"Identyfikacja nowych genów i regionów odpowiedzialnych za

"Identyfikacja nowych genów i regionów odpowiedzialnych za
powstawanie wrodzonych wad kończyn u człowieka"
Aleksander Jamsheer
Stypendysta projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za
strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu
Operacyjnego Kapitał Ludzki
W ostatnich latach zidentyfikowanych zostało wiele genów oraz sekwencji
regulatorowych sterujących rozwojem embrionalnym kończyn, w których mutacje prowadzą
do wystąpienia określonego obrazu klinicznego wady. Większość z odkryć była możliwa
dzięki badaniom genetycznym rodzinnych i sporadycznych przypadków pacjentów
dotkniętych malformacjami kończyn. Pomimo ogromnego postępu wiedzy, nadal znaczący
odsetek wrodzonych wad kończyn ma niewyjaśnione podłoże genetyczne.
Celami niniejszej pracy doktorskiej było wdrożenie do diagnostyki genetycznej badań
wybranych genów lub loci, których mutacje są przyczyną rozwoju wrodzonych wad kończyn,
identyfikacja nowych genów/regionów genomowych, w których lokalizują się geny lub
elementy regulatorowe odpowiadające za rozwój zarodkowy kończyn oraz poprawa stanu
diagnostyki molekularnej i poradnictwa genetycznego w grupie polskich pacjentów z wadami
rozwojowymi kończyn.
Badaniami
objęto
110
probandów,
u
których
zachodziło
bardzo
wysokie
prawdopodobieństwo genetycznego uwarunkowania wady kończyn (przypadki rodzinne oraz
przypadki sporadyczne wad obustronnych). Do badań włączono zarówno probandów z
izolowanym, jak i syndromicznym wystąpieniem wady kończyn. Pacjentów oceniano
klinicznie, a następnie kwalifikowano na odpowiednie badania molekularne (diagnostyka
przesiewowa, polegająca na analizie sekwencji lub liczby kopii regionów/genów, oraz
badania porównawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy - aCGH).
Na potrzeby diagnostyki przesiewowej, opracowano i wdrożono badania genetyczne
ok. 20 regionów i genów zaangażowanych w patogenezę kilkudziesięciu zespołów
genetycznych z wrodzonymi wadami kończyn. Następnie w toku diagnostyki przesiewowej u
47 probandów (42,7%)
potwierdzono
w badaniach molekularnych uwarunkowanie
genetyczne określonej wady/zespołu wad. U 11 probandów z polidaktylią preaksjalną typu 4
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego
Funduszu Społecznego
lub cefalopolisyndaktylią Greiga wykryto mutację w genie GLI3; u 12 probandów z
rozszczepem dłoni i/lub stóp (SHFM) wykryto molekularne podłoże wady, z czego u 6
zidentyfikowano mutację w genie TP63, u 3 duplikację w locus 10q24.31-10q24.32 (SHFM3),
a u 3 kolejnych duplikację w locus 17p13.3 (SHFLD). Ponadto u 4 probandów z SPD
stwierdzono mutacje w genie HOXD13, u 4 z zespołem ODDS/syndaktylią typu III - mutacje
w genie GJA1, u 4 z zespołem TAR - mikrodelecje w regionie 1q21.1. U 2 probandów z
zespołem Feingolda wykryto mutację w genie MYCN, u 2 probandów z zespołem BardetaBiedla - mutację w BBS10, a u kolejnych 2 z rozpoznaniem zespołu Townesa-Brocksa mutację w genie SALL1. U 5 probandów rozpoznano i potwierdzono izolowaną postać
brachydaktylii (u 2 probandów z BDB wykryto mutacje w genie ROR2, u 1 z BDC - mutację w
GDF5, u 1 z BDE - mutację w HOXD13 i u 1 z BDE - mutację promotorową w PTHLH).
Dodatkowo u 1 probanda zdiagnozowano kościozrost kości nadgarstka i stępu z
symfalangizmem, spowodowany mutacją w genie NOG. W badaniach przesiewowych
wykonano ogółem 227 badań molekularnych (analiza sekwencji i liczby kopii metodą qPCR
lub MLPA).
U 63 probandów, u których wykluczono wszystkie znane przyczyny wady wrodzonej
kończyn lub zespołu wad wykonano badanie aCGH. U 9 probandów (8,2% kohorty) wykryto
znane patogenne warianty genomowe (CNV), z których jedynie 5 powiązanych było
uprzednio z wystąpieniem malformacji kończynowych, przy czym w 2 przypadkach
zidentyfikowano je u probandów z całkowicie odmienną od typowej manifestacją kliniczną
(duplikacja w locus SHFM3 u pacjentki z obustronną hipoplazją kości udowych oraz delecja
w locus TAR u pacjenta z SHFM). U 16 probandów (14,6%) zidentyfikowano nieopisywane
dotychczas w piśmiennictwie CNVs, m. in. terminalną duplikację długiego ramienia
chromosomu 5 pary o wielkości ok. 5,4 Mb u pacjenta z fenotypem przypominającym zespół
Holt-Orama. W przypadku 3 z w/w CNVs wytypowano geny o nieznanej u człowieka funkcji,
które mogą być zaangażowane w rozwój zarodkowy kończyn (geny MEIS1, SCMH1,
SALL3). Konieczne są dalsze badania funkcjonalne lub podjęcie próby zgromadzenia
większej liczby probandów z określonymi fenotypami, aby udowodnić związek przyczynowoskutkowy pomiędzy mutacjami w w/w genach a powstaniem wad rozwojowych kończyn.
Metoda aCGH okazała się skutecznym narzędziem w badaniach naukowych,
identyfikującym w znaczącym odsetku przypadków pacjentów z syndromicznymi lub
izolowanymi wadami kończyn znane patogenne lub całkowicie nowe CNVs. Praca
potwierdziła, że wrodzone wady kończyn mogą być spowodowane zmianami o charakterze
genomowym, co jest ważne dla planowania diagnostycznych i naukowych badań
genetycznych dla pacjentów z tą grupą wad wrodzonych.
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego
Funduszu Społecznego