Badania prenylowanych białek u roślin

Badania prenylowanych białek u roślin
Anna Leja
Kierujący pracą dyplomową: dr inż. Edyta Łukowska-Chojnacka
Opiekun naukowy: prof. dr hab. Ewa Świeżewska
Niniejsza praca dotyczy badania reakcji prenylacji białek Rab. We wstępie wskazano rolę
modyfikacji białek i nakreślono cel pracy, którym było zbadanie wpływu białka REP na
aktywność geranylogeranylotransferazy-II u Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik pospolity).
Jako metodę wybrano reakcję prenylacji białek Rab in vitro (prenylacja białka
rekombinowanego) i in vivo (prenylacja białek endogennych). Zastosowano linie roślinne
o niezmienionym genotypie, a także linie z insercją w genie REP oraz linię rewertanta z tym
genem ponownie wprowadzonym na plazmidzie. Zastosowano substraty lipidowe oraz
prekursor ich biosyntezy wyznakowane trytem. Pomiar radioaktywności rozdzielonych po
reakcji białek pozwala na wnioskowanie o wydajności reakcji prenylacji.
W krótkim wstępie teoretycznym omówiono najczęściej występujące modyfikacje
lipidowe
białek:
S-acylację,
N-mirystylację,
prenylację
i
modyfikację
glikozylofosfatydyloinozytolem. Przedstawiono charakterystykę białek Rab, omawiając ich
funkcje u roślin, podział u A. thaliana, a także białka z nimi oddziałujące oraz mechanizm ich
prenylacji. Szczególną uwagę zwrócono na badania dotyczące białka RabA2a, które było
używane w doświadczeniach wykonanych w ramach niniejszej pracy. Przedstawiono także
dotychczas
uzyskaną
wiedzę
dotyczącą
enzymatycznego
kompleksu
geranylogeranylotransferazy-II u A. thaliana.
W kolejnym rozdziale omówiono wyniki doświadczeń wykonanych w ramach pracy
badawczej. Scharakteryzowano używane linie roślinne przy pomocy szeregu reakcji PCR,
potwierdzając obecność insercji w oczekiwanym genie oraz homozygotyczność linii
insercyjnych. Potwierdzono także obecność genu REP wprowadzonego na plazmidzie do linii
rewertanta. Stwierdzono transkrypcję genu REP w linii typu dzikiego oraz rewertanta.
Wykryto ją także w jednej z linii insercyjnych.
Dokonano pomyślnego klonowania białka RabA2a, co potwierdzono przy pomocy
sekwencjonowania. Używany plazmid pozwolił na ekspresję białka w fuzji z transferazą
S-glutationową. Białko fuzyjne uzyskano w wyniku nadekspresji w hodowli bakteryjnej
i oczyszczono na złożu z glutationem. Stwierdzono częściowy rozpad białka fuzyjnego
GST-RabA2a, jednak ze względu na problemy związane z oczyszczaniem produktów
trawienia zdecydowano się używać preparatu zawierającego białko fuzyjne. Przeprowadzono
reakcję
prenylacji
uzyskanego
białka
rekombinowanego
RabA2a
in vitro, z użyciem frakcji cytozolowych (supernatant po wirowaniu 105 000 G) stosowanych
linii roślinnych jako źródłem geranylogeranylotransferazy-II i difosforanem geranylogeranylu
wyznakowanym trytem jako substratem lipidowym. Wyniki reakcji nie były zgodne
z oczekiwanymi. Nie zaobserwowano tendencji do zmniejszonej aktywności enzymu w linii
inercyjnej, co może być jednak spowodowane specyfiką metody.
Przygotowano
preparat
geranylogeraniolu
wyznakowanego
trytem
jako
jeden
z substratów do znakowania metabolicznego in vivo. Dostępny preparat geranylogeraniolu
oczyszczono, a następnie wyznakowano w dwuetapowej reakcji obejmującej utlenianie
alkoholu do aldehydu i jego ponowną redukcję przy pomocy wyznakowanego trytem
reduktora. Produkt reakcji oczyszczono i oznaczono jego aktywność. Następnie
przeprowadzono znakowanie metaboliczne in vivo z jego użyciem. Jako drugi stosowano
wyznakowany
trytem
preparat
mewalonianu,
prekursora
biosyntezy
związków
izoprenoidowych. Badano prenylację endogennych białek Rab. Wyniki okazały się być
niezadowalające w przypadku znakowania z użyciem mewalonianu, jednak należy tu wziąć
po uwagę fakt, iż związek ten jest prekursorem syntezy wielu związków izoprenoidowych
takich jak prenole, sterole, karotenoidy i inne. Możliwe więc, iż został spożytkowany przez
roślinę do syntezy związków innych niż geranylogeraniol. Wyniki otrzymane dla znakowania
metabolicznego in vivo z użyciem wyznakowanego trytem geranylogeraniolu zdają się być
najbardziej obiecujące. Można zauważyć pewną tendencję do zmniejszonego włączania
substratu lipidowego do białek Rab w linii insercyjnej SALK_140044, co może prowadzić do
potwierdzenia
wpływu
białka
REP
na
aktywność
geranylogeranylotransferazy-II
u Arabidopsis thaliana. Wymaga to jednak dopracowania metody i powtórzenia badań.
Wyniki przeprowadzonych reakcji nasunęły przypuszczenia iż wstawka insercyjna
w linii SALK_140044 może znajdować się poza obszarem kodującym, podobnie jak
w linii SALK_130575. Wykonane pozycjonowanie wstawki oraz analizy Western blot
pozwoliły na stwierdzenie iż wstawka insercyjna powoduje skrócenie transkryptu
i powstanie hybrydowego, nieznacznie zmienionego białka REP. Można przypuszczać iż
białko hybrydowe ma podobną aktywność lecz zmienione wymagania substratowe.