Kliknij aby pobrać specyfikacje PDF

NOVAZYM POLSKA nr 1 / 2012
Amplifikacja in vitro wybranych
odcinków DNA i RNA metodą
Loop-mediated
mediated isothermal
AMPlification(LAMP)
LAMP is registered trademark owned by Eiken Chemical Co., Ltd.
Opracowanie:
Marta Jankowska
Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności
Żywnoś
Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
Adam Burzyński
Novazym Polska
POZNAŃ 2012
SPIS TREŚCI
WSTĘP...................................................................................................................................................... 3
LAMP Loop-mediated isothermal AMPlification ................................................................................. 3
Historia ................................................................................................................................................ 3
Publikacje naukowe na temat LAMP ................................................................................................... 3
Zakres wykorzystywania LAMP: .......................................................................................................... 4
Wirusy: ................................................................................................................................................ 4
Bakterie: .............................................................................................................................................. 5
Grzyby:................................................................................................................................................. 6
Pierwotniaki:........................................................................................................................................ 6
GMO: ................................................................................................................................................... 6
LAMP - Zasada działania reakcji: ............................................................................................................. 7
Przykład reakcji (dla 2 par starterów) ................................................................................................. 7
Warunki reakcji LAMP: ........................................................................................................................ 9
Projektowanie starterów do LAMP ................................................................................................... 10
Zasady projektowania starterów do LAMP: ...................................................................................... 10
Parametry starterów: ........................................................................................................................ 11
Programy do projektowania starterów: ............................................................................................ 12
Detekcja i wizualizacja LAMP................................................................................................................. 13
Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP („LAMPlikons”) ....................................... 13
Metody detekcji ................................................................................................................................ 13
1.
Elektroforeza w żelu agarozowym ........................................................................................ 13
2.
Analiza turbidymetryczna ...................................................................................................... 13
3.
Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym ................................................................. 14
4.
Analiza fluorymetryczna ........................................................................................................ 15
5.
Fluorescencja w czasie rzeczywistym .................................................................................... 15
Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP .............................................................................. 16
Badanie SNP metodą LAMP................................................................................................................... 17
Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria dla izotermicznej amplifikacji DNA firmy OptiGene®. ......... 18
Genie®II – zinegrowana elastyczna platforma .................................................................................. 18
GspSSD® Polimeraza: ......................................................................................................................... 18
Podsumowanie ...................................................................................................................................... 20
Bibliografia............................................................................................................................................. 21
Strona
Zalety i wady LAMP ........................................................................................................................... 20
2
Isothermal Master Mix ...................................................................................................................... 19
WSTĘP
LAMP Loop-mediated isothermal AMPlification
• Nowa metoda amplifikacji kwasów nukleinowych, która pozwala na szybką identyfikację
patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych.
• Metoda polega na syntezie nowych nici DNA na matrycy (DNA lub RNA) w kolejnych cyklach
reakcji oraz zastępowaniu (wymianie) łańcuchów DNA (ang. Stand displacement) przez łańcuchy
nowo zsyntetyzowane.
• Polimeraza wykorzystywana w reakcji posiada aktywność syntezy nici DNA w kierunku 5’->3’ oraz
wymiany nici, nie posiada aktywności egzonuklotydowej
• Powstałeamplifikowane
produkty
posiadają
strukturę
składającą
się
znaprzemianodwróconychpowtórzeńsekwencjimatrycowej na tym samym łańcuchu,
• Produkt LAMP jest mieszaniną łańcuchów DNA tworzących struktury typu łodyga-pętla (ang.
Stem-loop) różniących się wielkością,
• Uzyskany produkt posiada wysoką specyficzność do matrycy poprzez zastosowanie 2 par
starterów komplementarnych do 6 niezależnych miejsc na matrycy w początkowym etapie reakcji
oraz 4 niezależnych miejsc w kolejnych etapach LAMP.
• Amplifikacja przebiega w warunkach izotermicznych (w stałej temperaturze)
Historia
•
•
•
•
•
•
•
•
1998 – opracowanie metody LAMP przez japońską firmę EIKEN CHEMICAL CO., LTD
2000 – pierwsza publikacja naukowa nt. LAMP (Loop-mediatedisothermalamplification of DNA.,
Notomi T,Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T.)
2002 –pojawienie się na rynku komercyjnych zestawów do prowadzenia reakcji LAMP
2006 – pojawienie się zestawów do wykrywania patogenów w żywności i w środowisku
(Cryptosporidium, Salmonella, Escherichia coli, Listeriamonocytogenesetc.).
2009 – założenie w UK firmy OptiGeneLtd
2011 - umowa licencyjna pomiędzy OptiGeneLtd i Eiken Chemical Co., Ltd. zezwalające OptiGene
na rozwijanie i sprzedaż urządzeń i produktów do prowadzenia LAMP
2011 – wprowadzenie na rynek przez OptiGeneLtd w pełni zintegrowanej platformy Genie II do
prowadzenia reakcji LAMP w czasie rzeczywistym
2012 – umowa pomiędzy Novazym Polska sc i OptiGeneLtd
Publikacje naukowe na temat LAMP
Wykorzystywanie reakcji LAMP (liczba publikacji na przestrzeni lat, na podstawie PubMED)
Rysunek 1Liczba publikacji w latach 2000-2011
Strona
3
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Obecnie >600 publikacji, (w 2012 – 16 publikacji)
Zakres wykorzystywania LAMP:
Wykrywanie obecności patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych, technika wykorzystywana w
badaniach weterynaryjnych, środowiskowych, rolnictwie, badaniach żywności, diagnostyce
laboratoryjnej.
Ponad 200 genówzamplifikowano techniką LAMP
Szeroki zakres zastosowań (przykłady poniżej):
Strona
influenza A (Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal
amplification.Poon LL, Leung CS, Chan KH, Lee JH, Yuen KY, Guan Y, Peiris JS.J ClinMicrobiol. 2005
Jan;43(1):427-30.)
herpes simplex (Rapid diagnosis of herpes simplex virus infection by a loop-mediated
isothermal amplification method. Enomoto Y, Yoshikawa T, Ihira M, Akimoto S, Miyake F, Usui C,
Suga S, Suzuki K, Kawana T, Nishiyama Y, Asano Y.ClinMicrobiol. 2005 Feb;43(2):951-5.)
Ebola virus (Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated
isothermal amplification. Kurosaki Y, Takada A, Ebihara H, Grolla A, Kamo N, Feldmann H,
Kawaoka Y, Yasuda J. J Virol Methods. 2007 Apr;141(1):78-83. Epub 2006 Dec 27.
Vibrio cholerae (Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using
a loop-mediated isothermal amplification. Yamazaki W, Seto K, Taguchi M, Ishibashi M, Inoue K.
BMC Microbiol. 2008 Jun 12;8:94.
A rapid, simple, and sensitive loop-mediated isothermal amplification method to detect
toxigenic Vibrio cholerae in rectal swab samples. Okada K, Chantaroj S, Taniguchi T, Suzuki Y,
Roobthaisong A, Puiprom O, Honda T, Sawanpanyalert P. DiagnMicrobiol Infect Dis. 2010
Feb;66(2):135-9. Epub 2009 Oct 7.
Establishment and application of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid
diagnosis of Vibrio cholerae. Ke XM, Chen YY, Gao LL, DU ZP, Feng XM, Liao RY, Chen ZY, Cao YC,
Chen Q. Nan Fang Yi Ke Da XueXueBao. 2009 Oct;29(10):2059-63. Chinese.)
porcine parvovirus(Detection of porcine parvovirus by loop-mediated isothermal
amplification.Chen CM, Cui SJ. J Virol Methods. 2009 Feb;155(2):122-5. Epub 2008 Nov 20.
epidemic diarrhea virus(Development of reverse transcription loop-mediated isothermal
amplification for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus. Ren X, Li P. Virus Genes.
2011 Apr;42(2):229-35. Epub 2011 Feb 1.)
porcine circovirus type 2(Specific, simple and rapid detection of porcine circovirus type 2 using
the loop-mediated isothermal amplification method. Zhao K, Shi W, Han F, Xu Y, Zhu L, Zou Y,
Wu X, Zhu H, Tan F, Tao S, Tang X.Virol J. 2011 Mar 18;8:126.)
human papillomavirus (Rapid detection of the most common high-risk human papillomaviruses
by loop-mediated isothermal amplification.Saetiew C, Limpaiboon T, Jearanaikoon P, Daduang
S, Pientong C, Kerdsin A, Daduang J.J Virol Methods. 2011 Dec;178(1-2):22-30. Visual detection
of high-risk human papillomavirus genotypes 16, 18, 45, 52, and 58 by loop-mediated
isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye.Luo L, Nie K, Yang MJ, Wang M, Li J,
Zhang C, Liu HT, Ma XJ.J ClinMicrobiol. 2011 Oct;49(10):3545-50. Colorimetric detection of HPV6
and HPV16 by loop mediated isothermal amplification.Lu CB, Luo L, Yang MJ, Nie K, Wang M,
Ma XJ.Bing Du XueBao. 2011 Jan;27(1):64-70. Chinese.Loop-mediated isothermal amplification
4
Wirusy:
method for detection of human papillomavirus type 6, 11, 16, and 18.Hagiwara M, Sasaki H,
Matsuo K, Honda M, Kawase M, Nakagawa H. J Med Virol. 2007 May;79(5):605-15.)
Strona
Mycobacterium tuberculosis(Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of
Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare in sputum
samples.Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K.J ClinMicrobiol. 2003 Jun;41(6):2616-22.Use of visual
loop-mediated isotheral amplification of rimM sequence for rapid detection of Mycobacterium
tuberculosis and Mycobacterium bovis.Zhu RY, Zhang KX, Zhao MQ, Liu YH, Xu YY, Ju CM, Li B,
Chen JD.J Microbiol Methods. 2009 Sep;78(3):339-43. Epub 2009 Jul 17. Erratum in: J Microbiol
Methods. 2009 Nov;79(2):250.)
Streptococcus pneumoniae(Loop-mediated isothermal amplification method targeting the lytA
gene for detection of Streptococcus pneumoniae.Seki M, Yamashita Y, Torigoe H, Tsuda H, Sato
S, Maeno M.J ClinMicrobiol. 2005 Apr;43(4):1581-6.)
Clostridium difficile(Rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium
difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification.Kato H, Yokoyama T,
Kato H, Arakawa Y.J ClinMicrobiol. 2005 Dec;43(12):6108-12.Campylobacter jejuni
(Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and
simple detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli.Yamazaki W, Taguchi M,
Ishibashi M, Kitazato M, Nukina M, Misawa N, Inoue K.J Med Microbiol. 2008 Apr;57(Pt 4):44451.)
Clostridium botulinum(Rapid and simple detection of Clostridium botulinum types A and B by
loop-mediated isothermal amplification.Sakuma T, Kurosaki Y, Fujinami Y, Takizawa T, Yasuda J.J
ApplMicrobiol. 2009 Apr;106(4):1252-9. Epub 2009 Jan 30.
Salmonella (A loop-mediated isothermal amplification method targets the phoP gene for the
detection of Salmonella in food samples.Li X, Zhang S, Zhang H, Zhang L, Tao H, Yu J, Zheng W,
Liu C, Lü D, Xiang R, Liu Y.Int J Food Microbiol. 2009 Aug 15;133(3):252-8. Epub 2009 Jun 1.The
rapid detection of Salmonella from food samples by loop-mediated isothermal amplification
(LAMP).Ueda S, Kuwabara Y.Biocontrol Sci. 2009 Jun;14(2):73-6.Rapid, sensitive, and specific
detection of the O4 group of Salmonella enterica by loop-mediated isothermal
amplification.Okamura M, Ohba Y, Kikuchi S, Takehara K, Ikedo M, Kojima T, Nakamura M.Avian
Dis. 2009 Jun;53(2):216-21.)
Escherichia coli O157 (Development and application of a loop-mediated isothermal
amplification method on rapid detection Escherichia coli O157 strains from food samples.Zhao
X, Li Y, Wang L, You L, Xu Z, Li L, He X, Liu Y, Wang J, Yang L.MolBiol Rep. 2010 Jun;37(5):2183-8.
Epub 2009 Aug 15.
Staphylococcus aureus (Loop-mediated isothermal amplification assays for identification of
antiseptic and methicillin-resistant Staphylococcus aureus.Hanaki K, Sekiguchi J, Shimada K,
Sato A, Watari H, Kojima T, Miyoshi-Akiyama T, Kirikae T.J Microbiol Methods. 2011
Feb;84(2):251-4. Epub 2010 Dec 16.)
Listeria monocytogenes (Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by loopmediated isothermal amplification.Tang MJ, Zhou S, Zhang XY, Pu JH, Ge QL, Tang XJ, Gao
YS.CurrMicrobiol. 2011 Dec;63(6):511-6. Epub 2011 Sep 21.)
5
Bakterie:
Clostridium perfringensDetection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples
by using molecular methods.Kaneko I, Miyamoto K, Mimura K, Yumine N, Utsunomiya H,
Akimoto S, McClane BA. Appl Environ Microbiol. 2011 Nov;77(21):7526-32. Epub 2011 Sep 2.
Grzyby:
Paracoccidioidesbrasiliensis (Detection of gp43 of Paracoccidioidesbrasiliensis by the loopmediated isothermal amplification (LAMP) method.Endo S, Komori T, Ricci G, Sano A, Yokoyama
K, Ohori A, Kamei K, Franco M, Miyaji M, Nishimura K.FEMS MicrobiolLett. 2004 May 1;234(1):937.
Candida (Efficient identification of clinically relevant Candida yeast species by use of an assay
combining panfungal loop-mediatedisothermal DNA amplification with hybridization to
species-specific oligonucleotide probes.Inácio J, Flores O, Spencer-Martins I.J ClinMicrobiol.
2008 Feb;46(2):713-20. Epub 2007 Dec 12.
Pneumocystis pneumonia (Development of a loop-mediated isothermal amplification method
for diagnosing Pneumocystis pneumonia.Uemura N, Makimura K, Onozaki M, Otsuka Y, Shibuya
Y, Yazaki H, Kikuchi Y, Abe S, Kudoh S.J Med Microbiol. 2008 Jan;57(Pt 1):50-7.)
Pierwotniaki:
Toxoplasma gondii (Toxoplasma gondii: sensitive and rapid detection of infection by loopmediated isothermal amplification (LAMP) method.Zhang H, Thekisoe OM, Aboge GO, Kyan H,
Yamagishi J, Inoue N, Nishikawa Y, Zakimi S, Xuan X.ExpParasitol. 2009 May;122(1):47-50. Epub
2009 Feb 1.)
Wuchereriabancrofti (Development of loop-mediated isothermal amplification method for
detecting Wuchereriabancrofti DNA in human blood and vector mosquitoes.Takagi H, Itoh M,
Kasai S, Yahathugoda TC, Weerasooriya MV, Kimura E.Parasitol Int. 2011 Dec;60(4):493-7. Epub
2011 Sep 10.
Plasmodium
falciparum(Development
of
a
reverse
transcription-loopmediatedisothermalamplification(RT-LAMP) for clinical detection of Plasmodium falciparum
gametocytes.Buates S, Bantuchai S, Sattabongkot J, Han ET, Tsuboi T, Udomsangpetch R,
Sirichaisinthop J, Tan-ariya P.Parasitol Int. 2010 Sep;59(3):414-20. Epub 2010 Jun 10.
GMO:
Strona
6
Detection of genetically modified organisms (GMOs) using isothermal amplification of target
DNA sequences. Lee D, La Mura M, Allnutt TR, Powell W. BMC Biotechnol. 2009 Feb 2;9:7.
Sensitive and rapid detection of genetic modified soybean (Roundup Ready) by loop-mediated
isothermal amplification. Liu M, Luo Y, Tao R, He R, Jiang K, Wang B, Wang L.
BiosciBiotechnolBiochem. 2009 Nov;73(11):2365-9. Epub 2009 Nov 7.
LAMP - Zasada działania reakcji:
Kolejne cykle wydłużania i zastępowania nici prowadzone są przy użyciu odpowiedniej
polimerazy i 2 lub 3 par starterów rozpoznających odpowiednio 6 lub 8 miejsc matrycy.
Startery wewnętrzne to FIP (Forward Inner Primer) oraz BIP (Backward Inner Primer), sekwencję ich
są komplementarne do dwóch różnych odległych miejsc w sekwencji matrycy (nici sensownej i
antysensownej). Startery zewnętrzne F3 (Forward) i B3(Backward) komplementarne są do
zewnętrznych końców matrycy. Startery zewnętrzne są krótsze od starterów wewnętrznych i ich
końcowe stężenie w reakcji jest mniejsze dlatego wolniej hybrydyzują do matrycy inicjując reakcję
zastępowania nici.Dodatkowo dla wzmocnienia reakcji można zastosować startery LoopF i LoopR.
Zastosowana polimeraza DNA posiada aktywność zastępowania nici DNA dzięki czemu nie potrzebna
jest dodatkowa denaturacja matrycy i reakcję można prowadzić w warunkach izotermicznych.
Kluczową cechą LAMP jest utworzenie w pierwszym etapie reakcji sztucznej matrycy (ssDNA) o
strukturze typu łodyga-pętla, przez tzw. self-priming końców matrycy. Matryca w następnych
etapach jest amplifikowana, co prowadzi do powstania mieszaniny dwuniciowego DNA o strukturze
podobnej do kalafiora.
Proces można podzielić na etapy:
1. Tworzenie materiału starterowego LAMP
2. Cykliczna amplifikacja
3. Elongacja i recyklizacja
Przykład reakcji (dla 2 par starterów)
Gdy dsDNA osiągnie stan równowagi (65oC) wówczas pierwszy z starterów wewnętrznych może
przyłączyć się do komplementarnej sekwencji matrycy inicjując syntezę nowej nici DNA. Polimeraza
DNA o aktywności zastępującej wydłuża starter w kierunku 5’->3’.
Strona
7
Następnie starter zewnętrzny F3 hybrydyzuje do miejsca F3c matrycy i następuje jego wydłużanie
Następuje wydłużanie startera F3 oraz zastępowanie nici oflankowanej starterem FIP.
Nowo powstały dsDNA (powyżej) uwolniony ssDNA (poniżej).
Uwolniona nićssDNA oflankowana starterem FIP tworzy na końcu 5’ strukturę pętli z powodu
komplementarności sekwencji F1c z końca do sekwencji F1 w środku. Nić ta jest matrycą dla
kolejnego startera wewnętrznego BIP, następuje wydłużenie i powstanie nowej nici oraz struktura
pętli powraca do formy liniowej. Następnie starter B3 przyłącza się na zewnątrz od BIP, następuje
wydłużanie nowej nici i uwolnienie ssDNA.
Uwolniona nić ssDNA tworzy strukturę pętli na obydwu końcach (struktura przypominająca hantle).
Tak powstała struktura stanowi matrycę dla rozpoczęcia kolejnego etapu reakcji: cyklicznej
amplifikacji.
Strona
8
STRUKTURA STARTEROWA DLA REAKCJI LAMP
Rozpoczyna się etap cyklicznej amplifikacji, starter FIP przyłącza się do ssDNA i zaczyna się synteza
nowej kolejnej nici w kierunku 5’->3’, uwalniając wcześniej zsyntetyzowaną nić. Następnie na końcu
3’ regionu B1 następuje wydłużenie nici i uwolnienie nici oflankowanej starterem FIP (9). Uwolniona
nić tworzy strukturę hantli z pętlami na obydwu końcach (11). Powstała nic jest odwróceniem nici (8).
Podobnie jak w etapach (8) do (11) następuje tzw. self-priming matrycy (11), dodatkowo starter BIP
hybrydyzuje do regionu B2c i następuje wydłużanie starterów i zastępowanie i uwalnianie kolejnej
nici DNA. W trakcie reakcji wydłużania starterów, self-priming matrycy oraz zastępowania nici
powstają produkty składające się zna przemianodwróconychpowtórzeńsekwencji matrycowej na tym
samym łańcuchu.
Animacja reakcji LAMP: http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html
•
•
•
Temperatura: 60-65oC (~63oC) – warunki izotermiczne
Objętość reakcji: 25µl
Enzym: Polimeraza DNA, 8U/reakcję
Startery:
o Wewnętrzne (FIP, BIP): 1,6µM
o Zewnętrzne (F3, B3):0,2µM
o Loop (LF, LB): 0,8 µM
Trójfosforany deoksyrybonukleotydów (dNTP-y): 1,4mM każdego
Próba: ~5µl/reakcję
Czas reakcji: do 1 godziny
Strona
•
•
•
•
9
Warunki reakcji LAMP:
Projektowanie starterów do LAMP
Odpowiednie zaprojektowanie starterów jest kluczowym etapem poprawnego przeprowadzenia
reakcji LAMP.
FIP (Forward Inner Primer) - zawiera na końcu 3’ region F2 komplementarny do F2c matrycy oraz na
końcu 5’ region F1c.
BIP (Backward Inner Primer) - zawiera na końcu 3’region B2 komplementarny do B2c matrycy oraz na
końcu 5’ region B1c
F3 (ForwardPrimer) - starter zewnętrzny zawiera w swojej sekwencji region F3 matrycy
komplementarny do F3c
B3 (BackwardPrimer) - starter zewnętrzny zawiera w swojej sekwencji region B3 matrycy
komplementarny do B3c
Loop F (LoopForwardPrimer) – sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli pomiędzy
regionami F2 i F1 na końcu 5’ nici ssDNAo strukturze przypominającej hantle (ang.Dumbelllikestructure).
Loop B (LoopBackwardPrimer) - sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli pomiędzy
regionami B2 i B1 na końcu 5’ nici ssDNAo strukturze przypominającej hantle (ang.Dumbelllikestructure).
Rysunek 2 Sekwencje starterów wykorzystywane w reakcji LAMP
Strona
Odpowiednie i poprawne zaprojektowanie starterów wymaga postępowania krok po kroku zgodnie z
poniższymi wskazówkami:
• Określenie wymagań (celu) badań
o Matryca: Wybór odpowiednich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny
mająbyć amplifikowane (dawać pozytywny wynik reakcji),
o Określenie odpowiednich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny nie
mogą być amplifikowane (dawać negatywny wynik reakcji),
• Zebranie dostępnych sekwencji genów dla wszystkich szczepów/rodzajów mikroorganizmów,
którą mają dawać pozytywny i negatywny wynik reakcji,
• Dopasowanie i określenie regionów konserwatywnych w genomie szczepów/rodzajów
mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane, - (czułość LAMP),
• Określenie regionów unikalnych (specyficznych) w genomie szczepów/rodzajów
mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane (regiony nie występujące w
genomach mikroorganizmów, które mają dawać negatywny wynik) – (specyficzność (LAMP)
10
Zasady projektowania starterów do LAMP:
• Wykorzystanie dostępnych programów komputerowych do projektowania starterów.
W przypadku gdy zaprojektowane startery nie dają satysfakcjonującego rezultatu (brak produktu,
obecność niespecyficznych sekwencji etc.) należy ponownie zaprojektować startery.
Parametry starterów:
Odległość pomiędzy regionami starterów:
• Odległość pomiędzy końcami regionu F2 i B2 (region amplifikowany przez LAMP) powinna
wynosić 120 – 180 pz, natomiast zarówno pomiędzy F2 i F3. oraz B2 i B3 powinna wynosić 0 –
20 pz.
• Odległość dla regionów tworzących strukturę pętli (pomiędzy 5' końcem F2 i 5' końcem F1, 5'
końcem B2 i 3' końcem B1) powinna wynosić 40 – 60 pz.
• Odległość pomiędzy regionami F2 i F3 oraz B2 i B3 powinna wynosić 0 do 60.
F2
B1c
F1c
<40~60 pz>
<0~60>pz
3’
B2
B3
5’
<40~60 pz>
<120~160>pz
<0~60>pz
Temperatura topnienia (Tm):
• Około 60 – 65oC dla regionów bogatych w pary GC i ok. 55-60oC dla regionów bogatych w
pary AT
• Tm dla każdego region powinna wynosić odpowiednio: ok. 65°C (64 - 66°C) dla F1c i B1c, ok
60°C (59 - 61°C) dla F2, B2, F3, i B3, iok. 65°C (64 - 66°C) dla starterówloop.
Stabilność końców
• Końce starterów stanowią początkowy punkt dla syntezy DNA i tym samym musi posiadać
pewien stopień stabilności. Końce 3’ regionów F2/B2, F3/B3, i LF/LB oraz koniec 5’ regionów
F1c/B1c powinny być zaprojektowane tak by energia swobodna wynosiła 4kcal/mol lub mniej
(dla 6pz końca). Koniec 5’ regionu F1c po amplifikacji łączy się z końcem 3’ regionu F1 dlatego
stabilność jest bardzo istotna.
(Zmiana energii swobodnej ΔG jest różnicą pomiędzy energią swobodną produktu i energią
swobodną materiału początkowego)
• Im niższa wartość ΔG tym częściej startery przyłączają się do matrycy.
Zawartość par GC
• powinna wynosić 50-60% w przypadku matryc bogatych w pary GC, 40-50% dla matryc
bogatych w pary AT.
Tworzenie struktur dwurzędowych:
• Ważne jest w szczególności dla starterów wewnętrznych aby nie tworzyły struktur
dwurzędowych typu primer-dimer. Końce 3’ starterów nie mogą być komplementarne
względem siebie.
Inne:
• Jeżeli w sekwencji występują miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, z wyjątkiem
regionów dla starterów mogą być użyte dla potwierdzenia zamplifikowanego produktu
11
F3
Strona
5’
Programy do projektowania starterów:
Primer Explorer V4
• Automatyczne oprogramowanie stworzone przez Fujitsu Ltd i EikenChemical Co,
• Wersja V4,
• Pracuje w środowisku Windows, Internet Explorer 5+
• Dostępne na stronie internetowej: http://primerexplorer.jp/e/,
Strona
12
LAMP Designer (OptiGene Ltd)
• Automatyczne oprogramowanie stworzone przez OptiGeneLtd,
• Posiada wbudowany algorytm wyszukiwania najlepszych sekwencji starterowych
• Startery przeszukiwane są podkątem tworzenia struktur drugorzędowych, dimerów,
homologiii właściwości fizycznych zgodnie z zadanymi warunkami.
• Sekwencje matrycowe mogą być pobierane z baz danych (Acession number), z pliku w
formacie tekstowym oraz wklejane bezpośrednio w okienko programu.
• Pracuje w środowisku Windows
• Wersja demo dostępna na stronie internetowej:
http://www.optigene.co.uk/products/lamp_designer.htm
Detekcja i wizualizacja LAMP
Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP („LAMPlikons”)
Tabela 1 Porównanie produktów reakcji LAMP i PCR
Struktura
Rozmiar
Kształt
Liczb kopii genu
Stężenie
LAMP
pętla-łodyga dsDNA
różny
Przypominający kalafior
wiele kopii/1 amplikon
400-800 µg/ml
PCR
dsDNA
jednakowy
liniowy
1 kopia/1 amplikon
1012 kopii/reakcję, 4-40 µg/ml
Metody detekcji
1. Elektroforeza w żelu agarozowym
•
•
•
•
•
•
•
Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi Tet al.)
Produkty reakcji wybarwione bromkiem etydyny, rozdzielane w 2% żelu agarozowym,
Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji),
Produkt na żelu widoczny w postaci „smearu”,
Wynik tylko jakościowy,
Wizualizacja w świetle UV,
Pozwala obserwować produkt reakcji LAMP po trawieniu restrykcyjnym.
A
B
o
Rysunek 3 A. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji HBV metodą LAMP (amplifikacja w 60 C przez 60 min)
Tor 1. Marker, Tor 2-4 zamplifikowany HBV, Tor 5 K- Tor 6 K+ (produkt amplifikacji trawiony Sau 3A I)
Rysunek 3 B. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji PSA mRNA (amplifikacja w 65oC przez 60 min)
Tor 1.Marker, Tor 2K- Tor 3-4 zamplifikowany PSA mRNA, Tor 5-6 K+ (produkt amplifikacji trawiony Sau 3A I)
2. Analiza turbidymetryczna
Strona
Po raz pierwszy dla LAMP w 2001 roku (Mori et al.),
Powstający w trakcie reakcji produkt uboczny, pirofosforan magnezu, pozwala na ocenę
wyniku poprzez analizę zmętnienia
• Końcowy punkt analizy, (po zakończeniu reakcji)
• Produkt reakcji widoczny „gołym okiem”
• Wynik jakościowy
W trakcie reakcji przyłączania kolejnych nukleotydów do wydłużanego łańcucha DNA
polimeryzacji uwalniany jest z dNTP – ów pirofosforan. Duża ilość powstającego
13
•
•
piroforsforanureaguje z jonami magnezu obecnymi w buforze reakcyjnym – powstaje biały osad
(zgodnie z równaniem poniżej:
(DNA)n-1 + dNTP = (DNA)n+ P2O74-; P2O74- + 2Mg2+ = Mg2P2O7
Zmętnienie w probówce widoczne jest kiedy stężenie pirofosforanu magnezu przekracza 0,5mM.
Do powstania pirofosforanu magnezu w stężeniu powyżej 0,5mM potrzeba wytworzenia 4µgDNA
w 25µl objętości reakcji. W reakcji LAMP uzyskuje się 10µg DNA/25µl, w porównaniu w reakcji
PCR otrzymuje się ok. 0,2µg DNA/25µl, stężenie pirofosforanu magnezu wynosi wówczas
0,02mM, co nie pozwala na zaobserwowanie białego osadu. Dodatkowo warunki termiczne
(podgrzewanie) w reakcji PCR powodują że jony pirofosforanowe są hydrolizowane do jonów
fosforanowych.
Rysunek 4 Analiza turbidymetryczna LAMP. Probówka 1 - K-, Probówka 2 – amplikon LAMP.
3. Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym
•
Rysunek 5 Pomiar zmętnienia produktu reakcji LAMP w czasie rzeczywistym.
14
•
•
•
Po raz pierwszy dla LAMP w 2003 roku (Mori et al.)
Pomiar w czasie rzeczywistym, pozwala to wyeliminować etap szacowania produktu po
zakończeniu reakcji
Pomiar podobny do analizy spektrofotometrycznej
Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji
Analiza turbidymetryczna jest pomiarem pośrednim ilości DNA, gdyż opiera się na pomiarze
stężenia produktu ubocznego- pirofosforanu magnezu.
Określana jest zależność pomiędzy ilością powstającego pirofosforanu magnezu a ilością
powstającego DNA.
Strona
•
•
4. Analiza fluorymetryczna
•
•
•
•
•
•
Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi Tet al.)
Detekcja produktu przez fluorescencję,
Detektorami są cząsteczki fluorochromu emitujące światło o określonej długości po związaniu
się z dwuniciowym DNA, takie jak bromek etydyny, SYBR Green I, kalceina etc.
Końcowy punkt analizy, (po zakończeniu reakcji)
Analiza jakościowa
Wizualizacja w świetle UV, ale produkt reakcji można obserwować „gołym okiem”
A
B
Rysunek 6 A Wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (Fluorochrom: Kalceina) Jony pirofosforanowe usuwają jony
manganu z kalceiny, fluorescencja wzrasta im więcej kalceiny łączy się z uwolnionymi z DTP-ów jonami
magnezu. Probówka 1 - K-, Probówka 2 – amplikon LAMP
Rysunek6 B Wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (Fluorochrom: Bromek Etydyny) – obraz w świetle UV;
Probówka 1 - K-, Probówka 2 – amplikon LAMP
5. Fluorescencja w czasie rzeczywistym
•
•
•
•
A
Pomiar w czasie rzeczywistym, pozwala to wyeliminować etap szacowania produktu po
zakończeniu reakcji
Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji
Monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie przez pomiar fluorescencji
Specyficzność reakcji, analiza temperatury annealingu produktu
B
Strona
15
Rysunek 7A Pomiar fluorescencji reakcji LAMPw czasie rzeczywistym
Rysunek 7 B Krzywa annealingu produktu reakcji LAMP
Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP
Przed przystąpieniem do obliczania wskaźników wydajności LAMP należy:
1. Określić, które z badanych prób mają dać wynik pozytywny a które negatywny,
2. Zebrać jak największą liczbę prób, które stanowią będą stanowiły odniesienie (tzw. próby
referencyjne): faktycznie dające wynik pozytywny, faktycznie dające wynik negatywny
3. Zbadać każdą próbę i określić, które w reakcji LAMP dają wynik pozytywny, a które wynik
negatywny
4. Zebrane dane liczbowe umieścić w tabeli tzw. tablicy 2X2
Test (+)
Test (-)
SUMA
P. odniesienia (+)
Prawdziwie dodatnie (PD)
Fałszywie ujemne (FJ)
suma (PP+FJ)
P. odniesienia (-)
Fałszywie dodatnie (FD)
Prawdziwie ujemne (PJ)
suma (FD+PJ)
suma (PD+FD)
suma (FN+PN)
SUMA
Wskaźniki:
Czułość –zdolność do wykrycia badanej cechy, stosunek wyników prawdziwie dodatnich do faktycznie
posiadających daną cechę.
CZ=PP/(PP+FN) [%]
Specyficzność – część negatywnych prób odniesienia, która w reakcji dała wynik negatywny,
stosunek wyników prawdziwie ujemnych do faktycznie nie posiadających danej cechy.
Sp= PJ/FD+PJ [%]
Predykcja dodatnia – iloraz wyników prawdziwie dodatnich oraz sumy wyników prawdziwie
dodatnich i fałszywie dodatnich (czyli wszystkich dodatnichwyników testu).
Pd=PD/(PD+FD) [%]
Strona
16
Predykcja ujemna – iloraz wyników prawdziwie ujemnych oraz sumy wyników prawdziwie ujemnych
i fałszywie ujemnych (czyli wszystkich ujemnych wyników testu).
Wydajność – określa jak często w reakcji otrzymujemy poprawny wynik
W=(PP+PJ)/SUMA
Badanie SNP metodą LAMP
Polimorfizm pojedynczego nukleotydu(ang.SingleNucleotidePolymorphism, SNP) to zmienność
sekwencjiDNA, która polega na zmianie pojedynczegonukleotydu pomiędzy osobnikami danego
gatunku lub drugim, odpowiadającymchromosomemdanego osobnika.
Wysoka specyficzność co do sekwencji reakcji LAMP powoduje, że tylko docelowa sekwencja
(zawierająca SNP) zostanie zamplifikowana spośród sekwencji homologicznych.
Występowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu można potwierdzić przez obecność
zamplifikowanego produktu w reakcji. Możliwe to jest przez dzięki odpowiedniemu zaprojektowaniu
starterów do reakcji. Startery FIP i BIP do reakcji SNP-LAMP projektowane są w taki sposób, że na
końcach 5’zawierają SNP – (Wild Type allele). Kiedy matrycą w reakcji jest allel WT wówczas w trakcie
reakcji powstaje struktura starterowa i reakcja jest kontynuowana. W przypadku gdy matrycą jest
zmutowana sekwencja genu nie otrzymujemy produktu w reakcji.
Rysunek 8 Przebieg reakcji LAMP dla SNP
Strona
17
Animacja reakcji LAMP:http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/snps_anim.html
Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria dla izotermicznej amplifikacji DNA firmy OptiGene®.
OptiGene®stosuje izotermiczne metodę amplifikacji znane jako LAMP, która została opracowana
przez EikenChemical Company Ltd z Japonii. Dużą zaletą tej metody jest prowadzenie reakcji w stałej
temperaturze, co eliminuje konieczność stosowania specjalistycznej aparatury. W wielu przypadkach
nie potrzebna jest ekstrakcja DNA. Czas oczekiwania na wynik reakcji jest bardzo krótki (detekcja
produktu w trakcie trwania reakcji).
Genie®II – zinegrowana elastyczna platforma
Genie II to zaawansowanenarzędzie, którepozwala na wykrywanie bakterii i wirusówna poziomie
molekularnym.
Pozwala na prowadzenie izotermicznej reakcji w czasie rzeczywistym (Real-time)na przenośnej
platformie o niskim poborze mocy dedykowanej dla badań laboratoryjnych. System zamknięty
prowadzenia reakcji zapobiega kontaminacji amplifikowanego produktu.
Genie®II jest urządzeniem wyposażonym w dwa niezależne bloki grzejne każdy mieszczący 8
mikroprobówek (0,2 ml), odpowiednich dla urządzenia. Genie®II posiada funkcję gradientową oraz
umożliwia zaprogramowanie dodatkowego annealingu dla potwierdzenia obecności
amplifikowanego produktu.
Najważniejsze funkcje:
• Szybka izotermiczna amplifikacja
• Potwierdzenie poprawności wyniku poprzez analizę krzywej annealingu (podobna do analizy
krzywej topnienia produktu)
• Niskie koszty i łatwość obsługi
• Kompaktowe, przenośne i wytrzymałe urządzenie
• Zasilanie sieciowe lub bateryjne
• Łatwy dostęp do danych przez urządzenie USB
• Obsługa za pomocą komputera lub niezależnie przez ekran dotykowy
Rysunek 9 Genie II – urządzenie do prowadzenia i detekcji produktu reakcji LAMP
•
•
Polimeraza z Geobacillus sp. pozwala na uzyskanie z niewielkiej ilości matrycy 109 kopii DNA
w czasie krótszym niż 30 minut.
Pozwala na amplifikację matrycy w znacznie krótszym czasie w porównaniu do Bst
Polimerazy.
Pozwala na uzyskanie produktu o wysokiej specyficzności,
Strona
•
18
GspSSD® Polimeraza:
•
•
•
Pozwala na prowadzenie reakcji w warunkach izotermicznych bez konieczności
wykorzystywania specjalistycznej aparatury jak w przypadku reakcji amplifikacji In vitro
metodą PCR
Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy
Pozwala na zamplifikowanie RNA z wysoką specyficznością, bez dodatkowego dodawania
odwrotnej transkryptazy.
Isothermal Master Mix
Izotermiczna mieszanina do amplifikacji, (Master mix) do prowadzenia reakcji LAMP, pozwala na
fluorescencyjną detekcję produktu na platformie Genie II oraz innych urządzeniach
fluorymetrycznych ustawionych na wzbudzenie przy 488nM i emisję przy 520nM. Może być także
wykorzystywana na urządzeniach dla reakcji ilościowego PCR (qPCR, Real-time PCR) ustawionych na
kanał FAM. Krzywa annealingu jest generowana dla potwierdzenia produktu. Eliminuje to
konieczność prowadzenia dodatkowej detekcji w żelach agarozowych i analizy turbidymetrycznej
oraz pozwala na prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym. (close-tube system)
Typowe warunki reakcji dla Isothermal Master Mix to:
19
Amplifikacja 30 minut w 65oC
Annealing co 0,05oC w przedziale 98oC – 80oC
Strona
•
•
Zalety i wady LAMP
Zalety:
•
•
•
•
•
•
Szybka, krótki czas reakcji (można zaobserwować produkt po 20 min)
Czuła i specyficzna, dzięki zastosowaniu starterów rozpoznających 6-8 miejsc na matrycy,
Izotermiczna, możliwość prowadzenia reakcji w stałej temperaturze
Prostsze i tańsze urządzenia niż w real-time PCR, przy porównywalnej czułości
Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy
Produkt reakcji można zaobserwować gołym okiem
Wady:
• Trudniejsze i bardziej czasochłonne projektowanie starterów do reakcji w porównaniu do
PCR
• Nie wszystkie badania DNA są specyficzne do sekwencji
Biorąc pod uwagę powyższe zalety i wady, można stwierdzić, że metoda LAMP jest odpowiednia
tam gdzie mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami, gdzie wyniki potrzebne są w krótkim czasie
oraz prowadzone badania są specyficzne co do sekwencji. Natomiast nie nadaje się do analizy
nieznanych sekwencji DNA i RNA.
Podsumowanie
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
20
•
LAMP jest nową innowacyjną i rozwijającą się techniką amplifikacji kwasów nukleinowych,
LAMP doskonale nadaje się w sytuacjach gdy mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami
sprzętowymi, a prowadzone analizy wymagają bardzo szybkich wyników,
LAMP umożliwia specyficzną amplifikację matrycy (startery rozpoznają 6-8 różnych sekwencji
matrycy)
Projektowanie starterów dla reakcji LAMP jest bardziej złożone niż w przypadku PCR, ale
udogodnienie stanowią specjalne oprogramowanie do projektowania,
Nie wymaga denaturacji matrycy, całość reakcji przebiega w stałych warunkach
temperaturowych.
Wydajność amplifikacji jest bardzo wysoka porównywalna do Real-time PCR,
LAMP pozwala na znaczące skrócenie czasu analizy (do 1h),
LAMP jest mniej wrażliwy na obecność inhibitorów, nie zawsze wymagana jest izolacja DNA
Pozwala na amplifikację RNA bez dodawania odwrotnej transkryptazy,
Produkt uboczny powstający w reakcji LAMP, pirofosforan magnezu, pozwala na obserwację
wyniku w świetle UV i widzialnym.
Możliwy pomiar ilościowy produktu w czasie rzeczywistym.
Umożliwia prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym, co pozwala uniknąć zanieczyszczeń
w próbie.
Zastosowanie zintegrowanej platformy Genie II® umożliwia prowadzenie reakcji w czasie
rzeczywistym i ilościowe oznaczenie produktu.
Strona
•
•
Bibliografia
Kaneko H, Kawana T, Fukushima E, Suzutani T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification
to a culture medium and biological substances.J BiochemBiophys Methods. 2007 Apr 10;70(3):499501. Epub 2006 Aug 30.
Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T.Detection of loop-mediated isothermal amplification
reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.BiochemBiophys Res
Commun. 2001 Nov 23;289(1):150-4.
Mori Y, Kitao M, Tomita N, Notomi T.Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying
template DNA.J BiochemBiophys Methods. 2004 May 31;59(2):145-57.
Nagamine K, Hase T, NotomiT.Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using
loop primers.Mol Cell Probes. 2002 Jun;16(3):223-9.
Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, YonekawaT, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated
isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.
Parida M, Sannarangaiah S, Dash PK, Rao PV, Morita K.Loop mediated isothermal amplification
(LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical
diagnosis of infectious diseases.Rev Med Virol. 2008 Nov-Dec;18(6):407-21.
Strony www:
http://www.optigene.co.uk/index.htm
http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/index.html
http://www.novazym.com
Strona
21
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11,
email: [email protected], www.novazym.com