wersja pdf - Konferencja IPB

Ekspresja wybranych genów ARF w elementach kwiatów odpadających
i nieodpadających łubinu żółtego (Lupinus luteus)
Milena Kulasek(1), Paulina Glazińska(1), Jacek Kęsy(1), Jan Kopcewicz(1)
(1) Katedra Fizjologii Roślin i Biotechnologii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
Wstęp i cel badań
Łubin żółty (Lupinus luteus) jest ważną rośliną użytkową.
Jednym z głównych problemów związanych z jego uprawą
jest odpadanie znacznej części kwiatów, w wyniku czego
tylko niewielka ich część (ok. 20%) przekształca się w
dojrzałe strąki (Rys. 1). Z danych literaturowych wiadomo,
że u Arabidopsis w tym procesie uczestniczy auksyna [1],
m.in. poprzez aktywność szlaku transdukcji sygnału
auksyny. Transdukcja sygnału auksynowego obejmuje
szereg reakcji, w wyniku których następuje odpowiedź
rośliny na fitohormon, co prowadzić może między innymi
do zmian fizjologicznych w roślinie. W skład szlaku
wchodzi białko F-box kompleksu SCF (z ang. SKP1-Cullin-Fbox-RBX1) z receptorem auksyn z rodziny TAAR (TIR1/AFB
AUXIN RECEPTOR), a mianowicie TRANSPORT INHIBITOR
RESPONSE 1 (TIR1) i jego homologi AUXIN SIGNALING FBOX PROTEIN (AFB), białka AUX/IAA oraz czynniki
transkrypcyjne AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) (Rys. 2).
Wiadomo, że u Arabidopsis w proces odcinania jest
zaangażowany gen ARF2 [2]. Celem przedstawionych
badań jest określenie, czy i które geny ARF są
zaangażowane w to zjawisko u łubinu żółtego.
Rys. 1. Problem nadmiernego odpadania
kwiatów: poniżej 50% kwiatów
rozwija się w strąki, z których tylko
30% pozostaje na roślinie i rozwija
się w duże strąki zawierające
dojrzałe nasiona.
Rys. 2. Schemat obrazujący zasadę działania ścieżki
transdukcji sygnału auksyny, za pomocą którego
wyzwalana jest odpowiedź genetyczna na ten
fitohormon.
Materiały i metody
Tab. 1. Wykaz starterów i sond UPL (typu Taq-Man) użyta
do przeprowadzenia reakcji RT-qPCR do analizy
ekspresji wybranych genów ARF łubinu żółtego.
Gen
ARF2
ARF6
ARF8
ACT
Startery
prawy
CATGGACTACTACCTACCACATTGA
TCACAGTTTGTGGTCGATTTG
AATATTGTGAAGTTGGCAAATCAA
ATGGGCACTGTATGGCTCAC
lewy
GGCCCTCTACCTAACCCTGT
GCTGTGCTGTTTATCTGGAATG
GGCCACATACCAAATTACCC
TGGACGTACTACAGGTATTGTGC
Sonda
UPL
#155
#142
#97
#9
Materiał do analiz aktywności genów ARF stanowiły kwiaty łubinu żółtego uprawianego w warunkach
polowych, zebrane osobno z dolnych okółków (kwiaty nieodpadające) i z górnych okółków (kwiaty
odpadające). Kwiaty rozdzielono na poszczególne części (płatki, kielich, dno, pręciki i słupki) i natychmiast
zamrożono w ciekłym azocie, a następnie zhomogenizowano.
Izolacja całkowitego RNA została przeprowadzona za pomocą zestawu Isolate II RNA Plant kit (Bioline).
Odwrotna transkrypcja została przeprowadzona za pomocą zestawu TRANSCRIPTME RNA kit (DNA Gdansk).
Reakcja Real-Time PCR została przeprowadzona z wykorzystaniem starterów i sond przedstawionych w Tab.
1, oraz zestawu Probe Fast qPCR Kit (KAPA) master mix i termocyklera LightCycler 480 (Roche). Genem
referencyjnym był gen kodujący aktynę (ACT).
Wyniki i wnioski
6
5
4
3
2
Rys. 3. Wykresy
przedstawiające wyniki
reakcji RTqPCR dla
genów: ARF2
(po lewej),
ARF6 (w
środku) i
ARF8 (po
prawej).
1
dno
0
kielich
dno
kielich
pręciki
słupki
0
dolne
pręciki
2
górne
7
słupki
4
8
platki
6
Względna aktywność genu ARF8
8
dno
10
dolne
kielich
12
górne
pręciki
14
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
słupki
dolne
platki
górne
Względna aktywność genu ARF6
16
platki
Względna aktywność genu ARF2
Profil aktywności genów ARF2, ARF6 i ARF8 w różnych częściach kwiatów nieodpadających i odpadających
jest inny (Rys. 3). Taki wynik wskazuje na ich zaangażowanie w regulacje odpadania lub utrzymywania
organów generatywnych łubinu.
Referencje i źródło finansowania
[1] Basu, M.M., Gonzales-Carranza, Z.H., Azam-Ali, S., Tang, S., Shahid, A.A., Roberts, J.A. (2013) The manipulation of auxin in the abscission zone
cells of Arabidopsis flowers reveals that indoleacetic acid signaling is a prerequisite for organ sheding, Plant Physiology, 162(1):96-106.
[2] Ellis, C.M., Nagpal, P., Young, J.C., Hagen, G., Guilfoyle, T.J., Reed, J.W. (2005) AUXIN RESPONSE FACTOR1 and AUXIN RESPONSE FACTOR2
regulate senescence and floral organ abscission in Arabidopsis thaliana, Development, 132:4563-4574.
Praca finansowana w ramach grantu indywidualnego dla doktorantów UMK 2567-B.