izolacja plazmidowego dna z komórek bakterii

KATEDRA BIOCHEMII
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
IZOLACJA PLAZMIDOWEGO
DNA Z KOMÓREK BAKTERII
GENETYKA
MOLEKULARNA
IZOLACJA PLAZMIDOWEGO DNA Z KOMÓREK BAKTERII
ZADANIE 1.
IZOLACJA PLAZMIDOWEGO DNA METODĄ LIZY ALKALICZNEJ
W metodzie tej, liza bakterii i denaturacja chromosomalnego DNA następuje na skutek
działania alkaliów (0,2 M NaOH) i jonowego detergentu (1% SDS). W warunkach
denaturacji, liniowe cząsteczki dwuniciowego DNA (chromosom bakteryjny, a także formy
plazmidowe OC, ang. open circular) ulegają rozwinięciu do formy jednoniciowej, natomiast
superzwinięte cząsteczki DNA plazmidowego (CCC) pozostają dalej splecione i nie ulegają
destrukcji. Obecny w mieszaninie lizującej detergent jonowy - siarczan dodecylu (1%)
opłaszcza białka. Konsekwencją neutralizowania lizatów komórkowych octanem potasu jest
wytrącanie zdenaturowanego chromosomalnego DNA (przypadkowa agregacja
jednoniciowych fragmentów prowadzi do tworzenia nierozpuszczalnych kompleksów) oraz
opłaszczonych siarczanem dodecylu białek (SDS wytrąca się w szczególnie efektywnie w
roztworach zawierających jony potasu).
Metoda lizy alkalicznej służy do szybkiej izolacji plazmidowego DNA. Otrzymane DNA
nadaje się do analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania.
WYKONANIE:
Izolację plazmidowego DNA należy wykonać z komórek plazmidowych szczepów bakterii
Zwirować 1,5 ml 24-godzinnej hodowli bakterii w probówkach Eppendorfa przy 13 000
obrotów na minutę przez 3 minuty.
1. Otrzymany osad zawiesić w 200 ul buforu L1 (dokładnie rozpipetować lub
zworteksować).
2. Dodać 200 ul buforu L2 (przygotowanego na świeżo) i delikatnie wymieszać przez
kilkakrotne odwracanie probówki (nie pipetować ani worteksować). Próby inkubować
przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Dodać 200 ul buforu L3 i wymieszać przez kilkakrotne odwracanie probówek.
4. Próby wirować przez 5 minut przy 13 000 obrotów na minutę.
5. Po wirowaniu z każdej probówki ostrożnie przenieść supernatant do nowych probówek
Eppendorfa.
6. Dodać 500 ul PHENOLGELU i wymieszać przez kilkakrotne odwracanie probówki, aż na
dnie nie będzie przyklejonego osadu.
7. Próby odwirować przez 3 minuty przy 13 000 obrotów na minutę.
8. Zebrać ostrożnie górną warstwę (oddzieloną od dolnej separatorem faz) do nowej
probówki Eppendorfa i dodać równą objętość mieszaniny chloroform-alkohol
izoamylowy w stosunku 24:1.
9. Próby odwirować przez 2 minuty przy 13 000 obrotów na minutę.
1
KATEDRA BIOCHEMII
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
IZOLACJA PLAZMIDOWEGO
DNA Z KOMÓREK BAKTERII
GENETYKA
MOLEKULARNA
10. Zebrać górną warstwę i dodać 500 ul izopropanolu i 5 ul 5 M octanu potasu.
11. Próby inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przez 15
minut przy 13 000 obrotów na minutę.
12. Zlać supernatant, a osad przemyć 500 ul 70% etanolu (użyć worteksu) i wirować
ponownie przez 3 minuty przy 13 000 obrotów na minutę.
13. Zlać supernatant, a osad osuszyć przez odwrócenie probówki (10 minut w temperaturze
pokojowej). Jeżeli na ściankach probówki widać pozostałości alkoholu, należy je
ostrożnie usunąć skrawkiem bibuły.
14. Osad zawiesić w 20 ul buforu TE.
ZADANIE 2.
PRZYGOTOWANIE BUFORU L2
WYKONANIE:
Zmieszać bezpośrednio przed użyciem:
 4,4 ml sterylnej wody destylowanej
 0,1 ml 10 N NaOH
 0,5 ml 10% SDS-u
ZADANIE 3.
ELEKTROFOREZA PLAZMIDOWEGO DNA W ŻELU AGAROZOWYM
Elektroforeza agarozowa DNA. Technika ta pozwala na rozdział kwasów nukleinowych w
żelu agarozowym. DNA jako anion wędruje w polu elektrycznym w kierunku elektrody
dodatniej. Szybkość wędrówki DNA w żelu agarozowym w odpowiednim buforze zależy od:
a) przyłożonego napięcia (zwykle stosuje się napięcie nie większe niż 5 V/cm długości żelu)
b) stężenia żelu (im gęstszy żel tym wolniejsza migracja, ale należy pamiętać, że większe
cząsteczki lepiej jest rozdzielać w rzadszym żelu, mniejsze- w gęstszym; standardowo stosuje
się żele 1%)
c) kształtu cząsteczki (np. formy CCC wędrują szybciej, liniowe - wolniej)
d) wielkości cząsteczki (cząsteczki większe migrują wolniej, mniejsze-szybciej)
Szybkość migracji DNA w żelu agarozowym nie zależy od sekwencji nukleotydowej
WYKONANIE:
1. Przygotować 1% żel agarozowy w następujący sposób: odważyć 0,4 g agarozy i rozpuścić
w 39,6 ml buforu TAE (rozcieńczonego w stosunku 1:49) przez podgrzanie roztworu na
maszynce elektrycznej.
2
KATEDRA BIOCHEMII
Wydział Biologii i Ochrony
Środowiska
IZOLACJA PLAZMIDOWEGO
DNA Z KOMÓREK BAKTERII
GENETYKA
MOLEKULARNA
2. Ochłodzić roztwór agarozy do temperatury pokojowej, dodać 1 ul bromku etydyny o
stężeniu 0,4 ug/ml i wylać na płytkę elektroforetyczną. Pozostawić do spolimeryzowania
(około 30 minut).
3. Płytkę eletroforetyczną z żelem umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać buforem
TAE (rozcieńczonym wodą destylowaną w stosunku objętościowym 1:49).
4. Przygotować próby do rozdziału elektroforetycznego w następujący sposób: zmieszać 15
ul plazmidowego DNA rozpuszczonego w buforze TE z 2 ul barwnika obciążającego
(0,25% błękit bromofenolowy rozpuszczony w 40% sacharozie).
5. Wprowadzić otrzymane próby do kieszonek w żelu agarozowym przy pomocy pipety
automatycznej.
6. Podłączyć komorę do elektroforezy do stabilizatora prądowego, tak aby początkowe
natężenie wynosiło 41 mA. Gdy marker migracji dojdzie do około ¼ długości żelu, należy
zwiększyć natężenie do 46 mA.
7. Prowadzić rozwijanie elektroforogramu do momentu, gdy marker przesunie się na
odległość około 1 cm od dolnej krawędzi żelu.
8. Ostrożnie wyjąć żel agarozowy
9. Otrzymany elektroforogram oglądać w transluminatorze w promieniach lampy UV.
Zapisać obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski
ODCZYNNIKI MATERIAŁY
1. Hodowle bulionowe plazmidowych szczepów bakterii
2. Bufor L1 (50 mM glukoza, 25 mM TRIS-HCl, 10 mM EDTA)
3. Bufor L2 (0.2 N NaOH, 1% SDS)
4. Bufor L3 (3 M octan potasu, pH 4.8)
5. Mieszanina chloroform –alkohol izoamylowy 24:1
6. 96% etanol
7. 70% etanol
LITERATURA
KUR J., - „Podstawy inżynierii genetycznej” – Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej,
Gdańsk, 1994
3