Charakterystyka enzymów restrykcyjnych Linearyzacja wektora

Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM
Inżynieria Genetyczna 2016/17
Charakterystyka enzymów restrykcyjnych
Linearyzacja wektora
http://www.thermoscientificbio.com/molecular-cloning/puc18-puc19-dna/
1
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM
Inżynieria Genetyczna 2016/17
Linearyzacja wektora – plazmidu pUC19 enzymem SmaI
UWAGA! Enzym restrykcyjny i gotowa mieszanina są wrażliwe termicznie, wszystkie czynności
należy wykonywać na lodzie.
1. W probówkach 0,5ml przygotować mieszaninę reakcyjną wg danych zawartych w tabeli:
Woda
Plazmidowe DNA
Bufor TANGO
Enzym SmaI
RAZEM
Stężenie początkowe
10X
10U/µl
Ilość
…..µl
…...µl
…...µl
…...µl
50µl
Stężenie końcowe
2µg
1X
5U
-
2. Mieszaninę reakcyjną zworteksować, krótko zwirować.
3. Probówki umieścić w bloku grzejnym w temp. 37oC na ok. 2 godz.
4. Inaktywować enzym w 65oC/15 min.
5. Potwierdzić prawidłowy przebieg reakcji wykonując elektroforezę i przeprowadzić oczyszczanie
produktów z żelu przez ekstrakcję DNA metodą fenolowo – chloroformową (wg osobnego
protokołu).
Zagadnienia:
1. Enzymy restrykcyjne
Literatura:
1. Słomski R. Analiza DNA teoria i praktyka. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego
w Poznaniu, Poznań 2008. Rozdział 10, str. 85-93.
2. Turner P.C, McLennan A.G, Bates A.D, White M.R.H. Biologia molekularna. Krótkie wykłady.
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2012, Sekcja G3, str. 132-134.
2