Pobierz PDF - Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we

prace oryginalne
Polim. Med. 2013, 43, 3, 153–158
ISSN 0370-0747
© Copyright by Wroclaw Medical University
Aleksandra Pliszczak-Król1, A–D, Maria Szymonowicz2, A–D, Jarosław Król3, C,
Zbigniew Rybak2, E, F, Stanisław Graczyk1, E, F, Dorota Haznar4, B, G, Janusz Pluta4, B, G
Wpływ matryc żelatynowo-alginianowych na zmiany
morfologiczne i czynnościowe leukocytów krwi*
Influence of Gelatin-Alginian Matrixes on Morphological and Functional
Changes of Blood Leukocytes
Katedra Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej, Wydział Medycyny Weterynaryjnej,
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Wrocław, Polska
2
Zakład Chirurgii Eksperymentalnej i Badania Biomateriałów, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu,
Wrocław, Polska
3
Katedra Patologii, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Wrocław, Polska
4
Katedra i Zakład Technologii Postaci Leku, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Wrocław, Polska
1
A – koncepcja i projekt badania; B – gromadzenie i/lub zestawianie danych; C – analiza i interpretacja danych;
D – napisanie artykułu; E – krytyczne zrecenzowanie artykułu; F – zatwierdzenie ostatecznej wersji artykułu;
G – opracowanie składun matryc
Streszczenie
Wprowadzenie. Znajomość relacji biomateriału i tkanek żywych stanowi niezbędną informację, która powinna być wykorzystywana podczas komponowania składu optymalnych nośników, np. dla leków lub preparatów wspomagających krzepnięcie krwi.
Cel pracy. W artykule przedstawiono ocenę wpływu kontaktowania matryc żelatynowo-alginianowych z krwią na reaktywność leukocytów: zdolność komórek jednojądrzastych (limfocytów i monocytów) do tworzenia radialnej segmentacji jąder
– RS (zmiana morfologiczna) oraz zdolność do fagocytozy komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae i produkcji aktywnych
związków tlenu leukocytów (zmiany czynnościowe).
Materiał i metody. Po kontakcie z matrycami wykonano: test indukowanej i spontanicznej RS, test fagocytarny oraz test
redukcji błękitu nitrotetrazoliowego dla leukocytów krwi.
Wyniki. Na podstawie uzyskanych wyników badań stwierdzono, że matryce zmniejszają zdolność komórek jednojądrzastych
do tworzenia RS oraz zdolność granulocytów do redukcji błękitu nitrotetrazoliowego, zwiększają natomiast ich aktywność
fagocytarną.
Wnioski. Czasowy kontakt gąbek żelatynowo-alginianowych z krwią nie wywołał zmian morfologicznych w komórkach
krwi, ale spowodował zmiany ich reaktywności (Polim. Med. 2013, 43, 3, 153–158).
Słowa kluczowe: matryce żelatynowo-alginianowe, radialna segmentacja jądra (RS), fagocytoza, redukcja błękitu nitrotetrazoliowego.
Abstract
Background. Knowledge of the relation of biomaterials and living tissues constitutes necessary information which should be
used when composing a set of optimal carriers, e.g. for drugs or preparations supporting blood clotting.
Objectives. This paper presents an assessment of the influence of contact of gelatin-alginian matrixes with blood on leukocyte
reactivity: the ability of mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) to create a radial segmentation of nuclei – RS (the
* Praca była przedstawiona na XIX Konferencji „Biomaterials in Medicine and Veterinary Medicine”, 15–18 października 2009,
Rytro.
154
A. Pliszczak-Król et al.
morphological change), and the ability of leukocytes to phagocytosis of yeast Saccharomyces cerevisiae cells and to produce
active oxygen derivatives (functional changes).
Material and Methods. After having contact with the matrixes, the test of induced and spontaneous RS, the phagocytic test
and nitroblue tetrazolium reduction test for blood leukocytes were performed.
Results. The obtained results showed a decrease in the ability of mononuclear cells to form RS and in the ability of granulocytes to reduce nitroblue tetrazolium – NBT, but an increase in their phagocytic activity.
Conclusions. Temporary contact of gelatin-alginian matrixes with blood did not cause any morphological changes in the
leukocytes. However, changes of their reactivity were observed (Polim. Med. 2013, 43, 3, 153–158.
Key words: gelatin-alginian matrixes, radial segmentation of nucleus (RS), phagocytosis, reduction of nitroblue tetrazolium.
Dużo uwagi nadal poświęca się intensywnym poszukiwaniom odpowiednich nośników dla substancji leczniczych. Optymalny nośnik powinien spełniać
określone wymagania. Po podaniu lub implantacji ma
uwalniać lek w ściśle określonym miejscu i przez określony czas. Powinien być biologicznie obojętny i nie
wywoływać reakcji organizmu – nie może przyczyniać
się do powstawania efektu cytotoksycznego ani też innych niepożądanych odczynów. Struktura chemiczna
nośnika powinna umożliwiać w odpowiednim czasie,
po skutecznym zadziałaniu leku jego całkowitą resorpcję [1–3].
Wiele właściwości licznych materiałów, z których są
komponowane nośniki jest już dobrze poznanych. Należą do nich: żelatyna, alginiany, kolagen [2, 3], które
z powodzeniem są stosowane jako substancje pomocnicze w produkcji tabletek, kapsułek, opatrunków hemostatycznych. Nadal jednak niewiele wiadomo na temat
bezpośrednich, wzajemnych relacji tych nośników i komórek żywych. Znajomość pojawiających się, w wyniku kontaktu nośnika z tkanką lub krwią, ewentualnych
zmian morfologicznych i czynnościowych w komórkach
stanowiłaby niewątpliwie cenną wskazówkę przy doborze materiałów – komponentów służących do pozyskiwania jak najbardziej optymalnych nośników [4, 5].
Celem pracy była ocena wpływu kontaktowania
matryc (gąbek) żelatynowo-alginianowych z krwią obwodową na morfologię i reaktywność leukocytów krwi
obwodowej z użyciem wybranych testów in vitro.
Materiał i metody
Żelatynowo-alginianowe matryce o strukturze gąbki zostały wytworzone w Zakładzie Farmacji Aptecznej
Katedry Technologii Postaci Leku UM we Wrocławiu.
Gąbki uzyskano przez spienienie mieszaniny jałowych
roztworów żelatyny, alginianu sodu oraz glicerolu
w odpowiednich proporcjach i następnie liofilizację
przez 24 h (tab. 1).
Dla wszystkich rodzajów matryc wykonano oznaczenia: średniej gęstości teoretycznej, zdolności sorpcyjnych oraz odporności na rozmywanie w warunkach
in vitro w 1% roztwór pepsyny w 0,1 M HCL [2].
Do kontaktu z matrycami wykorzystano krew
pięciu zdrowych klinicznie świń, pozyskaną w czasie
okresowych, rutynowych badań kontrolnych stanu
zdrowia zwierząt. Świnie rasy mieszanej (Polish Large
White × Polish Landrace), o wadze ok. 80–90 kg były
własnością prywatnego hodowcy. Krew w ilości 20 ml
pobrano z vena jugularis do strzykawek zawierających
heparynę w ilości 10 j/1 ml krwi.
Każdy typ matrycy (o masie ok. 0,0364 g) kontaktowano z krwią (4 cm3) przez 4 h w temp. 37°C oraz
równolegle w tych samych warunkach inkubowano samą krew (4 cm3) bez matryc, która stanowiła kontrolę
doświadczenia.
Na szkiełkach podstawowych wykonano po 2 rozmazy z każdej próbki. Wysuszone w temperaturze
pokojowej preparaty barwiono metodą panoptyczną
Pappenheima, a następnie analizowano komórki krwi
z użyciem obiektywu immersyjnego (×100) mikroskopu świetlnego. W każdym preparacie oceniano 200 leukocytów.
Test spontanicznej i indukowanej segmentacji jąder leukocytów krwi wykonano według metody Söderströma et al. w modyfikacji własnej [6, 7]. Z każdej
próbki krwi kontaktowanej z matrycami oraz kontrolnej pobrano porcję krwi i podzielono ją na dwie równe
części po 0,8 cm3. Do jednej dodano 0,2 cm³ mieszaniny
szczawianów potasu i amonu (RS indukowana). Druga
Tabela 1. Skład gąbek żelatynowo-alginianowych
Table 1. Composition of the gelatin-alginate sponge
Typ matrycy
(Matrix type)
Żelatyna
(Gelatin)
Alginian sodu
(Sodium alginate)
Glicerol
(Glycerol)
3A
8 cz. 20% roztworu
2 cz. 2% roztworu
0,3 cz.
5A
8 cz. 20% roztworu
2 cz. 2% roztworu
0,5 cz.
3B
8 cz. 20% roztworu
2 cz. 4% roztworu
0,3 cz.
5B
8 cz. 20% roztworu
2 cz. 4% roztworu
0,5 cz.
155
Wpływ matryc żelatynowo-alginianowych na zmiany morfologiczne i czynnościowe leukocytów krwi
Ryc. 1. Krew kontaktowana z matrycą żelatynowo-alginianową. Od lewej: limfocyt niezmieniony, od prawej: limfocyt
z jądrem segmentowanym – RS
Fig. 1. Blood contacted with gelatin-alginian matix. From
the left: normal lymphocyte, from the right: lymphocyte
with segmented nucleus – RS
część, bez szczawianów stanowiła kontrolę (RS spontaniczna). Obie części inkubowano przez 3 h w temp.
21 ± 2°C. Następnie krew odwirowano (1500 g/10 min.),
a z uzyskanego kożuszka białokrwinkowego sporządzono rozmazy, które barwiono metodą panoptyczną Pappenheima. W rozmazach analizowano po 200 komórek
jednojądrzastych (limfocyty i monocyty), różnicując je
na RS-dodatnie (RS+) i RS-ujemne (RS–). Za RS+ przyjęto te komórki, których jądra miały szczeliny o głębokości przynajmniej 1/3 jego średnicy (ryc. 1).
Następnie wykonano test fagocytozy według metody Slapničkowej et al. [8]. Do 1 cm3 krwi z każdej
próbki dodano po 100 µl zawiesiny komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae, następnie inkubowano
ją przez 15 min w temp. 37°C. Po inkubacji z każdej
próbki krwi wykonano po 2 rozmazy, które wysuszono
i barwiono metodą panoptyczną Pappenheima. W rozmazach analizowano po 200 granulocytów, różnicując
je na Fag-dodatnie (Fag+) i na Fag-ujemne (Fag–). Za
Fag+ przyjęto te komórki, w których stwierdzono obecność komórek drożdży (ryc. 2)
Ryc. 2. Krew kontaktowana z matrycą żelatynowo-alginianową. Neutrocyt segmentowany z 4 sfagocytowanymi
komórkami drożdży Saccharomyces cerevisiae
Fig. 2. Blood contacted with gelatin-alginian matix.
Segmented neutrophil with four phagocytized cells of yeast
Saccharomyces cerevisiae
Test redukcji błękitu nitrotetrazoliowego wykonano
według zmodyfikowanej metody Ramana i Polanda [9].
Do 0,2 cm3 krwi z każdej próbki dodano po 0,2 cm3 1%
roztworu błękitu nitrotetrazoliowego (NBT). Równolegle wykonano próby „ślepe”, do których zamiast
roztworu NBT dodano zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS). Tak przygotowaną krew inkubowano
30 min w temperaturze 37°C i 30 min w temperaturze
pokojowej (21°C). Następnie w 0,05 cm3 krwi z każdej
próbki ekstrahowano powstały formazan w obecności
1 ml DMF, a następnie odwirowano i mierzono absorbancję przy długości fali 525 nm na spektrofotometrze
Marcel F 330.
Wyniki
Średnia gęstość teoretyczna ocenianych matryc wynosiła 0,14–0,18 g/cm3 (tab. 2). Matryce z 3% glicerolem
charakteryzowały się mniejszą gęstością i silniejszymi
właściwościami sorpcyjnymi. Największą ilość wody na
1 g swojej masy pochłaniała matryca 3% A, zwiększa-
Tabela 2. Właściwości farmaceutyczne gąbek żelatynowo-alginianowych
Table 2. Pharmaceutical properties of the gelatin-alginate sponges
Typ matrycy
(Matrix type)
Średnia gęstość
(Mean density)
g/cm3
Zdolność sorpcyjna
g wody/g gąbki
(Sorption capacity
g of water/g of matrix)
Rozmywanie
(% ubytku)
(Degeneration
% of loss)
3A
0,142 ± 0,007
4,740 ± 0,444
65,89 ± 20,04
5A
0,181 ± 0,013
3,825 ± 0,397
46,90 ± 6,25
3B
0,151 ± 0,015
4,597 ± 0,200
59,89 ± 14,56
5B
0,165 ± 0,007
4,152 ± 0,229
49,77 ± 8,29
156
A. Pliszczak-Król et al.
50
0,045
RS indukowana
0,04
40
0,035
absorbancja
odsetek komórek RS+
RS spontaniczna
30
20
0,03
0,025
0,02
0,015
10
0,01
0
K
3A
3B
5A
5B
Ryc. 3. Spontaniczna i indukowana radialna segmentacja
jąder (RS) komórek jednojądrzastych krwi kontaktowanej
z matrycami żelatynowo-alginianowymi
Fig. 3. Spontaneous and inducted Radial Segmentation of
nuclei (RS) in mononuclear cells of the blood contacted with
gelatin-alginian matrixes
odsetek granulocytów Fag+
70
60
50
40
30
20
10
0
3B
5A
5B
Ryc. 4. Zdolność granulocytów krwi kontaktowanej z matrycami żelatynowo-alginianowymi do fagocytozy komórek
Saccharomyces cerevisiae
Fig. 4. The ability of neutrophils of the blood contacted with
gelatin-alginian matrixes to phagocytosis of Saccharomyces
cerevisiae cells
jąc swoją masę pięciokrotnie. Najsłabsze właściwości
sorpcyjne wykazywała matryca 5% A (tab. 2). Dobrą
odporność na rozmywanie wykazywały gąbki zawierające większą ilość alginianu sodu (typ B). Rozmycie
najszybciej charakteryzowało gąbkę 3% A, najwolniej
natomiast gąbkę 5% A (tab. 2).
Po kontakcie krwi z gąbkami nie stwierdzono zmian
w obrazie morfologicznym komórek krwi. Leukocyty
oraz pozostałe komórki (erytrocyty i płytki krwi) pozostały niezmienione.
Odsetek komórek wykazujących RS przedstawiono
na ryc. 3. Po inkubacji krwi z matrycami stwierdzono
zmniejszoną zdolność komórek jednojądrzastych krwi
(limfocytów i monocytów) do tworzenia radialnej segmentacji jąder, wyrażającą się zmniejszonym odsetkiem
0,005
0
K
3A
3B
5A
5B
Ryc. 5. Redukcja błękitu nitrotetrazoliowego przez neutrocyty krwi kontaktowanej z matrycami żelatynowo-alginianowymi
Fig. 5. The reduction of Nitroblue Tetrazolium (NBT) by
neutrophils
komórek RS+. Najmniejsze wartości RS notowano po
inkubacji z krwią matrycy 3B.
Odsetek granulocytów fagocytujących komórki Saccharomyces cerevisiae (Fag+) przedstawiono na ryc. 4.
W próbce kontrolnej odsetek neutrofili Fag+ wynosił
48%. Wyraźne nasilenie zdolności pochłaniania komórek drożdży (do 60%) zaobserwowano po kontakcie
krwi tylko z matrycą 5 A. Kontakt z pozostałymi matrycami nie miał natomiast wpływu na badane zjawisko.
Wartości absorbancji (ekstynkcji) dla poszczególnych matryc podano na ryc. 5. W porównaniu do
kontroli zmniejszone wartości absorbancji: o ok. 50%
zaobserwowano dla matryc typu 5 A, a o ok. 63% dla
matryc typu 3 A.
Omówienie
Obserwacja cech farmaceutycznych badanych matryc żelatynowo-alginianowych sugeruje, iż bardziej
optymalne cechy wykazują matryce zawierające w swoim
składzie większą ilość alginianu sodu – matryce typu B. Wykazują one większą odporność na rozmywanie,
a także dobre właściwości sorpcyjne, co przemawia za
ich lepszą trwałością i zachęca do stosowania w warunkach in vivo.
Wszystkie typy matryc ulegały rozpuszczeniu we
krwi w czasie do 15 min, tworzyły postać płynną. Nie
miało to jednak wpływu na ewentualne pojawienie się
zmian morfologicznych w komórkach krwi. Zmiany
morfologii mogą być jednak wywołane m.in. reorganizacją cytoszkieletu komórkowego. Cytoszkielet komórkowy, trójwymiarowa sieć włókien, nadaje nie tylko
kształt komórce, ale uczestniczy także w wielu jej procesach życiowych, np.: transdukcji sygnałów z błony komórkowej do jądra i indukcji odpowiedzi na otrzymane bodźce, transporcie i kompartymentacji enzymów.
Wpływ matryc żelatynowo-alginianowych na zmiany morfologiczne i czynnościowe leukocytów krwi
Zapewnia odpowiednie rozmieszczenie organelli w komórce [10–12]. O zmianach jego organizacji świadczy
pośrednio pojawienie się w jądrze komórek jednojądrzastych krwi (w monocytch i limfocytach) głębokich
szczelin, zbiegających się koncentrycznie w centrum
– zjawisko radialnej segmentacji (RS) [6, 7, 13, 14]. Pojawiają się one w wyniku zwiększonej depolimeryzacji
mikrotubuli cytoszkieletu [7]. Za bardziej miarodajny
wskaźnik zdolności komórek do tworzenia jąder segmentowanych przyjmuje się RS indukowaną (z użyciem
związków wiążących jony Ca+2). Wydaje się bowiem, że
RS dotyczy tych komórek, które w związku ze zmianą
własnej aktywności gromadzą większe niż zwykle ilości
Ca+2 i na jego utratę są bardziej wrażliwe [7]. Zmiany
organizacji cytoszkieletu, powodowane naruszeniem
równowagi między polimeryzacją a depolimeryzacją jego włókien, mogą mieć wpływ na zdolność limfocytów
do odbierania bodźców płynących z zewnątrz (rozpoznawania obcych antygenów) i generowania odpowiedzi na nie, przez co mogą modyfikować reaktywność
całego układu immunologicznego [12]. Osłabienie
zdolności komórek jednojądrzastych do tworzenia RS
(po kontakcie z matrycami żelatynowo-alginianowymi)
może być związane ze stabilizacją mikrotubul warunkowaną spowolnieniem lub czasowym zatrzymaniem
ich depolimeryzacji. W związku z powyższym wydaje
się, że kontakt z matrycami ma „ochronny wpływ” na
komórki jednojądrzaste krwi.
Wynikające ze zmian morfologicznych zmiany
czynnościowe często wiążą się z kolei ze zmienionym
metabolizmem komórek. Nasilenie procesów tlenowych prowadzi np. do zwiększonego wytwarzania aktywnych związków tlenu (ROS) [15]. Ze względu na ich
dużą toksyczność komórki krwi (głównie granulocyty)
wykorzystują je w tlenozależnym układzie niszczenia
w przebiegu fagocytozy [15, 16]. Przez fagocytozę są
usuwane z organizmu czynniki potencjalnie chorobotwórcze pochodzenia zewnętrznego oraz endogenne
substancje toksyczne i uszkodzone lub martwe komórki własne [7, 8, 16, 17]. Aktywne związki tlenu nasilają
157
jednak procesy starzenia komórek i mogą się przyczyniać do ich uszkodzenia (stres oksydacyjny) [15, 16].
Jedną z metod monitorowania procesów tlenowych
(oksydoredukcyjnych) w komórkach jest test redukcji
błękitu nitrotetrazoliowego (NBT) do formazanu. Wiadomo, że zwiększona zdolność redukcji NBT przez komórki (np. granulocyty) bezpośrednio koreluje z większą aktywnością przemian tlenowych związanych m.in.
z nasileniem procesu fagocytozy [9, 16, 17]. Po kontakcie z matrycami stwierdzono nieznacznie zwiększony
odsetek granulocytów badanej krwi fagocytujących komórki Saccharomyces cerevisiae. Z jednej strony obniżenie zdolności tych komórek do redukcji NBT, a więc
osłabienie procesów tworzenia aktywnych, toksycznych
związków tlenu może jednak sugerować mniejszą jej
wydajność, z drugiej natomiast prawdopodobne ograniczenie przez kontakt z matrycami możliwości indukcji
stresu oksydacyjnego wydaje się korzystne, jeśli przyjmie się, że wspomniany stres w komórkach krwi leży
u podstaw inicjacji procesu zapalnego [15, 16]. Proces
zapalny z kolei nie byłby pożądaną reakcją przy zastosowaniu którejkolwiek z matryc.
Na podstawie zebranych wyników zaobserwowano,
że kontakt krwi z matrycami żelatynowo-alginianowymi nie wywołał zmian morfologicznych w leukocytach. Ograniczył także możliwość ich powstawania na
skutek zastosowania indukcji chemicznej. Sugeruje to
„ochronne” oddziaływanie matryc. Argumentem przemawiającym za takim oddziaływaniem może być także
notowane osłabienie przemian tlenowych w badanych
komórkach. Kontakt powodował jednak nieznaczne
zwiększenie aktywności czynnościowej granulocytów
będącej rezultatem kontaktu z ciałem obcym, jakim były matryce.
Interpretacja uzyskanych wyników jest wyjątkowo
trudna, bowiem w literaturze nie napotkano danych,
które mogłyby stanowić punkt odniesienia do dyskusji. Wobec powyższego przedstawione badania należy
potraktować jako badania wstępne, które powinny być
kontynuowane.
Piśmiennictwo
  [1] Pluta J., Haznar D.: The effect of composition upon the physical and chemical properties of biodegradable gelatin polimer
matrixes. Polim. Med. 2002, 32, 3–4, 11–19.
  [2] Pluta J., Haznar D.: Resorbable polymeric sponges as drug carriers. Part 1. Gelatin sponges. Polim. Med. 2001, 31, 1–2, 18–26.
  [3] Pluta J., Haznar D.: Resorbable polymeric sponges as drug carriers. Part 2. Gelatin sponges. Polim. Med. 2001, 31, 3–4, 16–24.
  [4] Szymonowicz M., Marcinkowska A., Żywicka B., Pielka S., Gamian A., Haznar D., Pluta J.: Cellular response after stimulation of the gelatin-alginate matrixes. Macromol. Symp. 2008, 272, 1, 58–62.
  [5] Szymonowicz M., Pielka S., Owczarek A., Haznar D., Pluta D.: Study on influence of gelatin-alginate matrixes on the coagulation system and morphotic blood elements. Macromol. Symp. 2007, 253, 71–76.
  [6] Pliszczak-Król A.: Wpływ ACTH na RS jąder i aktywność fosfatazy kwaśnej w aktywowanych antygenem limfocytach krwi
ptaków. Med. Wet. 2001, 57, 9, 676–679.
  [7] Söderström U.B., Norberg B., Brandt L.: The oxalate-induced radial segmentation of the nuclei in peripheral blood lymphocytes of different size. Scan. J. Hematol. 1976, 17, 57–61.
  [8] Slapnickova M., Berger J.: Rat neutophil phagocytosis following feed restriction. Comp. Cli. Path. 2002, 11, 172–177.
  [9] Czernomysy-Furowicz D., Furowicz A.J.: Porównanie testu redukcji błękitu nitrotetrazoliowego przez obojętnochłonne
granulocyty owcze w metodach cytochemicznej i spektrofotometrycznej. Med. Wet. 1991, 47, 50, 227–228.
158
A. Pliszczak-Król et al.
[10] Evangelisti R., Becchetti E., Baron T., Rossi L., Arena N., Valeno V., Carinci P., Locci P.: Modulation of phenotypic expression of fibroblasts by alteration of the cytoskeleton. Cell Biochem. Funct. 1995, 13, 41–52.
[11] Min Ding, Robinson J.M., Behrens B.C., Vandre D.D.: The microtubule cytoskeleton in human phagocytic leucocytes is
a highly dynamic structure. Eur. J. Cell Biol. 1995, 66, 234–245.
[12] Vicente-Manzanares M., Sánchez-Madrid F.: Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat. Rev. Immunol.
2004, 4, 110–122.
[13] Graczyk S., Pliszczak-Król A.: Wstępne badania radialnej segmentacji (RS) jąder limfocytów krwi kur. Zeszyty Naukowe
Akademii Rolniczej we Wrocławiu 1996, 282, 15–24.
[14] Pliszczak-Król A., Graczyk S., Król J., Janczyk B.: Ocena reaktywności leukocytów krwi obwodowej u szczurów anemizowanych. Med. Wet. 2006, 62, 12, 1435–1438.
[15] Jaźwińska-Kuliś J.: Rola reaktywnych form tlenu. Laboratorium 2007, 4, 47–51.
[16] Zilinskas J., Zekonis J., Zekonis G., Valantiejiene A., Periokaite R.: The reduction of nitroblu tetrazolium by total blood
in periodontitis patents and the aged. Stomatologija 2007, 9, 105–108.
[17] Foster N., Hulme S., Lovell M., Reed K., Barrow P.: Stimulation of gp91 phagocytic oxidase and reactive oxygen species
in neutrophils by an avirulent Salmonella enteritica serovar infantis strain protects gnotobiotic piglets from lethal challenge
with serovar Typhimurium strain F98 without inducing intestinal pathology. Infect. Immun. 2005, 37, 4539–4547.
Adres do korespodencji:
Aleksandra Pliszczak-Król
Katedra Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
ul. C.K. Norwida 31
50-375 Wrocław
e-mail: [email protected]
Konflikt interesów: nie występuje.
Praca wpłynęła do Redakcji: 1.06.2013 r.
Po recenzji: 5.09.2013 r.
Zaakceptowano do druku: 5.09.2013 r.
Received: 1.06.2013
Revised: 5.09.2013
Accepted: 5.09.2013