia
wątroby w badaniu histologicznym wykryto HCV RNA w 75% próbek surowicy
i 100% próbek osocza pobranego na EDTA w przypadku dodatnich wyników testu
EIA potwierdzonych testem RIBA. Ujemny wynik testu EIA stwierdzono
u większości (29/33 lub 88%) chorych w tej kategorii, gdzie schorzenie wątroby
(tj. podwyższony ALAT) spowodowane było przez czynniki inne niż zapalenie
wątroby. W powyższych przypadkach z ujemnym wynikiem testu EIA, HCV RNA
nie wykryto w 96,6% próbek surowicy. W tej kategorii chorych brak było próbek
osocza pobranego na EDTA. W tej kategorii brak było chorych z pozytywnym
wynikiem testu EIA i niejednoznacznym wynikiem testu RIBA.
Wśród chorych, u których poziom ALAT był prawidłowy, a w badaniu
histologicznym nie stwierdzono cech zapalenia wątroby, większość przypadków
wykazywała ujemny wynik testu anty-HCV EIA. W tej kategorii stwierdzono trzy
przypadki dodatnich wyników testu EIA potwierdzonych w teście RIBA. Osocze
EDTA nie było dostępne w żadnym z powyższych przypadków, a HCV RNA
wykryto w surowicy jednego (33,3%) chorego. HCV RNA nie wykryto u 97,0%
chorych w tej kategorii z ujemnym wynikiem testu EIA, dla których dostępne były
próbki surowicy. Mimo cech schorzenia wątroby stwierdzonych w badaniu
histologicznym u tych chorych nie były one charakterystyczne dla zapalenia
wątroby. HCV RNA wykryto w jednej próbce surowicy, w której wynik testu EIA
był dodatni, a wynik testu RIBA był niejednoznaczny.
Dane porównujące wyniki testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, z wynikami
badań serologicznych, biochemicznych i histologicznych dla surowicy i osocza
pobranego na EDTA w grupie uprzednio leczonych chorych zebrano w tabeli 12.
01/2012, Revision 7.0
37/48
Tabela 12
Wyniki testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, w porównaniu z wynikami badań serologicznych,
biochemicznych i histologicznych w surowicy i osoczu pobranym na EDTA — grupa uprzednio leczona
Surowica
Wyniki badania
serologicznego
Wynik PCR
Wynik PCR
Odsetek wyników
dodatni
ujemny
(liczba próbek)
(liczba próbek)
Wynik PCR
Wynik PCR
Odsetek wyników
dodatni
ujemny
(liczba próbek) (liczba próbek) (%) (przedział ufności 95%)*
Podwyższone stężenie ALAT i zapalenie wątroby stwierdzone w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
82
2
97,6 (91,66;
16
1
0
0
94,1 (71,31; 99,85)
99,71)
EIA+/RIBA IND
3
0
EIA+/RIBA –
0
0
0
0
0
0
0
0
EIA –
100,0 (2,50; 100,0)
Prawidłowe stężenie ALAT i zapalenie wątroby stwierdzone w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
22
4
84,6 (65,13;
3
2
60,0 (14,66; 94,73)
95,64)
EIA+/RIBA IND
0
0
0
0
EIA+/RIBA –
0
0
0
0
EIA –
0
0
0
0
Podwyższone stężenie ALAT i brak zapalenia wątroby stwierdzonego w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
2
1
66,7 (9,43;
1
0
100,0 (2,50; 100,0)
99,16)
EIA+/RIBA IND
0
0
0
0
EIA+/RIBA –
0
0
0
0
EIA –
0
0
0
0
Prawidłowe stężenie ALAT i brak zapalenia wątroby stwierdzonego w badaniu histologicznym
EIA+/RIBA +
2
0
100,0 (15,81;
1
0
100,0 (2,50; 100,0)
100,0)
EIA+/RIBA IND
0
0
0
0
EIA+/RIBA –
0
0
0
0
EIA –
0
0
0
0
*Granice ufności na podstawie dokładnej metody dwumianowej
U żadnego chorego w grupie uprzednio leczonej nie stwierdzono ujemnego wyniku
testu EIA; wszystkie próbki od chorych w tej kategorii wykazywały dodatni wynik
testu anty-HCV EIA.
Wśród leczonych uprzednio chorych z podwyższonymi poziomami ALAT i cechami
histologicznymi zapalenia wątroby HCV RNA wykryto odpowiednio w 97,6%
i 94,1% próbek surowicy i osocza pobranego na EDTA w przypadku dodatnich
wyników testu EIA potwierdzonych testem RIBA. HCV RNA wykryto we
wszystkich trzech (100%) surowicach wykazujących pozytywny wynik testu EIA,
u których wynik testu RIBA był niejednoznaczny.
38/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Wśród leczonych uprzednio chorych z prawidłowymi poziomami ALAT i cechami
histologicznymi zapalenia wątroby HCV RNA wykryto odpowiednio w 84,6%
i 60% próbek surowicy i osocza pobranego na EDTA w przypadku dodatnich
wyników testu EIA potwierdzonych testem RIBA.
HCV RNA wykryto odpowiednio w 66,7% i 100% próbek surowicy i osocza
pobranego na EDTA w przypadku dodatnich wyników testu EIA potwierdzonych
testem RIBA u chorych z podwyższonym poziomem ALAT i brakiem cech
histologicznych zapalenia wątroby.
HCV RNA wykryto w 100% próbek surowicy i osocza pobranego na EDTA
z dodatnim wynikiem testu EIA potwierdzonym testem RIBA u chorych
z prawidłowymi poziomami ALAT i brakiem cech histologicznych zapalenia
wątroby.
Podsumowanie
i wnioski
Badanie testu COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, wykazało, że test ten charakteryzuje
się wysokim stopniem korelacji w porównaniu z badaniami serologicznymi antyHCV w grupie ogólnej pacjentów oraz w grupie pacjentów uprzednio leczonych
zarówno dla surowicy, jak i dla osocza pobranego na EDTA.
Stwierdzono również wysoki stopień zgodności testu COBAS® AMPLICOR®
HCV, v2.0, w porównaniu z wynikami badań serologicznych, biochemicznych
i histologicznych w ogólnej grupie chorych i grupie chorych uprzednio leczonych
zarówno w surowicy, jak i osoczu pobranym na EDTA.
Ogólne wyniki badania wskazują, że test COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0, ma
kliniczną wartość diagnostyczną u chorych badanych w kierunku zakażenia HCV
i/lub schorzenia wątroby. Badania te są użyteczne, aby potwierdzić rozpoznanie
czynnego zakażenia HCV.
01/2012, Revision 7.0
39/48
Powtarzalność
Aby ocenić powtarzalność wyników testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), badano dwa panele czteroelementowe próbek:
jeden przygotowany w surowicy, a drugi w osoczu pobranym na EDTA. Panele
próbek przechowywano zamrożone w temperaturze -80°C. Próbki przygotowano ze
standardowego odczynnika HCV Secondary Standard o genotypie 1, rozcieńczając
go tak, aby otrzymać nominalne stężenia HCV RNA równe 0, 10, 20 i 50 IU/ml.
Powtarzalność oceniano dla różnych cykli pracy (operator/aparaty), serii
odczynników i matryc. Każda matryca była badana przez obu z dwóch operatorów
przy użyciu jednej serii odczynników PCX. Każdy operator wykonywał badania
przez okres 5 dni przy użyciu każdej z trzech serii odczynników. Każdego dnia
każdy z operatorów poddawał obróbce 5 powtórzeń każdego z elementów panelu
próbek osocza pobranego na EDTA i surowicy.
Uzyskane w tym badaniu 1200 wyników zebrano w tabeli 13 (w przypadku próbek
osocza pobranego na EDTA) oraz w tabeli 14 (w przypadku próbek surowicy).
Ujemne wyniki uzyskano w 100% spośród 150 próbek każdej matrycy pozbawionych
HCV RNA; wyniki ogólne oraz wszystkie zmienne dla danego dnia przedstawiono
w tabelach 13.A, 13.C, 14.A i 14.C. Badanie wykazało całkowitą powtarzalność
wyników jakościowych dla próbek pozbawionych HCV RNA.
Powtarzalność dla próbek zawierających HCV RNA poddano również ocenie,
porównując częstość występowania wyników dodatnich dla zmiennych w ciągu
danego dnia (tabele 13.B, 14.B i 15). W tabeli 15 podsumowano dodatnie wyniki
badania próbek zawierających HCV RNA dla różnych matryc. Dla każdego stężenia
HCV RNA wszystkie przedziały ufności nakładały się dla każdej zmiennej. Dlatego
obserwowane różnice między częstością występowania wyników dodatnich
w obrębie zmiennej dla określonego stężenia HCV RNA są prawdopodobnie
losowe. Powyższe wyniki wskazują na powtarzalność dla próbek zawierających
HCV RNA.
Zarówno dla próbek osocza pobranego na EDTA jak i dla próbek surowicy
przedziały częstości występowania wyników dodatnich są najwęższe (najwyższa
powtarzalność) przy najwyższym stężeniu (50 IU/ml) HCV RNA. Spośród
wszystkich próbek zarówno osocza pobranego na EDTA jak i próbek surowicy
najszersze przedziały częstości występowania wyników dodatnich (najniższa
powtarzalność) uzyskano przy najniższym stężeniu HCV RNA (10 IU/ml). Dla
każdego stężenia HCV RNA przedziały częstości występowania wyników dodatnich
dla różnych matryc odbiegają od siebie o ≤ 2%, wskazując na wysoką powtarzalność
pomiędzy wynikami testów przeprowadzonych na próbkach osocza pobranego na
EDTA oraz próbkach surowicy.
Dane te świadczą o powtarzalności wyników testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX), dla różnych serii odczynników, cykli pracy aparatu
i matryc próbek.
40/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Tabela 13
Powtarzalność wyników: Próbki osocza pobranego na EDTA
A. Ogólne częstości wyników
Wyniki testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX)
Obszar niejednoznaczny
Strefa dodatnia
(A660 ≥ 1,0)
(0,15 ≤ A660 < 1,0)
HCV RNA
Liczba
IU/ml
50
20
10
badanych
149
150
149
0
150
Nr
%
0
0%
0
0%
1
0.7%
Strefa dwuznaczna
0
Nr
148
141
121
0%
150
%
CI
99,3%
96,3–100%
94%
88,9–97,2%
80,7%
74–87,1%
Strefa ujemna
(A660 < 0,15)
100
98–100%
B. Zmienne w badaniu: częstości wyników dodatnich (A660 ≥ 1,0) dla próbek zawierających
HCV RNA
Między seriami odczynników
HCV RNA
IU/ml
Pomiędzy przebiegami testowymi
Seria
Nr/liczba
badanych
%
95% CI
Seria
Nr/liczba
badanych
%
95% CI
50
1
2
3
50/50
48/49
50/50
100%
98%
100%
94,2–100%
89,1–100%
94,2–100%
1
2
3
4
5
30/30
28/29
30/30
30/30
30/30
100%
96,6%
100%
100%
100%
90,5–100%
82,2–99,9%
90,5–100%
90,5–100%
90,5–100%
20
1
2
3
48/50
45/50
48/50
96%
90%
96%
86,3–99,5%
78,2–96,7%
86,3–99,5%
1
2
3
4
5
30/30
30/30
29/30
28/30
29/30
100%
100%
96,7%
93,3%
96,7%
90,5–100%
90,5–100%
82,8–99,9%
77,9–99,2%
82,8–99,9%
10
1
2
3
41/50
37/49
43/50
82%
76%
86%
68,6–91,4%
61,1–86,7%
73,2–94,2%
1
2
3
4
5
27/30
23/30
23/29
24/30
24/30
90%
76,7%
79,3%
80%
80%
73,5–97,9%
57,7–90,1%
60,3–92%
61,4–92,3%
61,4–92,3%
01/2012, Revision 7.0
41/48
C. Zmienne w badaniu: częstości wyników ujemnych (A660 < 0,15) dla próbek niezawierających
HCV RNA
Nie
HCV RNA
Seria
Nr/liczba
badanych
%
95% CI
Seria
Nr/liczba
badanych
%
95% CI
1
2
3
50/50
50/50
50/50
100%
100%
100%
0–11,3%
0–11,3%
0–11,3%
1
2
3
4
5
30/30
30/30
30/30
30/30
30/30
100%
100%
100%
100%
100%
90,5–100%
90,5–100%
90,5–100%
90,5–100%
90,5–100%
Tabela 14
Powtarzalność wyników: próbki surowicy
A. Ogólne częstości wyników
HCV RNA
Liczba
IU/ml
50
20
10
badanych
150
150
150
0
150
42/48
Wyniki testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HCV, v2.0 (PCX)
Obszar niejednoznaczny
Strefa dodatnia
(A660 ≥ 1,0)
(0,15 ≤ A660 < 1,0)
Nr
%
2
1,3%
0
0%
1
0,7%
Strefa dwuznaczna
0
0%
Nr
146
142
124
150
%
CI
97,3%
93,3–99,3%
94,7%
88,9–97,7%
82,7%
75,6–88,3%
Strefa ujemna
(A660 < 0,15)
100
98–100%
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
B. Zmienne w badaniu: częstości wyników dodatnich (A660 ≥ 1,0) dla próbek zawierających
HCV RNA
HCV RNA
IU/ml
Seria
Nr/liczba
badanych
%
95% CI
Seria
Nr/liczba
badanych
%
95% CI
50
1
2
3
48/50
49/50
49/50
96%
98%
98%
86,3–99,5%
89,1–100%
89,1–100%
1
2
3
4
5
30/30
29/30
30/30
30/30
28/30
100%
96,7%
100%
100%
93,3%
90,5–100%
82,8–99,9%
90,5–100%
90,5–100%
77,9–99,2%
20
1
2
3
46/50
49/50
47/50
92%
98%
94%
80,8–97,8%
89,1–100%
83,4–98,7%
1
2
3
4
5
27/30
27/30
29/30
29/30
29/30
90%
90%
96,7%
96,7%
96,7%
73,5–97,9%
73,5–97,9%
82,8–99,9%
82,8–99,9%
82,8–99,9%
10
1
2
3
44/50
42/50
38/50
88%
84%
76%
75,7–95,5%
70,9–92,8%
61,9–87%
1
2
3
4
5
24/30
27/30
26/30
23/30
23/30
80%
90%
86,7%
76,7%
76,7%
61,4–92,3%
73,5–97,9%
69,3–96,2%
57,7–90,1%
57,7–90,1%
C. Zmienne w obrębie badania: częstości wyników ujemnych (A660 < 0,15) dla próbek
niezawierających HCV RNA
Nie
HCV RNA
01/2012, Revision 7.0
Seria
Nr/liczba
badanych
%
95% CI
Seria
Nr/liczba
badanych
%
95% CI
1
2
3
50/50
50/50
50/50
100%
100%
100%
0–11,3%
0–11,3%
0–11,3%
1
2
3
4
5
30/30
30/30
30/30
30/30
30/30
100%
100%
100%
100%
100%
90,5–100%
90,5–100%
90,5–100%
90,5–100%
90,5–100%
43/48
Tabela 15
Zmienność w obrębie matryc: częstości wyników dodatnich (A660 ≥ 1,0)
dla próbek zawierających HCV RNA
Między macierzami
HCV RNA
IU/ml
50
20
Macierz
Osocze pobrane na EDTA 148/149
95% CI
96,3–100%
93,3–99,3%
Surowica
146/150
141/150
142/150
94%
94,7%
88,9–97,2%
89,8–97,7%
121/150
124/150
80,7%
82,7%
74–87,1%
75,6–88,3%
Surowica
44/48
%
99,3%
97,3%
Surowica
10
Nr/liczba
badanych
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Piśmiennictwo
1.
Lauer, G.M. and Walker, B.D. 2001. Hepatitis C virus Infection. N Engl J
Med 345:41-52.
2.
Choo, Q-L., Weiner, A.J., Overby, L.R. et al. 1990. Hepatitis C Virus: The
major causative agent of viral non-a, non-b hepatitis. British Medical
Bulletin 46:423-441.
3.
Consensus Statement. AFEF Conference on Treatment of Hepatitis C. Paris.
February 27-28, 2002.
4.
Gretch, D.R. 1996. Diagnostic tests for hepatitis C. Hepatology 26 (suppl.
1): 43S-47S.
5.
Schiff, E.R., M. de Medina and R.S. Kahn. 1999. New Perspectives in the
Diagnosis of Hepatitis C. Seminars In Liver Disease 19 (suppl.1): 3-15.
6.
Lok, A.S. and N.T. Gunaratnam. 1997. Diagnosis of hepatitis C. Hepatology
26 (suppl.1): 48S-56S.
7.
Damen, M., H.L. Zaaijer, H.T. Cuypers, H. Vrielink, C.L. van der Poel, H.W.
Reesink and P.N. Lelie. 1995. Reliability of the third-generation recombinant
immunoblot assay for hepatitis C virus. Transfusion 35: 745-749.
8.
NIH. 1997. Management of Hepatitis C. National Institutes of Health
Consensus Development Conference Statement #105.
9.
1998. Recommendations for Prevention and Control of Hepatitis C Virus (HCV)
Infection and HCV-Related Chronic Disease. MMWR, Vol. 47, No. RR-19.
10. Pawlotsky, J-M, A. Bastie, C. Pellet, J. Remire, F. Darthuy, L. Wolfe, C.
Sayada, J. Duval and D. Dhumeaux. 1996. Significance of Indeterminate
Third-Generation Hepatitis C Virus Recombinant Immunoblot Assay. Journal
of Clinical Microbiology. 34: 80-83.
11. Lu, R.H., S.J. Hwang, C.Y. Chan, F.Y. Chang and S.D. Lee. 1998.
Quantitative measurement of serum HCV RNA in patients with chronic
hepatitis C: comparison between AMPLICOR HCV monitor system and
branched DNA signal amplification assay. Journal of Clinical Laboratory
Analysis 12: 121-125.
12. Gretch, D., D. de la Rosa, L. Corey and R. Carithers. 1996. Assessment of
hepatitis C viremia using molecular amplification technologies. Viral
Hepatitis Reviews 2: 85-96.
13. Young, K.Y., Resnick, R. and Myers, T.W. 1993. Detection of hepatitis C
virus RNA by a combined reverse transcriptase-polymerase chain reaction
assay. Journal of Clinical Microbiology 31:882-886.
01/2012, Revision 7.0
45/48
14. Myers, T.W. and Gelfand, D.H. 1991. Reverse transcription and DNA
amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry
30:7661-7666.
15. Stuyver, L., Rossau, R., Wyseur, A. et al. 1993. Typing hepatitis C virus
isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay.
Journal of General Virology 74:1093-1102.
16. Machida, A., Ohnuma, H., Tsuda, F. et al. 1992. Two distinct subtypes of
hepatitis C virus defined by antibodies directed to the putative core protein.
Hepatology 16:886-891.
17. Bukh, J. R. Purcell and R. Miller. 1992. Importance of primer selection for
the detection of hepatitis C virus RNA with the polymerase chain reaction
assay. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89: 187-191.
18. Bukh, J., Purcell, R.H. and Miller, R.H. 1992. Sequence analysis of the 5’
noncoding region of hepatitis C virus. Proceedings of the National Academy
of Sciences, USA 89:4942-4946.
19. Okamoto, H., Okada, S., Sugiyama, Y. et al. 1990. The 5’-terminal sequence
of hepatitis C virus genome. Japanese Journal of Experimental Medicine
60:167-177.
20. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain
reactions. Gene 93:125-128.
21. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999 Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
22. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory
Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third
Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2007.
23. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st
Edition. 2000. 704 pp.
24. Saldanha, J., Lelie, N., Heath, A. and the WHO Collaborative Study Group.
1999. Establishment of the First International Standard for Nucleic Acid
Amplification Technology (NAT) Assays for HCV RNA. Vox Sanguinis
76:149-158.
46/48
01/2012, Revision 7.0
HCV, v2.0
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 7.0
01/2012
Dokonano zmiany rozdziału KONTROLA JAKOŚCI polegającej na usunięciu
tekstu pod nagłówkami Kontrola ujemna i Kontrola dodatnia i zastąpieniu go
tabelami dla przejrzystości wyników kontroli wewnętrznej.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z miejscowym
przedstawicielstwem firmy Roche.
"
Distributed by
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
Członek Grupy Roche
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics
2, Avenue de Vercors
38240 Meylan, France
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
ROCHE, CYTOVENE, FORTOVASE, HIVID, PEGASYS, ROFERON,
AMPLICOR, AMPERASE, AMPLILINK, COBAS, COBAS P, TAQMAN oraz
AMPLIPREP są znakami towarowymi firmy Roche.
Armored RNA jest nazwą opatentowanej technologii, opracowanej wspólnie
przez firmę Ambion, Inc. oraz firmę Cenetron Diagnostics LLC. Produkt jest
chroniony patentami zarejestrowanymi w USA pod numerami: 5,677,124,
5,919,625 oraz 5,939,262, a także patentami zgłoszonymi w trakcie rejestracji.
ARMORED RNA jest znakiem towarowym firm Ambion oraz Cenetron.
CRIXIVAN jest znakiem towarowym firmy Merck & Co., Inc.
Cząsteczki paramagnetyczne Dynabeads są przedmiotem licencji od właściciela
patentów firmy Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia. DYNABEADS jest
znakiem towarowym firmy Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia, na który
udzielono licencji firmie Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana.
01/2012, Revision 7.0
47/48
EPIVIR, PAXIL oraz RETROVIR są znakami towarowymi firmy GlaxoSmithKline.
EPPENDORF MULTIPETTE i EPPENDORF COMBITIP są znakami
towarowymi firmy Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Niemcy.
INFERGEN jest znakiem towarowym firmy Amgen, Inc.
INTRON A i INTRON A/REBETOL są znakami towarowymi firmy ScheringPlough Corporation.
MICROSOFT, WINDOWS NT oraz WINDOWS są znakami towarowymi firmy
Microsoft Corporation na terenie USA i/lub innych krajów.
NORVIR jest znakiem towarowym firmy Abbott Laboratories.
PROCLIN jest znakiem towarowym firmy Rohm and Haas Company.
PROZAC jest znakiem towarowym firmy Eli Lilly and Company.
RESCRIPTOR i VIRACEPT są znakami towarowymi firmy Agouron
Pharmaceuticals Inc.
SST jest znakiem towarowym firmy Becton Dickinson and Company.
SYMMETREL jest znakiem towarowym firmy Endo Pharmaceuticals, Inc.
VIDEX i ZERIT są znakami towarowymi firmy Bristol-Myers Squibb Company
lub jednego z jej oddziałów lub filii.
VIRAMUNE jest znakiem towarowym firmy Roxane Laboratories, Inc.
ZADAXIN jest znakiem towarowym firmy SciClone Pharmaceuticals, Inc.
ZOLOFT jest znakiem towarowym firmy Pfizer, Inc., jej filii, firm zależnych lub
firm udzielających jej licencji bądź partnerów spółek joint venture.
© 2012 Roche Molecular Systems, Inc.
Wszelkie prawa zastrzeżone.
01/2012
(03576248001-07ENGL)
05230306049-04
48/48
01/2012, Revision 7.0

COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0

Transkrypt

Podobne dokumenty

ANTY—HCV - PSSE Kwidzyn

plakat kopia_DUKE - Fundacja Gwiazda Nadziei

Jesień dla zdrowia - Pomoc w Zdrowiu i Chorobie

Ulotka, str. 1

Zaproszenie - HCV jestem świadom

Generuj PDF - Centralny Szpital Kliniczny MSWiA

Zatrzymaj cichego zabójcę, zbadaj się bezpłatnie w Przychodni przy