Ocena aktywności enzymatycznej w glebie skażonej - Eko-DOk

aktywność mikrobiologiczna, enzymy glebowe,
fitostabilizacja wspomagana, metale ciężkie
Daniel WASILKOWSKI *, Jacek KRZYŻAK **, Grażyna PŁAZA*,
Agnieszka MROZIK**
OCENA AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ W GLEBIE
SKAŻONEJ METALAMI CIĘŻKIMI I PODDANEJ
REKULTYWACJI TECHNIKĄ FITOSTABILIZACJI
WSPOMAGANEJ, PRZY ZASTOSOWANIU TESTU API®ZYM
Enzymy glebowe stanowią jeden z podstawowych wskaźników jakości gleby. Wynika to nie tylko
z łatwości pomiaru ich aktywności, ale przede wszystkim szybkiego reagowania na zmiany w glebie
i/lub obecność czynnika stresowego, jak zanieczyszczenie metalami ciężkimi. Alternatywną dla fitoekstrakcji techniką mającą coraz częściej zastosowanie w remediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi jest fitostabilizacja wspomagana (ang. aided phytostabilization). Technika ta stanowi połączenie fitoremediacji (wytworzenie zwartej okrywy roślinnej oraz stabilizowanie powierzchni
gleby) ze wstępną chemiczną immobilizacją metali ciężkich, prowadząc do przywrócenia optymalnych właściwości fizykochemicznych i biologicznych skażonej gleby, skutkując zmniejszeniem toksycznego zagrożenia dla środowiska. Na układ badawczy składały się dwa poletka doświadczalne:
kontrolne (GK) i poddawane fitostabilizacji wspomaganej (GF). Pobraną do badań glebę z terenów
działalności byłej huty cynku i ołowiu „Waryński” w Piekarach Śląskich wzbogacono o frakcję pyłową węgla brunatnego (<2mm), wapno nawozowe, nawóz Azofoskę i saletrę amonową. Kontrolę stanowiła gleba, którą wymieszano z nawozem Azofoska oraz saletrą amonową. Po zakończeniu wstępnej chemicznej stabilizacji w obydwu poletkach wysiano nasiona trawy kostrzewy trzcinowej
(Festuca arundinacea Asterix). Aktywność enzymatyczną gleby poddanej fitostabilizacji wspomaganej oraz kontroli oceniano w oparciu o test biochemiczny API®ZYM firmy bioMérieux® S.A. Na
podstawie uzyskanych wyników testów stwierdzono różnice w aktywności badanych enzymów w glebach GF i GK w czasie 28 tygodni prowadzenia badań w warunkach polowych. W glebie GF stwierdzono wyższą aktywność esterazy C4, dwóch aminopeptydaz: arylamidazy leucyny i arylamidazy waliny oraz fosfohydrolazanaftylo-AS-BI. W glebie GF stwierdzono ponadto aktywność esterazy lipazy
(C 8) i arylamidazy cystyny oraz czterech hydrolaz glikozydowych, których nie oznaczono w glebie
GK.
__________
*
Uniwersytet Śląski, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Biochemii, ul. Jagiellońska
28, 40-032 Katowice.
**
Instytut Ekologii Terenów Uprzemysłowionych, Zakład Biotechnologii Środowiskowych, ul. Kossutha 6, 40-844 Katowice.
510
D. WASILKOWSKI i in.
1. WPROWADZENIE
Ekotoksykologiczny stan gleby stał się jednym z najpoważniejszych problemów
środowiskowych zarówno w Europie jak i na świecie. Obecnie szacuje się, że
w Europie około 3 mln miejsc stanowią potencjalne źródła emisji zanieczyszczeń,
wśród których najczęstszymi zanieczyszczeniami są metale ciężkie i olej mineralny
[4, 5]. Metale ciężkie występujące w stężeniach wskazujących na skażenie gleby mają
ogromny wpływ na skład i strukturę zasiedlającej ją mikroflory [14, 12]. Jedną z metod fitoremediacyjnych mających coraz częściej praktyczne zastosowanie w rekultywacji gleb silnie zanieczyszczonych metalami ciężkimi jest fitostabilizacja wspomagana (ang. aided phytostabilization), w której wyróżnić można dwa etapy [9, 6, 5].
Pierwszy etap, wstępna chemiczna stabilizacja, której celem jest ograniczenie mobilności i dostępności metali poprzez wprowadzenie do gleby stabilizatorów. W drugim
etapie wprowadza się rośliny wyższe (głównie z rodziny Poaceae), których głównym
zadaniem jest stabilizowanie powierzchni gleby oraz wytwarzaniem zwartej okrywy
roślinnej [6, 3].
Obecnie dostępna wiedza odnośnie zastosowania fitostabilizacji wspomaganej
w rekultywacji terenów silnie zanieczyszczonych metalami ciężkimi w dużej mierze
skupiona jest na analizie fizykochemicznej, w szczególności na stężeniach biodostępnych form metali/metaloidów i ich akumulacji w tkankach roślinnych. Nieliczne doniesienia natomiast dotyczą oceny efektywności tego procesu w oparciu o parametry
biologiczne gleby, takich jak: biomasa mikroorganizmów, aktywność enzymatyczna,
oddychanie itp. [11, 13, 7].
Ochrona różnorodności biologicznej i monitorowanie jej przemian na wszystkich
poziomach organizacji przyrody, w tym mikroorganizmów, które stanowią istotny
element łańcucha pokarmowego, ma duże znaczenie. Mikroorganizmy pomimo swoich małych rozmiarów (<0,2 mm) są najliczniejszą grupą organizmów glebowych,
odznaczające się dużym stosunkiem powierzchni do objętości. Odgrywają one dużą
rolę w obiegu pierwiastków (szczególnie węgla, azotu, siarki, fosforu), w rozkładzie
materii organicznej oraz w przepływie energii. Ponadto wpływają na parametry fizyczne gleb, biorą udział w budowie i utrzymaniu struktury gleb, zapewniają odpowiednie warunki wodne gleb [2, 8, 10]. Mikroorganizmy są bardzo wrażliwe i szybko
reagują na wszelkiego rodzaju zmiany (naturalne i antropogeniczne) zachodzące w
środowisku. W krótkim czasie przystosowują się do nowych warunków, a ich adaptacja może być monitorowana przez zmiany ilościowe, jak i jakościowe w populacji
i aktywności mikrobiologicznej [1, 15].
Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu wspomaganej fitostabilizacji na stan
fizjologiczny mikroflory autochtonicznej poprzez zastosowanie testu enzymatycznego
API®ZYM firmy bioMérieux® S.A.
Ocena aktywności enzymatycznej w glebie skażonej metalami ciężkimi…
511
2. METODYKA
2.1. UKŁAD BADAWCZY W WARUNKACH POLOWYCH
Glebę do badań pobrano w 2009 roku z silnie zanieczyszczonego metalami ciężkimi terenu byłej huty „Waryński” w Piekarach Śląskich. Obszar ten jest ściśle związany z kilkusetletnią aktywnością górnictwa i hutnictwa cynkowo-ołowiowego. Spośród zanieczyszczających ją metali ciężkich stężenie cynku było największe
i wynosiło 4506 mg/kg s.m gleby. Stężenia pozostałych metali były niższe i wynosiły
dla Cd, Pb i As odpowiednio 85 mg/kg s.m, 1291mg/kg s.m. i 36 mg/kg s.m gleby.
Glebę skażoną metalami ciężkimi pobrano z wierzchniej warstwy (do głębokości
30 cm), w ilości około 3 ton. Wstępne przygotowanie pobranej gleby polegało na
usunięciu fragmentów roślin itp., a następnie przesianiu w ilości 1 tony przez sito
(4 mm). Na układ eksperymentalny składały się dwa poletka doświadczalne: kontrolne (GK) i poddawane fitostabilizacji wspomaganej (GF). Do gleby GF wprowadzono
frakcję pyłową węgla brunatnego (100 g/kg gleby), wapno nawozowe (25 g/kg gleby),
nawóz Azofoskę (0,2 g/kg gleby) i saletrę amonową (0,4 g/kg gleby). Kontrolę stanowiła gleba, do której dodano nawóz Azofoskę (0,2 g/kg gleby) i saletrę amonową
(0,4 g/kg gleby). Odpowiednio przygotowaną glebę kontrolną (GK) i poddaną procesowi fitostabilizacji wspomaganej (GF) o końcowej masie 500 kg umieszczono
w poletkach badawczych o powierzchni 2,00 m2.
Po upływie 6 tygodni w glebach GK i GF wysiano nasiona kostrzewy trzcinowej
(Festuca arundinacea Asterix) w ilości 100 g/m2. Trawa ta posiada gęsty, dobrze
rozwinięty, wiązkowy system korzeniowy i wytwarza zwartą okrywę roślinną. Ponadto dobrze znosi wysokie stężenia metali (Cd, Pb i Zn) w glebie, które
w znacznym stopniu zatrzymuje w korzeniach.
2.2. PRZYGOTOWANIE I WYKONANIE TESTU API®ZYM
Test API®ZYM przeprowadzano w dniu założenia układu badawczego oraz po
3, 6, 9, 12, 20 i 28 tygodniach trwania eksperymentu dla gleby GF i GK. Jest to półilościowa mikrometoda pozwalająca na określenie aktywności 19 zewnątrzkomórkowych enzymów: 3 fosfataz, 3 esteraz, 3 aminopeptydaz, 2 proteaz i 8 hydrolaz glikozydowych w złożonych, nieoczyszczonych próbkach.
Glebę do badań z każdego poletka pobierano z pięciu losowo wybranych miejsc.
2 gramy gleby dokładnie wymieszano z 5 ml 0,85% sterylnego roztworu NaCl
i inkubowano w temperaturze 37˚C przez 24 godz. Przygotowanie testu polegało na
wprowadzeniu na dno komory inkubacyjnej sterylnej wody destylowanej w celu
utrzymania odpowiedniej wilgotności i umieszczeniu w niej paska API®ZYM. Następnie, 65 μl zawiesiny glebowej umieszczano w kolejnych studzienkach na pasku
512
D. WASILKOWSKI i in.
API®ZYM, zabezpieczono przed wyschnięciem i inkubowano w temperaturze 37⁰C
przez 4 godz. Po inkubacji do każdej studzienki dodawano po jednej kropli odczynniki ZYM A ((Tris, 37% kwas solny, laurynowy siarczan sodu, woda) i ZYM B (Fast
blue BB – aktywny składnik, metanol, DMSO) według zaleceń producenta. Po upływie 5 minut, które niezbędne były do wywołania barwnej reakcji, odczytywano wyniki według tabeli dostarczonej przez producenta. Aktywność enzymów oznaczano jakościowo określając intensywność zabarwienia przyjmując skalę od 0 (brak
aktywności) do 4 (największa aktywność).
Tabela 1. Zestawienie odczytów intensywności zabarwienia w poszczególnych studzienkach
paska testu API®ZYM zgodnie z tabelą porównawczą producenta dla gleby GK i GF
ENZYMY
Badana gleba
Kontrola
1
GK
0
GF
0
GK
3
GF
3
GK
6
GF
6
GK
9
GF
9
GK
12
GF
12
GK
20
GF
20
GK
28
GF
28
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
1
2
2
0
1
1
0
0
0
1
2
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
2
0
1
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
1
0
1
1
0
0
0
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
2
0
1
1
0
0
0
2
2
0
1
0
0
0
1
0
0
1
2
1
0
1
1
0
0
0
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
3
3
2
0
2
1
2
2
0
2
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1
0
1
0
0
0
0
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
1
0
1
0
0
0
0
2
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
0
0
1
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
2
3
2
0
0
1
0
0
0
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
1
0
0
1
0
0
0
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
1
0
1
1
1
0
0
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
2
3
0
0
1
1
0
0
0
2
1
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
4
2
2
2
1
2
2
1
1
2
2
1
GF – gleba poddawana fitostabilizacji wspomaganej, GK – gleba kontrolna; 0-28 – tydzień poboru gleby; 4 ≥ 20 nM zhydrolizowanego substratu; 3 ≥ 10 nM zhydrolizowanego substratu; 2 ≥ 5 nM zhydrolizowanego substratu; 1< 5 nM zhydrolizowanego substratu;
0 brak rozkładu substratu.
Enzymy: 2) fosfataza alkaliczna, 3)esteraza (C 4), 4)esteraza lipaza (C 8), 5) lipaza (C 14), 6) arylamidaza leucyny,
7) arylamidaza waliny, 8) aryl amidaza cystyny, 9) trypsyna, 10) α-chymotrypsyna, 11) kwaśna fosfataza, 12) fosfohydrolazanaftylo-AS-BI, 13) α-galaktozydaza, 14) β-galaktozydaza, 15) β-glukuronidaza, 16) α-glukozydaza, 17) βglukozydaza, 18) N-acetylo-β-glukozaminidaza, 19) α-mannozydaza, 20) α-fukozydaza.
Wykonane odczyty potwierdzają aktywność fosfatazy zasadowej, fosfatazy kwaśnej i fosfohydrolazynaftylo-AS-BI w obydwu badanych glebach. Na podstawie intensywności zabarwienia stwierdzono w glebie GF wzrost ich aktywność już po zakończeniu wstępnej chemicznej stabilizacji. W tym czasie w kontroli nieznacznie wzrosła
aktywność jedynie fosfatazy kwaśnej. W ostatnim tygodniu oznaczeń enzymów, aktywności fosfataz były porównywalne w glebach GF i GK. W rekultywowanej glebie
test wykazał również wzrost aktywności dwóch esteraz: C 4 i esteraza lipaza (C 8)
oraz dwóch aminopeptydaz: arylamidazy leucyny i waliny. Esteraza (C 4) odznaczała
się najwyższą aktywnością spośród wszystkich enzymów. W ostatnim tygodniu ana-
Ocena aktywności enzymatycznej w glebie skażonej metalami ciężkimi…
513
liz, aktywność tego enzymu była wyższa w glebie GF porównaniu do gleby GK i wynosiła odpowiednio 20 nM i 15 nM zhydrolizowanego substratu. Na początku doświadczenia, w obydwu glebach aktywne były α-glukozydaza i β-glukozydaza, lecz
w ostatnim tygodniu doświadczenia nie stwierdzono aktywności β-glukozydazy
w glebie GK. Po upływie 7 miesięcy w glebie poddanej fitostabilizacji wspomaganej
stwierdzono aktywność esterazy lipazy (C 8), arylamidazy cystyny, trypsyny, α- i βgalaktozydazy,β-glukozydazy oraz N-acetylo-β-glukozaminidazy. Rysunek 1 przedstawia zmiany aktywności wybranych enzymów w glebie kontrolnej (GK) i poddanej
fitostabilizacji (GF).
fosfataza alkaliczna
esteraza (C 4)
fosfataza kwaśna
fosfohydrolaza naftylo-AS-BI
20
20
Zhydrolizowany substrat, nM
Zhydrolizowany substrat, nM
fosfataza alkaliczna
esteraza (C 4)
fosfataza kwaśna
fosfohydrolaza naftylo-AS-BI
15
10
5
0
0
3
6
9
12
20
28
15
10
5
0
0
Czas, tygodnie
Gleba kontrolna (GK)
3
6
9
12
20
28
Czas, tygodnie
Gleba poddana fitostabilizacji wspomaganej (GF)
Rys. 1. Zmiany aktywności: fosfatazy alkalicznej, esterazy (C 4), fosfatazy kwaśnej i fosfohydrolazynaftylo-AS-BI w glebie GK i GF w czasie 28 tygodni prowadzenia badań w warunkach polowych
3. WNIOSKI
W monitoringu środowiskowym powszechnie oznacza się aktywność wybranych
enzymów pochodzenia mikrobiologicznego. Mikroorganizmy glebowe stanowią
wskaźnik biologiczny bardzo wrażliwy na zmiany właściwości fizyczno-chemicznych
gleby. Uważa się, że w glebie aktywnych jest około 100 różnych enzymów dostarczających podstawowych informacji o stanie fizjologicznym organizmów glebowych.
W większości pracach, aktywność enzymatyczna jest oznaczana metodami klasycznymi. Niewiele jest prac, w których autorzy wykorzystują test API®ZYM do oceny
aktywności enzymatycznej.
Z przeprowadzonych badań sformułowano następujące wnioski:
Gleba pobrana do badań charakteryzowała się słabą aktywnością enzymatyczną
i silnym zanieczyszczeniem, w szczególności Pb, Zn, Cd i As.
514
D. WASILKOWSKI i in.
Zastosowana metoda fitoremediacji wpłynęła na poprawę funkcjonowania mikroflory autochtonicznej objawiający się jakościowym i ilościowym wzrostem aktywności enzymatycznej w rekultywowanej glebie.
Podczas monitorowania procesu stwierdzono wzrost aktywności enzymatycznej,
co świadczy o poprawie stanu fizjologicznego mikroflory autochtonicznej w glebie
poddanej fitostabilizacji wspomaganej.
Przeprowadzone badania wskazały, że test API®ZYM może być wykorzystany jako
narzędzie do monitorowania i oceny biologicznej gleb zanieczyszczonych i poddanych procesom remediacyjnym, jak np. fitostabilizacji wspomaganej.
LITERATURA
[1]
[2]
[3]
BHAVIK, R.BAKSHI., Multiscale PCA with application to multivariate statistical process monitoring, AIChE Journal, 1998, Vol. 44, No.7, 1596-1610.
F.DOYMAZ,J.A.ROMAGNOLI,A.PALAZOGLU, A strategy for detection and isolation of sensor
failures and process upsets, Chemometrics and Intelligents Laboratory Systems, 2001, Vol. 55,
109-123.
J.F.MACGREGOR,T.KOURTI, Statistical process control of multivariate processes, Control
Eng.Practice, 1995,Vol. 3, No.3, 403-414.
CONTROL CHARTS AS A TOOL OF MEASUREMENT ERRORS SEARCH
Modern wastewater treatment plants are equipped with large number of sensors, recording huge
amount of data. Manual fault detection is therefore impossible. On the other hand, lack of control can
cause financial losses and exploitation mistakes. Control charts are basic tools of Statistical Process Control. They are used for process monitoring and fault detections by means of statistics. In this paper control
charts are used to find measurement errors in exemplary data.