Zakażenia w piwie

Koszmar piwowara, czyli
zakażenia w piwie
Plan wykładu
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Parę słów wstępu
Objawy zakażenia
Charakterystyka zakażających drobnoustrojów:
-dzikie drożdże
-bakterie Gram ujemne
-bakterie Gram dodatnie
-killer yeast
-inne możliwe zakażenia
Biofilm
Metody rozpoznawania zakażenia, izolacji i identyfikacji
Jak i kiedy dochodzi do zakażenia
Wpływ charakterystyki piwa na możliwość zakażenia
Minimalizowanie ryzyka
Celowe zakażenie piwa – „sour is new hoppy”
O co chodzi z zakażeniami w piwie?
• Za PWN: zakażenie, infekcja, med. wtargnięcie
do ustroju i rozwój w nim zakaźnego czynnika
chorobotwórczego
• Zakażenia zmieniają właściwości sensoryczne
piwa, zazwyczaj w niepożądany sposób
• W ekstremalnych przypadkach mogą być
niebezpieczne dla zdrowia konsumenta
Piwo nie jest przyjaznym środowiskiem
•
•
•
•
•
Niskie pH (około 4,5)
Niska zawartość tlenu (warunki beztlenowe)
Zawartość alkoholu
Chmiel
Mała zawartość składników odżywczych
• Co innego brzeczka…
Zakażenia piw domowych
• Zjawisko znacznie bardziej powszechne, niż się
sądzi!
• „Stopnie” zakażenia:
1. Piwo do wylania, obrzydliwe, niepijalne
2. Piwo pijalne, ale coś w nim nie do końca
pasuje
3. Piwo w porządku, osoba po dogłębym
szkoleniu sensorycznym wykrywa wadę
wynikającą z zakażenia
4. Piwo smakuje lepiej niż nie zakażone
Zachowanie drobnoustrojów w piwie
E. Żyrek(2008) Zagrożenia mikrobiologiczne przy „aseptycznym” rozlewie piwa
Objawy zakażeń
•
•
•
•
•
•
•
Zmętnienie
Smak i zapach octu
Zgniłe jaja
Kwaśność
Wysoki poziom diacetylu
Gushing
Końska derka/skóra/wełna
Dzikie drożdże
Bakteria
Brettanomyces
B. anomalus
B. bruxellensis
B. claussenii
B. custersianus
B. lambicus
B. naardenensis
B. nanuss
Opis
Efekty zakażenia
Preferowane warunki wzrostu
podobne jak u drożdży
piwnych, potrafią
fermentować dekstryny
http://withfriendship.com/images/e/21277/
Gushing, aromaty ananasa,
jabłka, gruszki, końskiej derki
stajni, dymu, apteczne,
fekalne. Tworzą błonę na
powierzchni
http://investigadores.uncoma.edu.ar/
http://www.homebrewtalk.com
http://www.homebrewtalk.com
http://www.homebrewtalk.com
Dzikie drożdże
Bakteria
Opis
Efekty zakażenia
Saccharomyces
S. cerevisiae var. diastaticus i
inne
S. bayanus
S. pastorianus
Preferowane warunki wzrostu
podobne jak u drożdży
piwnych, potrafią
fermentować dekstryny
Przegazowanie piwa, aromaty
apteczne, goździkowe.
Candida, Torulaspora, Pichia,
Kluyveromyces
Tlenowce, nie potrafią
przeprowadzać fermentacji
Zmętnienie, produkcja błony
na powierzchni, kwas octowy
Rhodotorula, Cryptococcus
Często wykrywane, ale w
normalnych warunkach nie są
w stanie zepsuć piwa
Zmętnienie
Bakterie
Obligatoryjne/fakultatywne
tlenowce/beztlenowce
http://www.e-biotechnologia.pl/
Bakterie Gram ujemne
Bakteria
Opis
Bakterie octowe: Acetobacter
A. aceti
A. liquefacies
A. pastorianus
A. hansenii
Gluconobacter oxydans
Obligatoryjne tlenowce
Komórki w postaci pałeczek,
występujących w parach bądź
łańcuchach. Optymalne
warunki wzrostu: 25-30°C, pH
5,4-6,3, wysoka tolerancja na
alkohol (G. oxydans nawet do
13%)
www.jimsbeerkit.co.uk
Efekty zakażenia
Zmętnienie i śliskie błony na
powierzchni piwa. Utlenianie
etanolu, produkcja kwasu
octowego i octanów – smak i
zapach octu.
www.homebrewtalk.com
Bakterie Gram ujemne
Bakteria
Opis
Efekty zakażenia
Zymomonas mobilis
Krótkie pałeczki występujące
pojedynczo, w parach lub
łańcuchach. Fakultatywne
beztlenowce, fermentujące
glukozę i fruktozę (ale nie
maltozę). Optymalna
temperatura wzrostu: 25-30°C,
tolerancja alkoholu do 13%
Produkcja siarkowodoru i
aldehydu octowego, powodują
tzw. smak „zgniłego jabłka”.
Wytwarzają także etanol, kwas
octowy, kwas mlekowy,
acetoinę (masło)
Obesumbacterium proteus,
dawniej Hafnia protea
Krótkie pałeczki. Rośnie razem
z drożdżami, często obecny w
gęstwie. Infekuje wyłącznie
brzeczkę, wrażliwe na alkohol,
odporne na chmiel.
Powoduje niskie
odfermentowanie i wysokie
pH w piwie. Produkuje DMS,
diacetyl i alkohole wyższe.
Produkuje także N-nitrosaminy
(czynnik kancerogenny)
Bakterie Gram ujemne
Bakteria
Opis
Efekty zakażenia
Citrobacter freundii
Cienkie pałeczki występujące
pojedynczo lub w parach,
fakultatywnie beztlenowe,
fermentują glukozę. Wrażliwe
na alkohol, odporne na
chmiel.
Przyspieszona fermentacja w
początkowych stadiach,
produkcja kwasów
organicznych i DMS.
Enterobacter (Rahnella)
R. aquatilis
E. agglomerans
Krótkie pałeczki, fermentują
glukozę z produkcją kwasów i
gazów. Niska tolerancja na
alkohol, odporne na chmiel.
Podobne do
Obesumbacterium , zakaża
gęstwy drożdżowe. Produkuje
wysokie ilości diacetylu.
Klebsiella terrigena
Klebisella oxytoca
Cienkie pałeczki występujące
pojedynczo, lub w krótkich
łańcuchach. Fakultatywne
beztlenowce, fermentują
glukozę. Wrażliwe na alkohol,
odporne na chmiel.
Przetwarzają kwas ferulikowy
na 4-winylo gwajakol
Bakterie Gram ujemne
Bakteria
Opis
Efekty zakażenia
Pectinatus cerevisiiphilus
Bardzo cienkie zakręcone
pałeczki występujące
pojedynczo lub w parach.
Obligatoryjne beztlenowce,
odporne na chmiel.
Produkuje siarkowodór i inne
związki siarki.
Megasphaera cerevisiae
Ziarniaki występujące
Zapach i smak zgnilizny,
pojedynczo lub w krótkich
produkcja związków siarki,
łańcuchach, obligatoryjne
kwasu masłowego.
beztlenowce. Wrażliwe na
alkohol (powyżej 4%), odporne
na chmiel.
Bakterie Gram dodatnie
Bakteria
Opis
Efekty zakażenia
Lactobacillus
L. brevis
L. casei
L. plantarum
L. fermentum
L. buchneri
L. delbrückii
Cienkie pałeczki. Fakultatywne Zmętnienie w piwie, niektóre
beztlenowe. Niektóre odporne gatunki produkują
na związki chmielu.
polisacharydy, co daje efekt
lepkiej zawiesiny. Produkują
kwas mlekowy, a także kwas
octowy, etanol i dwutlenek
węgla, potrafią zakwasić
brzeczkę
Pediococcus
P. damnosus
P. inopinatus
Ziarniaki występujące
pojedynczo, w parach,
tetradach i jako krótkie
łańcuchy. Faktulatywne
beztlenowce, wiele szczepów
odpornych na związku chmielu
i alkohol.
Infekują fermentującą
brzeczkę i piwo, produkują
lepką zawiesinę powodują
zmętnienia, kwasowość i
wysokie stężenia diacetylu,
powstrzymują wzrost drożdży.
Lactobacillus
Lactobacillus
Bakterie Gram dodatnie
Bakteria
Opis
Efekty zakażenia
Bacillus
B. coagulans
Duże pałeczki.
Tlenowce/fakultatywne
beztlenowce. Termofilne,
endospory umożliwiają im
przetrwanie gotowania,
wrażliwe na związki chmielu i
nie rosną w środowisku o pH
niższym niż 5.
Potrafią rosnąć w brzeczce w
temperaturach zacierania (5570°C), produkując kwas
mlekowy.
Micrococcus
M. kristinae
Zazwyczaj obligatoryjne
tlenowce, lub fakultatywne
beztlenowce. Wrażliwe na
związki chmielu i niskie pH.
Często spotykane w
browarach, ale nie powodują
zakażeń piwa.
Killer yeast
• Drożdże Saccharomyces
cerevisiae mogą wytwarzać
toksyny zabijające komórki
tego samego gatunku
należące do innego szczepu.
• Istnieją drożdże K (killer), S
(sensitive) i N (neutral).
• Drożdże piwowarskie należą
najczęściej do grupy S
• Do 90% drożdży może zgniąć
podczas fermentacji
H.J.J. van Vuuren (1986) Killer Yeast – cause of stuck fermentations in a wine cellar
H.J.J. van Vuuren (1986) Killer Yeast – cause of stuck fermentations in a wine cellar
Inne możliwe zakażenia
Organizm
Pleśnie
Alternaria, Aspergillus,
Cladosporium, Fusarium,
Rhizopus
Opis
Tlenowce, infekują słody i
produkty zbożone
http://www.ag.ndsu.edu/
Efekty zakażenia
Posmaki melasy, palone,
winne, „starości”; zmiany
barwy, zwiększony poziom
azotu, zmętnienie, gushing
Toksyny mogą być
niebezpieczne dla zdrowia
ludzi i drożdży – jeden z
możliwych powodów
niedofermentowania piwa
Primary gushing
• Wywoływane między innymi przez metabolity
grzybów Fusarium, Aspergillus i Penicillum
• Infekcja jęczmienia na polu, lub słodu podczas
przechowywania
• Pięć zainfekowanych ziaren na 100g słodu
wystarcza do wywołania tego zjawiska
średnia
strata
piwa [g]
http://www.crc.dk/flab/fusarium.htm
Próba
kontrolna
Słód z
Fusarium
Słód z
Aspergillus
Słód
zakażony
Fusarium
0
64
22
55
Secondary gushing
• Czyli po prostu przegazowanie
• Powody nie związane z zakażeniem: za niskie
odfermentowanie, za dużo cukru do
refermentacji
• Zakażenie np. dzikimi drożdżami
Brettanomyces
Biofilm
• Trójwymiarowa kolonia bakterii zawartych w
macierzy zewnątrzkomórkowych polimerów
(egzopolisacharydów) wykazujących zdolność
adhezji do wilgotnych powierzchni stałych oraz
do siebie nawzajem
http://textbookofbacteriology.net/biofilm_formation.gif
Biofilm w browarze
• Występują w nim głównie Pseudomonas,
Escherichia, Lactobacillus, Acetobacter i
Saccharomyces
1-2mm wysokości, 6mm
średnicy. Śluzowate, barwy
od kremowej poprzez
czerwoną do czarnej
http://www.microbehunter.com
Bakterie z biolifmu w browarze
L. Shabani, A. Devolli (2010) Microbial spoilage in beer processing by biofilms
Grzyby z biolifmu w browarze
L. Shabani, A. Devolli (2010) Microbial spoilage in beer processing by biofilms
Test wyizolowanych drobnoustrojów
•- brak wzrostu
•+/T+ wzrost i zmętnienie
•A+ wzrost, zmętnienie i zakwaszenie
L. Shabani, A. Devolli (2010) Microbial spoilage in beer processing by biofilms
Metody rozpoznawania zakażenia,
izolacji i identyfikacji
•
•
•
•
•
•
Ocena wizualna (zmętnienie, kożuch)
Ocena zapachowa
Ocena smakowa
Obserwacja pod mikroskopem
Posiew na pożywce agarowej
Posiew na pożywce płynnej
www.homebrewtalk.com
www.homebrewtalk.com
Obserwacje pod mikroskopem
• Potrzebny jest mikroskop
• Powiększenie 40x nadaje się do obserwacji
drożdży
• Do bakterii potrzeba powiększenia 100x i
użycia olejku imersyjnego
• Można określić czystość (szczególnie przydatne
przy gęstwach), wyróżnić bakterie
pałeczkowate i ziarniaki
Selektywne podłoża
• Podłoża o odpowiednim składzie,
umożliwiające wykrycie konkretnych
drobnoustrojów
• HLP - Hsu's Lactobacillus/Pediococcus Medium
• SDA/LMDA - Lee's Multi-Differential
Agar/Schwarz Differential Agar
• LWYM - Lin's Wild Yeast Medium
• Selektywne
pożywki są
drogie – 500g za
prawie 500
złotych, 20
płytek za 80-300
złotych
• Alternatywa –
pożywka z
brzeczki/piwa
E. Żyrek(2008) Zagrożenia mikrobiologiczne przy „aseptycznym” rozlewie piwa
Posiew
• Potrzebujemy: środek do dezynfekcji w spraju,
palnik, płytki z pożywką, próbkę którą chcemy
zbadać, ciepłe miejsce do inkubacji,ezę,
głaszczkę (lub coś w zastępstwie)
http://pl.wikipedia.org
http://www.homebrewing.pl
Podłoża płynne
• Najprościej jest stosować dwa rodzaje pożywki płynnej:
brzeczka i piwo
• Probówki typu Falcon 15/50ml. Tanie (ok. 20pln/50sztuk),
sterylne, przydają się do produkcji skosów itp.
http://www.homebrewersassociation.org
Test na obecność
katalazy
• Posiadając czyste
kultury
bakterii/drożdży
możemy
przeprowadzić test
na obecność
katalazy za pomocą
wody utlenionej.
• Pośród
interesujących nas
drobnoustrojów
Lactobacillus i
Pediococcus dają
wynik ujemny, reszta
dodatni
http://nhscience.lonestar.edu/biol/wellmeyer/media/CatalaseResults2.jpg
http://stopmyclock.com/wp-content/uploads/2011/10/Catalase-Test.gif
• Barwienie bakterii metodą Grama – trudne do
wykonania w warunkach domowych
• Alternatywa – test z użyciem 3% r-r KOH.
91,4% bakterii G+ i 88% bakterii G- można
prawidłowo oznaczyć za pomocą tego testu
http://jjkaos.tistory.com/tag/KOH%20test
Postulaty Kocha
• Postulat 1 – Drobnoustrój musi być obecny we
wszystkich piwach mających daną chorobę i powinien
mieć związek ze zmianami chorobowymi.
• Postulat 2 – Drobnoustrój musi być wyizolowany w
czystej kulturze od chorego piwa.
• Postulat 3 – Drobnoustrój, wyosobniony z chorego
piwa, po wprowadzeniu do piwa lub brzeczki musi
wywołać tę samą chorobę.
• Postulat 4 – Drobnoustrój należy ponownie wyosobnić
w czystej kulturze z eksperymentalnie zakażonego piwa
lub brzeczki w celu spełnienia trzeciego postulatu.
Jak i kiedy dochodzi do zakażenia
• Zakażające drobnoustroje są obecne:
Na słodzie
Na sprzęcie używanym do produkcji piwa,
głównie na plastiku
W gęstwach
Mogą być w wodzie kranowej
W powietrzu
Powietrze w browarze
Bakterie beztlenowe
Jesień
średnia
Zakres
(cfu/m3)
Wiosna
średnia
Zakres
(cfu/m3)
Powietrze
wchodzące
50
10280
50
Rozlewnia
560
103900
Powietrze
wychodzące
210
101100
Drożdże
Jesień
średnia
Zakres
Wiosna
(cfu/m3) średnia
Zakres
(cfu/m3)
10-410 20
10150
30
10230
240
101500
10780
90
101300
90
10-380 40
10310
20
10100
110
Haikira A., Henriksson E. (1992) Detection of airborne microorganisms as a means of hygiene
control in the brewery filling area
Wpływ charakterystyki piwa na
możliwość zakażenia
• Cechy piwa zmniejszające ryzyko:
Wysoka zawartość alkoholu
Wysokie odfermentowanie
Fermentacja w niskich temperaturach (dolna
fermentacja)
Ciemna barwa piwa
Wpływ charakterystyki piwa na
możliwość zakażenia
• Cechy piwa zwiększające ryzyko:
Niska zawartość alkoholu
Niedofermentowanie
Duża zawartość dekstryn
Obecność skrobii, laktozy
Wysoka temperatura fermentacji
Chmiel
• Antybakteryjne
działanie chmiel
zawdzięcza
obecności α- i βkwasów
• Chmiel wpływa na
bakterie G+, nie G!
• Szczepy
Lactobacillus brevis
i Pediococcus
damnosus potrafią
być odporne na
chmiel
http://www.homebrewparty.com/
http://entheology.com
Minimalizowanie ryzyka
• Śrutowanie w innym pomieszczeniu niż to, w
którym pracujemy z brzeczką
Płytki z brzeczką 10Blg,
niechmieloną. Od lewego
górnego rogu zgodnie z ruchem
wskazówek zegara:
Powietrze w łazience
Powietrze w kuchni
Próbka słodu
Powietrze z pokoju, w którym
odbywało się śrutowanie
Minimalizowanie ryzyka
• Praca w pomieszczeniach bez kiszonek,
owoców
• Praca w pomieszczeniach czystych, chłodnych i
suchych
• Nie odkurzać/wietrzyć tuż przed pracą z
brzeczką
• Porządne mycie i dezynfekcja WSZYSTKIEGO!
Celowe zakażenie piwa – „sour is new
hoppy”
• „nowa” moda, głównie pośród amerykańskich
mikrobrowarów
• Celowe zakażanie piwa dzikimi drożdżami i/lub
bakteriami
http://www.ratebeer.com/
http://en.wikipedia.org/
http://www.smaki-piwa.pl/
Jak ukwasić piwo?
• Piwo bazowe – najlepiej o wysokim FG, niskim
aromacie chmielowym (i tak zaniknie) i nie
agresywnie chmielone/palone/przyprawione
• Dobrze mieć osobne fermentory/plastiki do
kwaszonych piw
• Dzikie mikroby można
kupić/upolować/wyciągnąć z kwaśnego piwa
http://cdn.discusscooking.com
Zdobywanie mikrobów
• Wyeast 5112 Brettanomyces bruxellensis,
5335 Lactobacillus, 5526, Brettanomyces
lambicus, 5733 Pediococcus
• White Labs WLP630 Berliner Weisse Blend,
WLP645 Brettanomyces claussenii, WLP650
Brettanomyces bruxellensis, WLP653
Brettanomyces lambicus, WLP655 Belgian
Sour Mix 1, WLP670 American Farmhouse
Blend, WLP675 Malolactic Bacteria, WLP677
Lactobacillus Bacteria
Zdobywanie
mikrobów
• W postaci osadu z
butelek z
zakwaszanym
piwem
• Wyłapywanie z
powietrza, najlepiej
na wiosnę i
jesienią.
http://www.themadfermentationist.com
Mikroby do kwaszenia
• Brettanomyces – wnoszą aromaty (zależnie od
szczepu): ananasa, jabłka, gruszki, końskiej derki
stajni, dymu, apteczne, fekalne
• Pediococcus - główny producent kwasu mlekowego
w zakwaszanych piwach, potrzebują nawet kilka
miesięcy do działania. Używać w połączeniu z
Brettanomyces
• Lactobacillus – stosowane właściwie wyłącznie w
Berliner Weisse
• Acetobacter – niewielkie znaczenie, częściej są
zagrożeniem dla piwa
Berliner Weisse
www.homebrewtalk.com
Brettanomyces - gatunki
• Brettanomyces po grecku oznacza „brytyjskie grzyby”
• Brettanomyces claussenii – najmniej intensywne,
pochodzą z angielskiego piwa z początku XX wieku.
Wnoszą owocowe, ananasowe aromaty
• Brettanomyces bruxellensis – średnio intensywny
gatunek, używany w Belgii
• Brettanomyces lambicus – najbardziej intensywny
charakter, produkuje typowe nuty dla lambików.
Fermentacja
• Najlepsze efekty przy jednoczesnym
zadawaniu drożdży piwowarskich i reszty
mikrobów
• Minimum 6 miesięcy dla uzyskania
pożądanych efektów
http://www.themadfermentationist.com
http://www.themadfermentationist.com
Jeśli już trafi się kwasiżur…
Zamiast wylewać w kanał można
przelać do szklanego balonu,
zostawić na rok-dwa i może wyjdzie
całkiem smaczne sour ale :)
Dziękuję za uwagę!
http://andragy.files.wordpress.com