Autoreferat M. Czyżniejewski

Instytut Genetyki Roślin
Polskiej Akademii Nauk
Mariusz Czyżniejewski
Zmiany profili metabolitów wybranych traw z kompleksu Lolium-Festuca w odpowiedzi na
stresy abiotyczne
AUTOREFERAT
Praca doktorska wykonana pod kierunkiem
prof. dra hab. Piotra Kachlickiego
w Instytucie Genetyki Roślin, Polskiej Akademii Nauk
Poznań, 2016
1
1. Streszczenie
Trawy pastewne stanowią ważną agronomicznie i zróżnicowaną grupę roślin. Są
wykorzystywane jako pasze dla bydła, które stanowi dla nas cenne źródło białka (mięso, mleko)
i wapnia (mleko). Zmieniające się warunki klimatyczne, w tym coraz częstsze okresy suszy i
bezśnieżne zimy, oraz rosnąca populacja ludzka sprawiają, że rolnictwo staje przed wyzwaniem
pozyskania nowych gatunków traw pastewnych o wysokiej tolerancji na zmieniające się
warunki klimatyczne oraz wysokiej wartości paszowej. Do uzyskania roślin o pożądanych
cechach świetnie nadają się obcopylne trawy z kompleksu Lolium-Festuca, które stosunkowo
łatwo tworzą mieszańce międzyrodzajowe, łączące wysoką tolerancję na różne czynniki
stresowe, charakterystyczną dla roślin z rodzaju Festuca, z dobrymi parametrami paszowymi,
charakterystycznymi dla traw z rodzaju Lolium.
Pomimo coraz liczniejszych doniesień literaturowych na temat przebiegu odpowiedzi
roślin na różne czynniki stresowe, wciąż nasza wiedza na ten temat jest ograniczona i dotyczy
badania poszczególnych czynników stresowych osobno. W niniejszej pracy doktorskiej
zaprezentowano wyniki pionierskich prac, z zakresu badania wpływu trzech abiotycznych
czynników stresowych (chłód, zasolenie, susza) na te same genotypy losowo wybranych
populacji traw z kompleksu Lolium-Festuca. Finalnie scharakteryzowano odpowiedź na
działanie różnych abiotycznych czynników stresowych dwóch gatunków traw (kostrzewa
trzcinowa, życica trwała) różniących się poziomem tolerancji na abiotyczne czynniki stresowe.
Kostrzewa trzcinowa (Festuca arundinacea Schreb.) odmiana Kord wyróżniała się lepszą
tolerancją na działanie wszystkich trzech abiotycznych czynników stresowych w stosunku do
życicy trwałej (Lolium perenne L.) odmiana Solen.
Analizy chemiczne z wykorzystaniem różnych technik chromatograficznych
połączonych z spektrometrią mas pozwoliły na uzyskanie dużego zestawu danych, które
następnie zostały poddane przetworzeniu z wykorzystaniem narzędzi bioinformatycznych. Na
przetworzonych danych przeprowadzono analizy statystyczne, które wykazały znaczące
różnice w odpowiedzi na działanie bodźca stresowego pomiędzy badanymi gatunkami traw
oraz pomiędzy różnymi rodzajami działających czynników stresowych. Co ciekawe, na ogół w
kostrzewie trzcinowej mniejsza liczba metabolitów zmieniała swój poziom istotnie, co
sugeruje, że zaobserwowane zmiany dotyczyły związków kluczowych dla tolerancji na
działanie bodźca stresowego.
Jednocześnie podjęto prace mające na celu scharakteryzowanie szeregu struktur
związków fenolowych występujących u traw z kompleksu Lolium-Festuca, co do których
2
istnieją nieliczne doniesienia literaturowe. Wiedza ta jest niezbędna, do uzyskania pełnego
obrazu zmian zachodzących w roślinie w odpowiedzi na działanie bodźca stresowego.
Zastosowanie dwuetapowej chromatografii cieczowej z dwoma różnymi rodzajami faz
stacjonarnych oraz zastosowaniem spektrometru mas z pułapką jonową i wysokorozdzielczego
spektrometru mas z detektorem typu orbitrap, pozwoliło na częściowe rozwiązanie 62 struktur
metabolitów fenolowych występujących u analizowanych dwóch gatunków traw z kompleksu
Lolium-Festuca, przy czym 16 zidentyfikowano wyłącznie dla kostrzewy, natomiast 15 dla
życicy trwałej.
Uzyskane wyniki mogą zostać wykorzystane do określenie metabolomicznych
markerów tolerancji na działanie abiotycznych czynników stresowych. Markery takie mogą
wydatnie przyspieszyć prace hodowców nad uzyskiwaniem mieszańców międzyrodzajowych
traw pastewnych o pożądanych cechach.
2. Wstęp
Trawy pastewne są ważnymi roślinami uprawnymi, a łąki i pastwiska w Polsce zajmują
powierzchnię ponad 4 milionów ha, co daje ponad 20% udział w ogólnej powierzchni gruntów
rolnych. Ważnymi użytkowo gatunkami traw pastewnych są życice (życica trwała, Lolium
perenne; życica wielokwiatowa, Lolium multiflorum) oraz kostrzewy (kostrzewa łąkowa,
Festuca pratensis; kostrzewa trzcinowa, Festuca arundinacea). Gatunki te różnią się
poziomem i jakością plonu, którymi to cechami wyróżniają się życice, a także zimotrwałością
i odpornością na suszę oraz zasolenie, które są znacznie wyższe u kostrzew. Wprowadzane do
użytkowania odmiany mieszańcowe Festulolium łączą korzystne cechy obydwu genomów
rodzicielskich (Kosmala i in., 2006, 2007; Thomas i inni 2003; Turner i inni, 2012).
W ostatnich latach obserwujemy postępujące zmiany klimatu, w związku z czym w
polskim rolnictwie problem strat w plonach z powodu suszy i przymrozków nabiera coraz
większego znaczenia.
Obserwuje się wzrost częstości występowania susz, w latach 1951–1981, lat posuchy
było 6 (co około 5 lat), natomiast w okresie 1982–2006 odnotowano ich 13, czyli przeciętnie
co 2 lata miała miejsce susza. Zwrócono też uwagę na wyjątkową katastrofalność niektórych
susz, w tym w roku 2006 (Staniak i Kocoń, 2015). Jak wskazują Rapacz i inni (2014) w polskich
warunkach klimatycznych zimowa pokrywa śnieżna o grubości 10–20 cm zapewnia roślinom
dostateczną ochronę przed spadkami temperatury, utrzymując temperatury przy podłożu w
granicach około 0°C. Od 1922 roku powierzchnia zimowej pokrywy śnieżnej na półkuli
3
północnej zmniejszyła się o 7% i według różnych modeli zmian klimatycznych szacuje się że
ulegnie dalszej redukcji o 7% do 25% do końca 21-wieku (Rapacz i inni, 2014).
Odporność roślin na różne abiotyczne czynniki stresowe jest złożonym procesem
obejmującym szereg zmian na poziomie genetycznym, biochemicznym, fizjologicznym i
morfologicznym (Thomashow, 1999; Guy i inni, 2008; Sandve i inni, 2011; Huiying i inni,
2012; Kosmala i inni, 2012). Jednym z istotnych agronomicznie parametrów opisujących
odpowiedź roślin na działanie abiotycznych czynników stresowych jest zdolność roślin do
regeneracji i odrostu po okresie działania czynnika stresowego. O odpowiedzi roślin na
działanie czynników stresowych decyduje zdolność gromadzenia różnorodnych związków
chemicznych mających właściwości ochronne i umożliwiające regenerację oraz naprawienie
powstałych uszkodzeń.
3. Cel pracy
Rozpoczynając doświadczenia postawiono hipotezę mówiącą, że odpowiedź roślin na
różne abiotyczne czynniki stresowe jest zróżnicowana. Celem pracy była weryfikacja hipotezy
badawczej poprzez badanie metabolomicznej odpowiedzi wybranych genotypów traw z
kompleksu Lolium–Festuca poddanych działaniu trzech różnych abiotycznych czynników
stresowych, tj. suszy, chłodu i zasolenia. Dla realizacji tak postawionego celu pracy doktorskiej
postanowiono w pierwszym etapie prac dokonać identyfikacji metabolitów wtórnych obecnych
w liściach traw, w tym zwłaszcza glikozydowych pochodnych związków fenolowych.
Ponieważ, jak stwierdzono, większość identyfikowanych związków charakteryzowała się
bardzo podobnymi właściwościami chromatograficznymi i strukturalnymi, jako narzędzie
analityczne wybrano spektrometry mas, a instrumenty wysoko- i niskorozdzielczy zastosowano
w połączeniu z ultrasprawnym i wysokosprawnym chromatografem cieczowym. Zmiany
zawartości metabolitów pierwotnych i wtórnych postanowiono określić przy użyciu
odpowiednio chromatografu cieczowego połączonego ze spektrometrem mas oraz
ultrasprawnygo chromatografu cieczowego. Ostatnim etapem prac stała się matematyczna
transformacja uzyskanych wyników analiz chromatograficznych oraz analiza statystyczna
wyników ilościowych. Na podstawie uzyskanych wyników podjęto próbę określenia roli
związków niskocząsteczkowych w odpowiedzi roślin na stresy abiotyczne.
4
4. Materiały i metody
Materiał badawczy
Materiał do badań stanowiły wybrane trawy z kompleksu Lolium–Festuca, którymi
były: kostrzewa trzcinowa Festuca arundinacea, odmiana Kord oraz życica trwała Lolium
perenne, odmiana Solen, podczas testu chłodu w 2013 i 2014 roku oraz zasolenia i suszy w
2014 roku, a także mieszaniec międzyrodzajowy (F. pratensis i L. multiflorum) Festulolium
odm. Felopa podczas testu chłodu w 2013 roku.
Eksperymenty
traktowania
roślin
poszczególnymi
czynnikami
stresowymi
przeprowadzono w niezależnych eksperymentach na klonach tych samych genotypów każdego
z badanych gatunków i mieszańca w 10 powtórzeniach biologicznych i 3 (2013)/4 (2014)
powtórzeniach technicznych. W eksperymencie chłodu powtórzenia techniczne zduplikowano
ze względu na dwa warianty temperaturowe (-9°C i -12°C (2013)/-13°C(2014)) traktowania
mrozem.
Eksperymenty traktowania czynnikami stresowymi
Ocenę mrozoodporności roślin L. perenne odmiany Solen (2013, 2014) i F. arundinacea
odmiany Kord (2013, 2014), Festulolium odmiana Felopa (2013) wykonano według
dwuetapowej procedury stosowanej we wcześniejszych badaniach prowadzonych w Pracowni
Cytogenetyki i Biologii Molekularnej IGR PAN (Kosmala i in. 2006, 2009). Próbki z roślin
traktowanych zbierano w 3, 9 i 15 dniu aklimatyzacji oraz w 21 dniu odrostu.
Eksperyment stresu zasolenia przeprowadzono podlewając co drugi dzień 37 mL (2014)
lub 35 mL (2015) 0,25M roztworu NaCl przez 11 dni każdą z roślin traktowanych, a następnie
przez 10 dni podlewając co drugi dzień wodą, podobnie jak przez cały eksperyment rośliny
kontrolne. Próbki do analiz fizjologicznych (analiza względnej zawartości wody) oraz
metabolomicznych zbierano w 3, 7 i 11 dniu traktowania oraz 10 dniu ponownego nawadniania
z roślin traktowanych i kontrolnych.
Eksperyment stresu suszy przeprowadzono obniżając wilgotność gleby do wartości
potencjału wodnego gleby w zakresie 3,2–3,8 pF i utrzymywano ten poziom przez 11 dni.
Następnie przywrócono nawadnianie roślin traktowanych do poziomu wilgotności gleby na
zakresie potencjału wodnego gleby w zakresie 2,2–3,0 pF na 10 dni. W drugiej serii roślin,
stanowiącą kontrolę, przez 21 utrzymywano wilgotność gleby na zakresie potencjału wodnego
gleby w zakresie 2,2–3,0 pF. Próbki do analiz fizjologicznych (analiza względnej zawartości
wody) oraz metabolomicznych zbierano w 3, 7 i 11 dniu traktowania oraz 10 dniu nawadniania
po traktowania z roślin traktowanych i kontrolnych.
5
Analizy metabolomiczne i statystyczne
Ekstrakcje prób przeprowadzono zgodnie z protokołami dostępnymi w literaturze
(Stobiecki i inni 2010). Analizy zmian profili metabolitów pierwotnych i wtórnych
przeprowadzono z wykorzystaniem technik chromatografii gazowej (GC) połączonej z
spektrometrem mas (EI-TOF MS) oraz chromatografii cieczowej (HPLC, UPLC) połączonej z
spektrometrem mas (ESI-IT MS i Q-Orbitrap MS). Analizy mające na celu identyfikację
nowych
struktur
metabolitów
fenolowych
występujących
w
trawach
pastewnych
przeprowadzono z wykorzystaniem technik chromatografii cieczowej (HPLC, UPLC)
połączonej z spektrometrem mas (ESI-IT MS i Q-Orbitrap MS), zgodnie z danymi
literaturowymi (Stobiecki i inni 2015), z pewnymi modyfikacjami.
Przetworzenie danych (skrypty własne) oraz analizy statystyczne (Genstat) wykonała
dr Aneta Sawikowska.
5. Wyniki
Parametry fizjologiczne
Analizy statystyczne wykazały istotne różnice w poziomie ocen odrostu pomiędzy
kostrzewą trzcinową, życicą trwałą i mieszańcem międzyrodajowym zarówno dla roślin
poddanych wcześniej mrożeniu w -9°C (2013, 2014), jak i w przypadku -12°C dla prób z 2013
roku. Nie analizowano prób mrożonych w -13°C w 2014 roku, ze względu na zbyt małą liczbę
obiektów badawczych, które przeżyły mrożenie w tej temperaturze.
Wyniki analizy statystycznej dla kostrzewy trzcinowej traktowanej stresem solnym nie
wykazały istotnych różnic w poziomie względnej zawartości wody (RWC) zarówno w
porównaniu roślin traktowanych z kontrolnymi, jak i pomiędzy punktami czasowymi oraz w
interakcji tych dwóch czynników. W odniesieniu do życicy trwałej traktowanej stresem solnym
przeprowadzając analizę statystyczną stwierdzono jedynie statystycznie istotną różnicę w
poziomie względnej zawartości wody pomiędzy roślinami traktowanymi i kontrolnymi.
Wyniki analizy statystycznej dla kostrzewy trzcinowej traktowanej stresem suszy
wykazały istotne różnice w poziomie względnej zawartości wody (RWC) w porównaniu roślin
traktowanych z kontrolnymi. Nie stwierdzono natomiast istotnych zmian poziomu względnej
zawartości wody w interakcji traktowania i czasu zbioru prób. W odniesieniu do życicy trwałej
przeprowadzając wspomnianą analizę stwierdzono statystycznie istotną różnicę w poziomie
względnej zawartości wody pomiędzy roślinami traktowanymi i kontrolnymi, oraz w interakcji
efektu traktowania i czasu zbioru prób.
6
Analizy metabolomiczne – analizy GC-MS
Stres chłodu
Wyniki ogólnej analizy wariancji dla prób z roślin poddanych stresowi chłodu w 2013
(próg istotności <0,01, bez poprawki Bonferroniego) wskazują, że najwięcej sygnałów – 54 dla
prób nierozcieńczonych i 40 dla prób rozcieńczonych – wykazuje istotny efekt traktowania.
9 metabolitów wykazało istotny efekt traktowania, natomiast 45 istotny efekt traktowania
zależny od czasu zbioru prób.
Stres solny
W wyniku analizy statystycznej stwierdzono u kostrzewy istotne zmiany poziomu dla 8
związków (kwas glicerynowy, kwas itakonowy, trójetanoloamina, ksyloza, ryboza, kwas
cytrynowy, lizyna, galaktinol). Stwierdzono istotną różnicę w poziomie sygnału dla roślin
traktowanych w stosunku do kontrolnych w powiązaniu z czasem traktowania dla kwasu
glicerynowego, ksylozy, rybozy i galaktinolu. U życicy trwałej zaobserwowano istotne zmiany
poziomu zawartości 6 metabolitów: kwasu protokatechowego, dwupeptydu alanyloalaniny,
kwasu
4-aminomasłowego,
kwasu
bursztynowego,
kwasu
mlekowego
oraz
N,N-
dwumetyloglicyny. Spośród nich tylko kwas bursztynowy wykazywał wyłącznie efekt
traktowania niezależny od czasu zbioru prób.
Stres suszy
Na podstawie wyników analizy statystycznej stwierdzono u kostrzewy trzcinowej
istotną różnicę w poziomie sygnałów pomiędzy roślinami traktowanymi i kontrolnymi dla 14
metabolitów (gencjobioza, izoleucyna, kwas lyksonowy, kwas 4-aminomasłowy, kwas
asparaginowy, kwas erytronowy, lizyna, putrescyna, treonina, tryptofan, tyrozyna i walina). Dla
innych 8 związków stwierdzono statystycznie istotną interakcję pomiędzy traktowaniem a
punktami czasowymi zbioru prób. U życicy trwałej 14 zidentyfikowanych związków zmieniało
poziom w interakcji traktowania i punktu czasowego, w którym zebrano próby. U życicy
trwałej zidentyfikowano 35 związków, dla których stwierdzono istotny efekt poddania roślin
stresowi suszy, przy jednoczesnym braku istotnej interakcji traktowania i czasu, w którym
zbierano próby.
Identyfikacja struktur metabolitów wtórnych
Zarówno w próbach z liści życicy trwałej jak i kostrzewy trzcinowej zidentyfikowano
izomery 3-, 4- i 5- kwasu kawowochinowego w formie trans oraz kwas 5-cis- kawowochinowy.
Dla pochodnych ferulowochinonowych zidentyfikowany izomery 3, 4 i 5 u obu badanych
7
gatunków traw. W przypadku pochodnych para-kumarowochinowych zidentyfikowano tylko
izomery 3 i 5.
6-C-heksozylo-8-C-heksozyd apigeniny zidentyfikowano zarówno w liściach życicy
trwałej jak i w kostrzewie trzcinowej, natomiast 6-C-heksozylo-8-C-pentozyd apigeniny.
W liściach życicy trwałej zidentyfikowano 6 mono-O-glikozylowanych pochodnych
następujących flawonoidów: kwercetyna (podstawiona w pozycji 3), kempferol (2 izomery),
izoramnetyna, chryzoeriol i trycyna.
Ze względu na obserwowany rozmiar fragmentów odpowiadających grupom
cukrowym pośród dwucukrowych pochodnych flawonoidów, którymi są podstawione aglikony
oraz sposobu ich połączenia w analizowanych próbach można było wyróżnić:
a) dwu-O-heksozydy (162 amu+162 amu)
b) O-pentozylo-O-heksozyd (132 amu+162 amu)
c) O-dwuheksozydy (324 amu)
d) O-ramnozyloheksozydy (308 amu)
e) O-glukuroiloheksozydy (338 amu)
f) O-pentozyloheksozydy (294 amu)
g) O-glukuroilopentozydy (308 amu).
W przypadku trój-O-glikozylowanych pochodnych flawonoidów ze względu na rodzaj
grup cukrowych, którymi były podstawione aglikony oraz sposobu ich połączenia w
analizowanych próbach można było wyróżnić:
a) O-heksozylo-O-ramnozyloheksozydy
b) O-heksozylo-O-glukuroiloheksozydy
c) O-heksozylo-O-pentozyloheksozyd
d) O-ramnozylo-(1"->2")-[ramnozylo-(1"->6")-heksozyd]
e) O-ramnozylo-(1"->2")-[pentozylo-(1"->6")-heksozyd].
Zidentyfikowano u życicy trwałej jedną strukturę cztero-O-glikozylowaną, którą jest
O-glukuroiloheksozylo-O-ramnozyloheksozyd kempferolu.
W próbach z liści życicy trwałej zidentyfikowano dwie pochodne monoglikozydowe,
trzy pochodne dwuglikozydowe i jedną pochodną trójglikozydową, w których jeden z
podstawników cukrowych był dodatkowo acylowany kwasem malonowym. Zidentyfikowano
jedną strukturę acylowaną kwasem kawowym, którą był O-heksozylo-O-kawoiloheksozyd
kempferolu, zidentyfikowany w próbach z liści życicy trwałej.
8
W próbach z liści kostrzewy trzcinowej zidentyfikowano jedną pochodną lignanową.
Związkiem tym był 4,4’-dwu-O-beta-glukopiranozyd hydroksymatairezinolu.
Analizy metabolomiczne – metabolity fenolowe
Stres chłodu 2013
Wyniki analiz statystycznych wskazują na istotne zmiany poziomu dla 10 wierzchołków
chromatograficznych z analizy kostrzewy trzcinowej. Dla życicy trwałej stwierdzono
statystycznie istotna zmianę poziomu dla 22 wierzchołków chromatograficznych. W mieszańcu
międzyrodzajowym zaobserwowano 11 wierzchołków chromatograficznych, których poziom
zmieniał się statystycznie istotnie.
Stres chłodu 2014
Stwierdzono u kostrzewy trzcinowej statystycznie istotną różnicę poziomu akumulacji
dla 9 wierzchołków chromatograficznych w zależności od interakcji czasu zbioru prób i
traktowania,
z
czego
kwasu
O-heksozyd
dwuhydroksybenzoesowego
wykazywał
równocześnie istotną różnicę w zależności od traktowania.
Dla 6 metabolitów u życicy trwałej, tj. kwasów 3-, 4-, 5-trans-kawowochinowego i 5ferulowochinowego, O-heksozydu kwasu 3-kawowochinowego, O-heksozydu kwasu
dwuhydroksybenzoesowego, stwierdzono statystycznie istotną interakcję czasu i traktowania.
Stres solny 2014
U kostrzewy trzcinowej O-heksozyd izoramnetyny wykazywał jedynie istotnie wyższy
poziom akumulacji w roślinach traktowanych w stosunku do kontrolnych (istotny efekt
traktowania).
Wierzchołek
ramnozyloheksozydu
chromatograficzny
izoramnetyny
i
dla
koleujących
dwu-O-heksozydu
O-heksozylo-O-
izoramnetyny
wykazywał
statystycznie istotną różnicę poziomu sygnału w interakcji czasu i traktowania.
Analiza statystyczna dla prób z życicy trwałej wykazała również istotną różnicę
poziomu akumulacji dla 16 metabolitów w zależności od interakcji czasu i traktowania.
Stres suszy 2014
Dla kwasów 3-ferulowochinowego, 3- i 4-trans-kawowochinowych oraz Oheksozylo-O-pentozyloheksozydu izoramnetyny zidentyfikowanych w kostrzewie trzcinowej
stwierdzono statystycznie istotną różnice poziomu akumulacji w zależności od traktowania. Dla
wszystkich czterech metabolitów zaobserwowano wyższy akumulacji w roślinach
traktowanych w stosunku do kontrolnych. O-heksozylo-O-pentozyloheksozyd izoramnetyny
9
wykazywał również statystycznie istotną różnicę w interakcji czasu i traktowania, podobnie
również 8 innych wierzchołków chromatograficznych.
U życicy trwałej dla 8 wierzchołków chromatograficznych stwierdzono statystycznie
istotną zmianę poziomu akumulacji w interakcji czasu i traktowania. Dla 6 spośród
wspomnianych ośmiu wierzchołków stwierdzono również statystycznie istotną różnicę w
poziomie akumulacji pomiędzy roślinami traktowanymi a kontrolnymi.
6. Dyskusja
Stres chłodu
Kostrzewa trzcinowa, jako gatunek blisko spokrewniony, powstały z połączenia
diploidalnego genomu F. pratensis z dwoma genomami tetraploidalnego F. glaucescens,
posiada geny warunkujące wyższy poziom tolerancji na działanie niskich temperatur. Analizy
statystyczne ocen odrostu w 21 dniu wznowienia wegetacji po mrożeniu w eksperymentach
stresu chłodu w 2013 i 2014 roku potwierdzają tą hipotezę, ponieważ kostrzewa uzyskała
istotnie wyższe oceny odrostu w stosunku do życicy. Badaniami objęto także odmianę Felopa
należącą do syntetycznego rodzaju Festulolium, a powstałą ze skrzyżowania F. pratensis oraz
Lolium multiflorum (życica wielokwiatowa). Warte jest podkreślenia, że Felopa, zgodnie z
postulowanym ważnym aspektem uzyskiwania mieszańców międzyrodzajowych łączenia
korzystnych cech obu rodzajów, badana podczas eksperymentu stresu chłodu w 2013 roku,
uzyskała oceny odrostu pośrednie, pomiędzy uzyskanymi przez kostrzewę trzcinową i życicę
trwałą.
Analiza zmian profili metabolitów dla danych z eksperymentu stresu chłodu z 2013
roku uzyskanych technikami GC-MS, wskazała na istotną zmianę poziomu 45 metabolitów
spośród 46 analizowanych. Wspólną cechą charakterystyczną dla wszystkich sygnałów, jest
odmienny przebieg zmian poziomu sygnału dla prób z kostrzewy trzcinowej w stosunku do
tendencji obserwowanych w próbach z życicy trwałej i odmiany Felopa. Powyższa obserwacja,
w połączeniu z wynikami analizy ocen odrostu, sugeruje kluczową rolę zmian w profilach
metabolitów u kostrzewy trzcinowej w tolerancji na stres chłodu. Jest to obserwacja zbieżna z
postulowaną przez Kosmalę i współautorów (2007) wyższą zimotrwałością kostrzewy
trzcinowej w stosunku do traw z rodzaju Lolium, w związku z obecnością kopi genomu F.
pratensis, gatunku znanego z wysokiej zimotrwałości.
Zmiany poziomu metabolitów fenolowych w odpowiedzi na traktowanie chłodem oraz
następujące po nim mrożenie wskazują na istotne różnice pomiędzy badanymi gatunkami traw,
a w przypadku eksperymentu z 2013 roku, także mieszańcem międzyrodzajowym. W
10
eksperymencie z 2013 roku najmniejsza liczba metabolitów fenolowych ulegała istotnej
zmianie poziomu w liściach kostrzewy trzcinowej. Uzyskany rezultat w połączeniu z wynikami
oceny odrostu sugeruje, że kluczowe dla tolerancji na chłód metabolity fenolowe zmieniały
zawartość u kostrzewy trzcinowej. . Najliczniejszą grupą metabolitów fenolowych, która
reagowała istotnie na stres chłodu są pochodne flawonolowe, co jest zgodne z wynikami
uzyskanymi przez Korn’a i wsp. (2008) u A. thaliana. Wyniki eksperymentu stresu chłodu
przeprowadzonego w 2014 roku wskazują, że istotne jest by równolegle przy każdym zbiorze
prób z roślin traktowanych, zbierać również próby z roślin kontrolnych, ponieważ także rośliny
rosnące w warunkach kontrolnych wykazują zmienność poziomu metabolitów w czasie.
Stres solny
Kostrzewa trzcinowa jest uznawana za gatunek charakteryzujący się wyższą tolerancją
na niedobór wody w stosunku do życicy trwałej (Kosmala i inni, 2009). W związku z
powyższym faktem poprzez analogię powinna ona również wykazywać wyższą tolerancję na
warunki stresu solnego. Wyniki analizy statystycznej względnej zawartości wody (RWC)
potwierdziły tę hipotezę, ponieważ nie wykazano istotnych różnic w poziomie RWC pomiędzy
traktowanymi i kontrolnymi roślinami kostrzewy trzcinowej oraz w interakcji z czasem zbioru
prób dla obu gatunków.
Pomimo ograniczonego wpływu podawanego wodnego roztworu soli na traktowane
rośliny, odzwierciedlonego niewielkimi zmianami względnej zawartości wody (RWC) w
liściach badanych roślinach, analizy danych uzyskanych technikami GC-MS wskazują na
istotne zmiany poziomu kilku metabolitów - 8 dla kostrzewy i 5 dla życicy.
W liściach kostrzewy trzcinowej wzrósł poziom kwasu glicerynowego w roślinach
traktowanych w stosunku do kontrolnych, podobnie jak u znanego halofita, topoli eufrackiej.
Stwierdziłem też wyższy poziom kwasu cytrynowego u kostrzewy, podobnie jak to
obserwowano u Lotus japonica i odwrotnie niż u dwóch odmian kukurydzy, różniących się
poziomem tolerancji na stres solny, u których Richter i inni (2015) stwierdzili spadek poziomu
wszystkich metabolitów szlaku kwasu cytrynowego. Zaobserwowany niższy poziom
trójetanoloaminy w traktowanych roślinach kostrzewy trzcinowej w stosunku do kontroli jest
zgodny z wynikami eksperymentu stresu solnego dla pszenicy (Janda i wsp., 2016), dla której
stwierdzono spadek ogólnej zawartości poliamin w trakcie aklimatyzacji do stresu solnego.
Poziom lizyny w liściach kostrzewy był istotnie wyższy, co sugeruje jej istotną rolę w
odpowiedzi na stresy solny. Wszystkie wspomniane metabolity reagujące wzrostem poziomu
są znane jako osmoprotektanty.
11
Analiza zmian poziomu metabolitów fenolowych wykazała istotne różnice poziomu
dla dwóch metabolitów zidentyfikowanych w próbach z kostrzewy trzcinowej i 16 metabolitów
zidentyfikowanych u życicy trwałej. Ta dysproporcja w liczbie metabolitów o statystycznie
istotnych różnicach w połączeniu z wynikami analizy zmian poziomu RWC, sugeruje istotną
dla tolerancji na stres solny odpowiedź zmian metabolitów u kostrzewy. Stwierdziłem istotnie
wyższy poziom zawartości O-heksozydu izoramnetyny u kostrzewy. U obu analizowanych
gatunków zidentyfikowano dwu-O-heksozyd izoramnetyny, przy czym w przypadku kostrzewy
trzcinowej koleuował on z O-heksozylo-O-ramnozyloheksozydem izoramnetyny. U życicy
różnice poziomu dla dwu-O-heksozydu izoramnetyny były mniejsze niż to miało miejsce dla
wspomnianych koelujących metabolitów u kostrzewy i odmienny przebieg. Izoramnetyna obok
kwercetyny jest znana jako najwydajniejszy zmiatacz wolnych rodników, a w szczególności
H2O2 (Pollestri i Tettini, 2013). W związku z powyższymi obserwacjami i wspomnianym rolą
izoramnetyny, należy podejrzewać, że pochodne tego flawonolu skutecznie ograniczały
powstawanie wolnych rodników w kostrzewie, w związku z czym szkodliwy efekt
oddziaływania bodźca stresowego został dodatkowo ograniczony.
Stres suszy
Analizy statystyczne zmian poziomu względnej zawartości wody (RWC) dla prób z
eksperymentu stresu suszy wskazują na istotny efekt traktowania dla kostrzewy trzcinowej,
natomiast nie zaobserwowano istotnych zmian w powiązaniu z czasem zbioru prób. W
odniesieniu do życicy trwałej zaobserwowano istotne zmiany poziomu względnej zawartości
wody, jako efektu traktowania oraz w powiązaniu z czasem zbioru prob. Ważne jest, że poziom
względnej zawartości wody jest wyższy u kostrzewy niż u życicy, co wskazuje na istnienie
wydajniejszych mechanizmów ograniczających utratę wody z rośliny na drodze transpiracji, a
co za tym idzie wyższy poziom tolerancji na stres suszy (Kosmala i inni, 2012).
Wyniki analiz danych uzyskanych technikami GC-MS wskazują na istotne różnice w
poziomie wielu metabolitów. Mniejsza liczba metabolitów reagowała istotnymi zmianami
poziomu u kostrzewy w stosunku do życicy, co w połączeniu z wynikami RWC wskazuje, na
reakcję istotnych dla odpowiedzi na stres suszy metabolitów u pierwszego rodzaju traw.
Zaobserwowałem u kostrzewy podwyższony poziom izoleucyny, kwasu asparaginowego,
lizyny, treoniny, tryptofanu, tyrozyny i waliny, co jest zgodne m.in. z doniesieniami Shanker’a
i innych (2014) w kontekście grochu zwyczajnego, czy wynikami uzyskanymi przez
Nakabayashi’ego i współpracowników (2014) na A. thaliana. Istotnie w interakcji z czasem
zmieniał się również poziom proliny. Podczas analiz GC-MS metabolitów pierwotnych z liści
12
roślin traw poddanych stresowi suszy nie stwierdzono istotnych zmian zawartości cukrów u
kostrzewy poza gencjobiozą, dla której wykazano istotny efekt traktowania oraz turanozą, dla
której wystąpił istotny efekt traktowania w interakcji z czasem.
U obu badanych gatunków zaobserwowano istotnie wyższy poziom putrescyny w
liściach roślin poddanych stresowi suszy w porównaniu z roślinami kontrolnymi. Wykazano
wcześniej, że podwyższony poziom tej poliaminy podnosił poziom tolerancji ryżu (Oryza
sativa L.) na stres suszy i był skorelowany z wyższym poziomem plonu ziarna (Yang i in.
2007). Jednakże w przeprowadzonych badaniach traw u życicy zaobserwowano istotny efekt
traktowania o podobnym poziomie, jaki wystąpił u kostrzewy, co sugeruje że w przypadku traw
pastewnych ta poliamina może nie mieć aż tak dużego znaczenia w kontekście zróżnicowanej
tolerancji na stres suszy.
Porównując zmiany poziomu metabolitów fenolowych, zaobserwowałem, że w
przeciwieństwie do wcześniej omawianych tendencji dotyczących metabolitów pierwotnych,
większa liczba metabolitów wtórnych statystycznie istotnie zareagowała u kostrzewy niż u
życicy.
Istotnie zmieniał się poziom kilku O-glikozylowanych flawonoidów. U kostrzewy
istotnym
wzrostem
poziomu
podczas
traktowania
reagowały
O-heksozylo-O-
pentozyloheksozyd izoramnetyny i O-ramnozyloheksozyd izoramnetyny. Warty podkreślenia
jest fakt, że w przeprowadzonych pracach nie zaobserwowano istotnych zmian poziomu
pochodnych kwercetyny, opisanych dla innych roślin z rodziny Poaceae – wyczyńca łąkowego
(Alopecurus pratensis L.) i kłosówki wełnistej (Holcus lanatus L.), (Gargallo-Garriga i in.,
2015). Kwercetyna i izoramnetyna są znane jako najwydajniejsze zmiatacze wolnych
rodników, a w szczególności nadtlenku wodoru. Brak istotnych zmian poziom kwercetyny nie
wyklucza jej roli w tym procesie w analizowanych gatunkach traw. Metoksylowane flawonoidy
mają drugie maksimum absorpcji przesunięte w kierunku dłuższych fal. Obecność metabolitów
posiadających w swojej strukturze grupę metoksylową, takich jak trycyna, chryzoeriol i
izoramnetyna, rozszerza zakres pochłaniania szkodliwego promieniowania UV, dzięki czemu
mogą one efektywniej ograniczać powstawanie wolnych rodników.
Identyfikacja struktur metabolitów fenolowych
W dotąd dostępnych opracowaniach skupiono się na identyfikacji aglikonów
związków fenolowych występujących u traw (Klejdus i Kubáň, 2000; Ponce i inni, 2009).
Podjęto również nieliczne próby identyfikacji glikozylowanych pochodnych flawonoidów,
przy czym rozpoznano głównie 3-ramnozyloglukozydowe pochodne kwercetyny, kempferolu
13
i izoramnetyny (De Bertoldi i inni, 2012). W niniejszej pracy przeprowadziłem identyfikację
metabolitów fenolowych wyizolowanych w skali preparatywnej z życicy trwałej (Lolium
perenne L.) odmiany Solen. Kilka dodatkowych struktur fenolowych zidentyfikowałem na
etapie adnotacji do odpowiednich wierzchołków po wstępnym przetworzeniu danych z analiz
ilościowych dla życicy oraz kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea Schreb.) odmiany
Kord.
Dzięki przeprowadzonym przy użyciu wysokorozdzielczego spektrometru mas
dokładnym pomiarom stosunku masy do ładunku, możliwe było rozróżnienie przyłączonych
podstawników, wykluczające alternatywne struktury. Możliwość znalezienia alternatywnych
struktur wynikała z wykorzystania we wstępnych badaniach spektrometru mas z pułapką
jonową charakteryzującego się niską dokładnością pomiaru masy. W związku z powyższym
np. do obserwowanego na widmie neutralnego fragmentu 162 amu można przypisać kilka
struktur różniących się kompozycją atomową: heksoza C6H10O5, kwas kawowy C9H6O3, acetal
C5H6O6 (Mikołajczyk-Bator i inni, 2016; Piasecka i inni, 2015).
Zidentyfikowałem szereg struktur kwasów hydroksycynamonowych, pośród których
przeważały pochodne kwasu chinowego, podstawione w różnych położeniach cząsteczkami
kwasów p-kumarowego, kawowego i ferulowego. Zidentyfikowałem również szereg struktur
O-glikozylowanych pochodnych flawonoidów, dwie C-glikozylowane pochodne apigeniny, a
także nierozpoznaną wcześniej strukturę lignanową u kostrzewy trzcinowej. Podobnie jak
Johnson i współpracownicy (2002) zauważyłem znaczną pod względem ilościowym zawartość
kwasu 5-kawowochinowego w stosunku do innych związków fenolowych. Co istotne,
stwierdziłem obecność izomerów cis i trans tego kwasu.
7. Wnioski
1) Kostrzewa trzcinowa (Festuca arundinacea Schreb.) odmiany Kord wykazuje wyższy
poziom tolerancji niż życica trwała (Lolium perenne L.) odmiany Solen na działanie nie
tylko stresu suszy, o czym donoszą liczne opracowania literaturowe, ale także stresu
chłodu, zasolenia.
2) W wyniku traktowania stresem chłodu istotną odpowiedź na działanie bodźca stresowego
wykazała znaczna liczba metabolitów u kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea
Schreb.) odmiany Kord, życicy trwałej (Lolium perenne L.) odmiany Solen i mieszańca
międzyrodzajowego z rodzaju Festulolium odmiany Felopa.
3) W odpowiedzi na stres chłodu kluczową rolę u kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea
Schreb.) odmiany Kord pośród metabolitów fenolowych odegrały: O-ramnozyloheksozyd
14
kempferolu, O-ramnozyloheksozydu izoramnetyny oraz kwas 3-ferulochinowy i kwas 3trans-kawowochinowy.
4) W odpowiedzi na stres solny istotną rolę u kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea
Schreb.) odmiany Kord pośród metabolitów odegrały: kwasy glicerynowy i cytrynowy,
dwu-O-heksozyd izoramnetyny i koelujące dwu-O-heksozyd izoramnetyny z Oheksozylo-O-ramnozyloheksozydem izoramnetyny, które pełnią istotną rolę w tolerancji
na działanie czynnika stresowego.
5) W odpowiedzi na stres suszy znaczącą rolę u kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea
Schreb.) odmiany Kord odegrała: większość aminokwasów, gencjobioza, turanoza,
putrescyny, kwasu γ-aminomasłowego oraz flawonole.
6) Odpowiedź na poziomie metabolomu na działanie różnych abiotycznych czynników
stresowych (chłód, solny, susza) u analizowanych dwóch gatunków traw (Festuca
arundinacea Schreb., Lolium perenne L.) z kompleksu Lolium-Festuca charakteryzuje się
znacznym zróżnicowaniem powiązanym z rodzajem czynnika stresowego i badanego
gatunku traw.
7) Analizowane gatunki traw z kompleksu Lolium-Festuca charakteryzują wyższą liczbą
metabolitów zmieniających swój poziom w zależności od fazy wzrostu niż zmieniających
swój poziom w efekcie traktowania czynnikiem stresowym.
8) Metabolity fenolowe u analizowanych dwóch gatunków traw z kompleksu Lolium-Festuca
charakteryzują się różnorodnością miejsc podstawienia na cząsteczce aglikonu oraz
rodzajów przyłączonych fragmentów.
8. Literatura
De Bertoldi C., De Leo M., Ercoli L., Braca A. (2012). Chemical profile of Festuca arundinacea extract showing
allelochemical activity. Chemoecology 22:13–21.
Gargallo–Garriga A., Sardans J., Pérez–Trujillo M., Oravec M., Urban O., Jentsch A., Krejling J., Beierkuhnlein
C., Parella T., Peñuelas J. (2015). Warming differentially influences the effects of drought on stoichiometry and
metabolomics in shoots and roots. New Phytologist 207: 591–603.
Guy C, Kaplan F, Kopka J, Selbig J, Hincha DK (2008). Metabolomics of temperature stress. Physiol. Plant. 132:
220–235.
Huiying L., Tao H., Jinmin F. (2012). Identification of genes associated with adaptation to NaCl toxicity in
perennial ryegrass (Lolium perenne L.). Ecotoxicology and Environm. Safety 79: 153–162.
Janda T., Darko É., Shehata S., Kovács V., Pál M., Szalai G. (2016). Sal acclimation processes in wheat. Plant
Physiology and Biochemistry 101: 68–75.
15
Johnson A.W., Snook M.E., Wiseman B.R. (2002). Green leaf chemistry of various turfgrasses: differentiation
and resistance to fall armyworm. Crop Sci. 42: 2004–2010.
Klejdus B., Kubáň V. (2000). High performance liquid chromatographic determination of phenolic compounds in
seed exudates of Festuca arundinacea and F. pratense. Phytochemical Analysis 11: 375–379.
Korn M., Peterek S., Mock H.P., Heyer A.G., Hincha D.K. (2008). Heterosis in freezing tolerance, and sugar and
flavonoid contents of cross between Arabidopsis thaliana accessions of widely varying freezing tolerance. Plant
Cell Environm. 31: 813–827.
Kosmala A., Bocian A., Rapacz M., Jurczyk B., Zwierzykowski Z. (2009). Identification of leaf proteins
differentially accumulated during cold acclimation between Festuca pratensis plants with distinct levels of frost
tolerance. J. of Experimental Botany 60 (12): 3595–3609.
Kosmala A., Perlikowski D., Pawłowicz I., Rapacz M. (2012). Changes in the chloroplast proteome following
water deficit and subsequent watering in a high- and low-drought-tolerant genotype of Festuca arundinacea. J. of
Experimental Botany 63(17): 6161-6172.
Kosmala A, Zwierzykowski Z, Gąsior D, Rapacz M , Zwierzykowska E, Humphreys M.W. (2006). GISH/FISH
mapping of genes for freezing tolerance transferred from Festuca pratensis to Lolium multiflorum. Heredity 96:
243–251.
Kosmala A. Zwierzykowski Z, Zwierzykowska E, Łuczak M, Rapacz M, Gąsior D, Humphreys M.W. (2007).
Introgression-mapping of the genes for winter hardiness and frost tolerance from Festuca arundinacea into Lolium
multiflorum. J. Hered. 98: 311–316.
Mikołajczyk-Bator K., Błaszczyk A., Czyżniejewski M., Kachlicki P. (2016). Characterisation and identification
of triterpene saponins in roots of red beets (Beta vulgaris L.) using two HPLC-MS systems. Food Chemistry 192:
979–990.
Nakabayashi R., Yonekura–Sakakibara K., Urano K., Suzuki M., Yamada Y., Nishizawa T., Matsuda F., Kojima
M., Sakakibara H., Shinozaki K., Michael A.J., Tohge T., Yamazaki M., Saito K. (2014). Enhancement of
oxidative and drought tolerance in Arabidopsis by overaccumulation of antioxidant flavonoids. The Plant Journal
77: 367–379.
Piasecka A., Sawikowska A., Krajewski P., Kachlicki P. (2015). Combined mass spectrometric and
chromatographic methods for in–depth analysis of phenolic secondary metabolites in barley leaves. J. Mass
Spectrom. 50: 513–532.
Pollastri S., Tattini M. (2011). Falvonols: old compounds for old roles. Annals of Botany 108: 1225–1233.
Ponce M.A., Bompadre M.J., Scervino J.M., Ocampo J.A., Chaneton E.J., Godeas A.M. (2009). Flavonoids,
benzoic acids and cinnamic acids isolated from shoots and roots of Italia rye grass (Lolium multiflorum Lam.) with
and without endophyte association and arbuscular mycorrihizal fungus. Biochem. Syst. Ecol. 37: 245–253.
Rapacz M., Ergon Å., Höglind M., Jørgensen M., Jurczyk B., Østrem L., Rognli O.A., Tronsmo A.M. (2014).
Overwintering of herbaceous plants in a changing climate. Still more questions than answers. Plant Science 225:
34–44.
16
Richter J.A., Erban A., Kopka J., Zörb C. (2015). Metabolic contribution to salt stress in two maize hybrids with
contrasting resistance. Plant Science 233: 107–115.
Sandve R.S., Kosmala A., Rudi H., Fjellheim S., Rapacz M., Toshihiko Y., Rognli O.A. (2011). Molecular
mechanisms underlying frost tolerance in perennial grasses adapted to cold climates. Plant Science 180: 69–77.
Shanker A.K., Maheswari M., Yadav S.K., Desai S., Bhanu D., Bajaj Attai N., Venkateswarlu B. (2014). Drought
stress responses in crops. Funct. Integr. Genomics 14: 11–22.
Staniak M., Kocoń A. (2015). Forage grasses under drought stress in conditions of Poland. Acta Physiol. Plant
37:116, DOI: 10.1007/s11738–015–1864–1.
Stobiecki M., Kachlicki P., Wojakowska A., Marczak Ł. (2015). Application of LC/MS systems to structural
characterization of flavonoids glycoconjugates. Phytochemistry letters, 11: 358–367.
Stobiecki M., Staszków A., Piasecka A., Garcia–Lopez P.M., Zamora–Natera F., Kachlicki P. (2010). LC–MS/MS
profiling of flavonoids conjugates In Wild Mexican lupine Lupines reflexus. J. Nat. Prod. 73: 1254–1260.
Thomas H.M., Morgan W.G., Humphreys M.W. (2003). Designing grasses with a future – combining the attributes
of Lolium and Festuca. Euphytica 133: 19–26.
Turner L.R., Holloway–Phillips M.M., Rawnsley R.P., Donaghy D.J., Pembleton K.G. (2012). The morphological
and physiological responses of perennial ryegrass (Lolium perenne L.), cocksfoot (Dactylis glomerata L.) and tall
fescue (Festuca arundinacea Schreb.; syn. Schedonorus phoenix Scop.) to variable water availability. Grass and
Forage Science 67: 507–518.
Thomashow MF (1999). Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu. Rev.
Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 571–599.
Yang J., Zhang J., Liu K., Wang Z., Liu L. (2007). Involvement of polyamines in the drought resistance of rice.
Journal of Experimental Botany 58(6): 1545–1555.
17