pobierz

Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 3, str. 291–302
PRACA POGLĄDOWA – Review Article
JUSTYNA JÓŁKOWSKA
Choroba resztkowa i chimeryzm hematopoetyczny
u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną po transplantacji komórek krwiotwórczych
Minimal residual disease and hematopoietic chimerism in children
with acute lymphoblastic leukemia after hematopoietic stem cell
transplantation
Instytut Genetyki Człowieka PAN, Zakład Genetyki Molekularnej i Klinicznej, Poznań
Kierownik Instytutu: Prof. dr hab. n. med. Jerzy Nowak
STRESZCZENIE
W ostatnich latach nastąpił niezwykły postęp w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL)
oraz w rozwoju wiarygodnych technik molekularnych, które pozwalają z duŜą czułością (10-310-6) na rozróŜnienie pomiędzy komórkami nowotworowymi i zdrowymi, w momencie rozpoznania choroby oraz w trakcie leczenia. Odpowiednie prowadzenie dzieci chorych na ALL powinno polegać przede wszystkim na monitorowaniu efektów stosowanej terapii, poprzez badanie
chimeryzmu hematopoetycznego i minimalnej choroby resztkowej (MRD). Zwłaszcza wyniki
badań MRD, oparte na analizie ilościowej, z wykorzystaniem RQ-PCR i RT-RQ-PCR wydają się
być decydujące dla oceny wyników leczenia dziecięcej ALL. Obecnie, kluczowym zagadnieniem
powinno być opracowanie i wdroŜenie standardów badań choroby resztkowej oraz chimeryzmu
poprzeszczepowego w ramach rutynowej diagnostyki molekularnej, dostępnej we wszystkich
pediatrycznych ośrodkach hematoonkologicznych.
SŁOWA KLUCZOWE: ALL – Chimeryzm – RearanŜacje Ig/TCR, RQ-PCR
SUMMARY
Nowadays a significant progress has been made in the treatment of acute lymphoblastic leukaemia and in the development of reliable molecular techniques, which are characterised by high
sensitivity (10-3–10-6) and ability to distinguish between normal and malignant cells at diagnosis
and during follow-up. The appropriate management of childhood ALL must rely on a precise and
long-term monitoring of the patient’s response to therapy by analysis of hematopoietic chimerism and minimal residual disease (MRD). Especially, MRD data based on quantitative analysis
(RQ-PCR, RT-RQ-PCR) appear to be crucial for appropriate evaluation of treatment response in
ALL. Implementation of standardized approaches for chimerism and MRD assessment into routine molecular diagnostics available in all paediatric oncohaematological centres nowadays
should be regarded as a crucial issue.
KEY WORDS: ALL – Chimerism, Ig/TCR rearrangements, RQ-PCR
292 J. JÓŁKOWSKA
WPROWADZENIE
Ostatnie lata przyniosły znaczący postęp w leczeniu nowotworów dziecięcych,
a zwłaszcza ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL). W związku ze znaczną poprawą
metod leczenia oraz opieki nad chorymi, wyleczalność w przypadku ALL u dzieci
wynosi około 80%. Mimo tak spektakularnej poprawy wyników leczenia wciąŜ u około 20% dzieci dochodzi do niepowodzeń w leczeniu, których główną przyczyną pozostaje nadal wznowa choroby [5]. Gwałtownie rozwijające się techniki biologii molekularnej, zwłaszcza te, oparte na łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. polymerase chain
reaction, PCR), pozwalają z wysoką czułością wykrywać pojedyncze komórki białaczkowe. Przetrwały one mimo intensywnej chemioterapii i są główną przyczyną wznowy. Szeroko pojęta diagnostyka molekularna ALL obejmuje techniki, których przydatność w hematoonkologii rozpatrywać moŜna w dwóch aspektach. Pierwszy z nich to
ocena skuteczności leczenia przez np. monitorowanie poziomu choroby resztkowej
(ang. minimal residual disease, MRD), drugi zaś to badania ilościowe chimeryzmu
komórkowego, w celu oceny przyjęcia przeszczepionych komórek lub ich odrzucenia
po przeszczepieniu macierzystych komórek krwiotwórczych (ang. stem cell transplantation, SCT) [1]. W przypadku ALL, gdzie postęp choroby moŜe być bardzo gwałtowny, szczególnie istotne wydaje się rutynowe uŜycie badań molekularnych dla wczesnego wykrywania wznowy poprzez precyzyjną analizę dynamiki zmian chimeryzmu
oraz monitorowanie MRD. Niewątpliwie istotne jest takŜe porównanie znaczenia prognostycznego monitorowania chimeryzmu z informacją opartą na wynikach MRD,
uzyskanych bezpośrednio przed SCT, jak i w okresie poprzeszczepowym.
Allogeniczna transplantacja komórek krwiotwórczych znajduje zastosowanie w leczeniu chorób rozrostowych (60% wskazań to białaczki), w tym ostrej białaczki limfoblastycznej. Po udanej transplantacji komórki krwiotwórcze przeszczepione biorcy
rozpoczynają proces krwiotworzenia, w wyniku czego u biorcy dochodzi do pojawienia się zjawiska chimeryzmu poprzeszczepowego. W pierwszym etapie po przeszczepieniu często obserwuje się współwystępowanie komórek dawcy i biorcy, stan ten jest
zwany mieszanym chimeryzmem i często występuje przejściowo. Pełny chimeryzm
natomiast opisuje sytuację, gdy rekonstytucja wszystkich linii komórkowych krwi następuje z nowoprzeszczepionych komórek dawcy. Tradycyjna allogeniczna transplantacja komórek krwiotwórczych jest związana z koniecznością stosowania duŜych dawek chemioterapeutyków oraz radioterapii. Jednym z nowszych podejść terapeutycznych jest przeszczepianie allogenicznych krwiotwórczych komórek macierzystych
z zastosowaniem niemieloablacyjnego kondycjonowania (ang. non-myeloablative allogeneic stem cell transplantation, NAST), w którym decydującym czynnikiem jest
reakcja przeszczepionych komórek immunologicznie kompetentnych przeciw białaczce (ang. graft versus leukemia, GvL) [22]. Zwiększanie efektu GvL polega na przetaczaniu limfocytów krwi obwodowej, pobranych wcześniej od dawcy (ang. donor lymphocyte infusions, DLI) [22]. Procedurę tę określa się mianem minitransplantacji, ze
względu na niskie dawki cytostatyków, podawane w trakcie leczenia. Minitransplantacja umoŜliwia zatem współistnienie dwóch układów komórkowych oraz wytworzenie
Choroba resztkowa i chimeryzm u dzieci z ALL
293
się tolerancji immunologicznej dawca-biorca, czego wyrazem jest stabilny mieszany
chimeryzm. Funkcjonowanie obok siebie dwóch układów róŜnicowania się i wytwarzania krwinek jest punktem wyjścia do pełnej odnowy hemopoezy pochodzącej od
dawcy. Oznacza to pewną normalizację w układzie krwiotwórczym, polegającą na
przejęciu funkcji krwiotwórczych przez przeszczepione komórki dawcy, z jednoczesnym eliminowaniem komórek nowotworowych z organizmu biorcy. Skuteczność tej
metody zaleŜy od szybkiego monitorowania kinetyki zmian chimeryzmu mieszanego
oraz minimalnej choroby resztkowej [22]. U tych chorych, u których mamy do czynienia z gwałtownym wzrostem liczby własnych komórek, mamy do czynienia z progresywnym mieszanym chimeryzmem oraz niebezpieczeństwem wystąpienia niekorzystnych zdarzeń.
Oprócz zjawiska chimeryzmu po SCT istotny problem stanowi niewątpliwie obecność minimalnej choroby resztkowej. Termin ten opisuje wspomniane wcześniej przetrwałe komórki białaczkowe, będące efektem nieskutecznego ich wyniszczenia podczas chemio- i radioterapii w trakcie postępowania przygotowującego do przeszczepienia komórek krwiotwórczych, a których poziom stanowi niezaleŜny czynnik prognostyczny podczas leczenia. Techniki badania MRD pozwalają na wykrywanie pojedynczych komórek białaczkowych, niewytrzebionych w trakcie leczenia lub po jego
zakończeniu. MoŜliwe jest, Ŝe z czasem komórki te ponownie odnowią swą populację,
czego rezultatem jest wnowa choroby. Dlatego teŜ głównym celem poprzeszczepowego monitorowania chimeryzmu komórkowego jest moŜliwość przewidywania niekorzystnych zdarzeń jak wznowa choroby lub odrzucenie przeszczepionych komórek;
sytuacje te wymagają natychmiastowej interwencji terapeutycznej. Dodatkowo, badania MRD są pomocne w klasyfikacji pacjentów z ALL do grup ryzyka, monitorowaniu
skuteczności leczenia, jak równieŜ w lepszym doborze strategii terapeutycznych, adekwatnych dla danego przypadku. PoniewaŜ metody morfologiczne umoŜliwiają wykrycie komórek nowotworowych, gdy stanowią one juŜ blisko 5% całej badanej populacji komórek, konieczne stało się poszukiwanie znacznie czulszych metod molekularnych, pozwalających na wykrycie komórek nowotworowych z czułością przynajmniej 10-3. Obecnie, poprzeszczepowe monitorowanie losu przeszczepionych komórek
polega na stosowaniu najbardziej wiarygodnych i czułych technik badania mieszanego
chimeryzmu i choroby resztkowej, które charakteryzują się równieŜ powtarzalnością
wyników oraz niskim ryzykiem uzyskania wyników fałszywie pozytywnych, bądź
fałszywie negatywnych. Taka strategia pozwala nie tylko na wykrywanie wznowy czy
odrzucenia przeszczepionych komórek, ale równieŜ na ustalenie odpowiedzi chorego
na róŜne podejścia terapeutyczne.
Chimeryzm hematopoetyczny
Obecnie najczęściej stosowaną metodą badania chimeryzmu po SCT jest analiza
wysoko polimorficznych sekwencji mikrosatelitarnych techniką PCR, z uŜyciem starterów znakowanych fluorescencyjnie [16]. Podstawą analizy jest znalezienie róŜnic
pomiędzy polimorficznymi markerami genetycznymi dawcy i biorcy. Produkty fluorescencyjnej PCR rozdzielane są w automatycznym sekwenatorze DNA, a analizy wy-
294 J. JÓŁKOWSKA
ników dokonuje się przy uŜyciu odpowiednich programów komputerowych [15, 19].
Ilościowe oszacowanie chimeryzmu mieszanego następuje przez pomiar intensywności
sygnału fluorescencyjnego, emitowanego przez poszczególne allele dawcy i biorcy, a
zdefiniowanego jako powierzchnia wierzchołka sygnału fluorescencyjnego danego
allelu. Wykorzystując obliczoną przy uŜyciu programu komputerowego powierzchnię
wierzchołków dla danych alleli, z pomocą odpowiednich wzorów, przeprowadza się
kalkulację ilości DNA pochodzącego od dawcy w próbie uzyskanej od biorcy szpiku
po transplantacji [16]. Czułość tej metody waha się od 0.4% do 5% [1]. Niektóre
ośrodki hematologiczne preferują komercyjne zestawy oparte na fluorescencyjnej reakcji STR-PCR typu multipleks. Jednak generalnie wyniki te nie róŜnią się od wyników uzyskanych w poszczególnych laboratoriach, w których wykorzystuje się markery
STR wybrane do analizy na miarę moŜliwości danej pracowni [4].
Jedną z najnowszych i najbardziej czułych technik analizy chimeryzmu po SCT
jest metoda oparta na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (ang.
real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR), z wykorzystaniem systemu opartego na technologii TaqMan. System ten charakteryzuje niezwykła czułość
i precyzja w badaniu dynamiki mieszanego chimeryzmu [1]. Punktem kluczowym
analizy jest wybór polimorfizmu markerowego (zwykle typu insercja/delecja), który
moŜe być uŜyty dla danej pary dawca/biorca oraz wyznaczeniem krzywej standardowej
na podstawie badań szeregu rozcieńczeń DNA noszącego analizowaną cechę. Technika
opiera się na tzw. polimorfizmie markerowym z wykorzystaniem starterów i sondy,
komplementarnych do sekwencji DNA obecnej w DNA biorcy, a nie obecnej w DNA
dawcy (lub odwrotnie). Sonda wyznakowana jest fluorochromami: reporterem (ang.
reporter dye) i wygaszaczem (ang. quencher dye). Dzięki egzonukleazowej aktywności Taq polimerazy powodującej degradację sondy, która w trakcie reakcji hybrydyzuje
z sekwencją badanego fragmentu, następuje emisja sygnału fluorescencyjnego, a jego
wielkość jest proporcjonalna do liczby kopii DNA niosącego badaną sekwencję. Liczba cykli, przy której dochodzi do przekroczenia progu detekcji, to tzw. cykl progowy
(ang. threshold cycle, ct) i jest wprost proporcjonalny do ilości sekwencji docelowej
obecnej na początku reakcji [11]. Jako kontrolę przeprowadza się amplifikację wybranego genu konstytutywnego, która pozwala na ocenę efektywnej ilości DNA znajdującej się w próbce. Dodatkowo w kaŜdej serii badań dokonuje się amplifikacji próby
DNA dawcy lub chorego sprzed przeszczepienia komórek krwiotwórczych (tzw. kalibrator). Wyniki uzyskane podczas badania materiału uzyskanego po SCT odnosi się
do uprzednio przygotowanej krzywej standardowej oraz wyników badania kalibratora
i na tej podstawie oblicza się procentowy udział komórek dawcy lub biorcy w danej
próbie. Metoda RQ-PCR pozwala na kalkulację mieszanego chimeryzmu, z czułością
wynoszącą 0.1–1%. [1].
Minimalna choroba resztkowa
Wraz z rozwojem coraz bardziej zaawansowanych technik molekularnych moŜliwe
stało się wykrywanie pojedynczych komórek białaczkowych w otoczeniu zdrowych
komórek, z czułością 10-5-10-6. Podstawą badania jest znalezienie specyficznych mar-
Choroba resztkowa i chimeryzm u dzieci z ALL
295
kerów białaczkowych, które pozwolą na rozróŜnienie między blastami białaczkowymi
i normalnymi komórkami. Kombinacja takich technik została przystosowana do wykrywania mieszanego chimeryzmu, jak równieŜ MRD, głównie w celu wczesnego
wykrywania wznowy ALL. Techniki te polegają na wykrywaniu specyficznych dla
białaczek transkryptów fuzyjnych (np. TEL-AML1 w ALL, BCR-ABL w CML czy
CBFβ/MYH11 w AML) oraz rearanŜacji genów immunoglobulin i receptorów limfocytów T. Nowoczesne, charakteryzujące się wysoką czułością techniki detekcji MRD
to: reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RQ-PCR), ilościowa reakcja odwrotnej transkrypcji w połączeniu z reakcją łańcuchową polimerazy (RT-RQPCR) oraz cytometria przepływowa [5, 8, 17].
Podczas rozpoznania ALL, rearanŜacje genów immunoglobulin i receptorów limfocytów T, z wykorzystaniem techniki opartej na PCR, wykrywane są u około 90%
chorych z prekursorową B-ALL oraz u 95% chorych z T-ALL, z czułością 10-4–10-6
[13, 26]. Metoda oparta na analizie rearanŜacji genów Ig/TCR wykorzystuje reakcję
PCR do wykrywania rejonów złącz po rearanŜacji germinalnych segmentów Ig i TCR
(V, D, J) na wczesnym etapie róŜnicowania limfocytów B i T. KaŜdy dojrzały limfocyt
otrzymuje unikatową kombinację tych segmentów, jednak proces ten jest bardzo
skomplikowany i nieprecyzyjny, poniewaŜ podczas łączenia segmentów dochodzi do
przypadkowej insercji, bądź delecji pojedynczych lub kilku nukleotydów. W związku z
tym, Ŝe białaczki są klonalnymi proliferacjami komórek, powstałe rearanŜacje powinny
być identyczne we wszyskich komórkach danej białaczki. Tak więc, powstałe regiony
złącz są swoistymi, unikalnymi „odciskami palców” i stanowią idealne markery obecności komórek białaczkowych [24, 29]. Istotę metody stanowi rozróŜnienie pomiędzy
klonalnymi produktami PCR (pochodzącymi z komórek białaczkowych, z identycznymi regionami złącz) a poliklonalnymi produktami PCR (z komórek zdrowych). Wykorzystane w tym celu mogą być: analiza heterodupleksów, sekwencjonowanie, elektroforeza w gradiencie temperaturowym lub denaturującym, bądź tzw. analiza Gene
Scanning, odbywająca się w automatycznym sekwenatorze DNA z wykorzystaniem
starterów znakowanych fluorochromem. Analiza PCR-Gene Scanning pozwala równieŜ na oszacowanie stabilności klonalnych rearanŜacji Ig/TCR wykrytych w podczas
rozpoznania ALL, w trakcie choroby oraz w porównaniu z ewentualną późniejszą
wznową. PoniewaŜ rearanŜacje genów Ig/TCR mogą być niestabilne w czasie trwania
choroby, kluczowe jest monitorowanie MRD z wykorzystaniem kilku klonalnych markerów [13]. Trwający nadal w trakcie choroby proces rearanŜacji genów lub wtórne
rearanŜacje mogą prowadzić do utraty markera MRD, czego konsekwencją moŜe
być uzyskanie wyników fałszywie negatywnych [14]. W związku z tym, w oparciu
o stabilność rearanŜacji TCR, wysunięto propozycję strategii ich doboru
(TCRD→TAL1→TCRB→TCRG), która pozwoli na bardziej miarodajną detekcję MRD
u wszystkich pacjentów z T-ALL [27]. Podobnie, zaproponowano strategię doboru
markerów klonalnych, która pozwoli na skuteczne monitorowanie MRD u 95% dzieci
z prekursorową B-ALL. RearanŜacje monoklonalne powinny być wybierane w pierwszej kolejności, a najbardziej stabilne okazały się rearanŜacje Kde, następnie IGH
i TCRD. Jako drugą opcję wybiera się oligoklonalne rearanŜacje IGH, a po nich TCRG
296 J. JÓŁKOWSKA
[26]. Inna strategia, oparta równieŜ na wyborze dwóch klonalnych rearanŜacji, zakłada
następującą kolejność stosowania rearanŜacji genów Ig/TCR w prekursorowej B-ALL:
IGH→TCRG→TCRD→IGK→Kde [14]. Kolejny etap analizy MRD stanowi identyfikacja wykrytych klonalnych rearanŜacji Ig/TCR przez bezpośrednie ich sekwencjonowanie, a następnie dokładna analiza sekwencji złącz V-(D)-J, poprzez określenie insercji i delecji po 5’ i 3’ stronie złącza, w porównaniu z sekwencjami segmentów zarodkowych, dostępnych w bazach danych ludzkich genów Ig, VBASE lub ImMunoGeneTics (IMGT). WaŜny etap stanowi wybór rearanŜacji markerowych do analizy RQPCR, spośród wszystkich rearanŜacji zidentyfikowanych u danego pacjenta. Preferowane są w takiej sytuacji rearanŜacje monoklonalne, głównie ze względu na ich duŜą
stabilność podczas choroby. Istotna jest równieŜ czułość rearanŜacji uznanej za potencjalny marker w monitorowaniu MRD, która powinna wynosić przynajmniej 10-4.
WaŜny czynnik w wyborze rearanŜacji markerowych stanowi takŜe wielkość i sekwencja danego złącza. Ostatni etap stanowi analiza RQ-PCR z wykorzystaniem sondy
i startera, komplementarnych do sekwencji zarodkowej analizowanych genów oraz
startera specyficznego dla danego pacjenta, którego sekwencja jest komplementarna do
miejsca zidentyfikowanego złącza.
O rozpoznaniu ALL oraz odpowiedzi na leczenie u dzieci z ALL decyduje obraz
szpiku kostnego. PoniewaŜ badanie to wiąŜe się z duŜym dyskomfortem chorego
dziecka, nie jest ono wykonywane zbyt często. Analizowano potencjalne zalety monitorowania MRD we krwi obwodowej. W przypadku T-ALL, poziom MRD w szpiku
i krwi obwodowej był podobny. Badania te sugerują, Ŝe krew obwodowa moŜe być
równieŜ przydatna do analizy MRD, zwłaszcza w przypadku T-ALL, która często wywodzi się z komórek progenitorowych, zasiedlających raczej grasicę niŜ szpik kostny
[9]. Jeśli chodzi o B-ALL, to poziom MRD we krwi obwodowej był niŜszy niŜ w szpiku kostnym. Z drugiej strony, obecność MRD w krwi obwodowej wskazywała na bardziej agresywną formę białaczki, z większym ryzykiem wystąpienia wznowy. Zaprezentowane wyŜej wyniki badań świadczą o tym, Ŝe analiza MRD u chorych z B-ALL
moŜe mieć takŜe znaczenie kliniczne [9].
Tabela 1. Najczęstsze translokacje chromosomowe w ostrej białaczce limfoblastycznej (ALL), prowadzące do powstawania genów fuzyjnych
Table 1. The most common chromosomal translocations in acute lymphoblastic leukemia (ALL), leading
to fusion genes
Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL)
prekursorowa B-ALL
T-ALL
t(9;22)(q34;q11)
BCR-ABL
t(4;11)(q21;q23)
MLL-AF4
t(1;19)(q23;p13)
E2A-PBX1
t(12;21)(p13;q22)
TEL-AML1
t(1;14)(p32;q11)
SIL-TAL1
Choroba resztkowa i chimeryzm u dzieci z ALL
297
Dobrymi markerami do monitorowania minimalnej choroby resztkowej w ALL
są równieŜ geny fuzyjne. Najczęstsze translokacje chromosomowe w prekursorowej
B-ALL i T-ALL, prowadzące do powstawania genów fuzyjnych, przedstawiono w
Tabeli 1. Geny fuzyjne wykrywa się z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji
in situ (FISH) oraz za pomocą RT-RQ-PCR [11]. W przypadku ALL metodę RT-RQPCR najczęściej wykorzystuje się w celu wykrywania obecności genów fuzyjnych
takich jak: BCR-ABL, TEL-AML1, MLL-AF4, E2A-PBX1 w przypadku ALL z komórek
prekursorowych limfocytów B (BCP-ALL) oraz SIL-TAL1 w przypadku ALL z komórek prekursorowych limfocytów T (T-ALL). Metoda pozwala na dokładne określenie
liczby transkryptów genu fuzyjnego przy rozpoznaniu choroby w porównaniu z mRNA
genu konstytutywnego. Wybór odpowiedniego genu kontrolnego ma kluczowe znaczenie dla wiarygodności i powtarzalności wyników. Powinien on charakteryzować się
stabilnością, a startery do jego amplifikacji naleŜy zaprojektować w taki sposób, aby
nie następowało powielanie sekwencji genomowego DNA np. pseudogenów. Gen fuzyjny, wykryty w momencie rozpoznania choroby, stanowi idealny marker do monitorowania MRD na poszczególnych etapach leczenia. Technologia taka umoŜliwia wykrywanie minimalnej choroby resztkowej z czułością 10-5–10-6.
Wykrywanie komórek białaczkowych jest równieŜ moŜliwe dzięki cytometrii
przepływowej, w której wykorzystuje się znakowane fluorescencyjnie przeciwciała
monoklonalne [10, 20, 31]. Identyfikowanie komórek o fenotypie białaczkowym leŜy
u podstaw badania choroby resztkowej i oparte jest na wykrywaniu w blastach białaczkowych ekspresji swoistych antygenów, które róŜnią je od normalnych komórek.
W około 90% przypadków ALL moŜliwe jest wykrycie przynajmniej jednego, specyficznego immunofenotypu, dzieki któremu staje się moŜliwe monitorowanie choroby
resztkowej. Cytometria przepływowa pozwala na wykrywanie blastów białaczkowych
z czułością 10-4 [20]. Istnieją dane wskazujące na zgodność wyników badania minimalnej choroby resztkowej, uzyskanych z wykorzystaniem technik cytometrii przepływowej oraz RQ-PCR, u chorych z ALL. Obie metody pozwalają na wykrycie jednej
komórki białaczkowej w otoczeniu 10.000 zdrowych komórek. Połączenie obu metod
pozwala na monitorowanie MRD właściwie u wszystkich pacjentów z ALL, zapobiega
teŜ uzyskiwaniu wyników fałszywie negatywnych, na skutek ewolucji klonalnej lub
zmian fenotypowych [18, 23].
Implikacje kliniczne
U pacjentów z ALL monitorowanie MRD ma istotne znaczenie dla podejmowania
strategicznych decyzji terapeutycznych, co bezpośrednio przekłada się na polepszenie
wyników leczenia. Metody badania MRD w ALL są przydatne w ocenie wczesnej
odpowiedzi na leczenie oraz w wyodrębnieniu grupy chorych zagroŜonych wznową
choroby, zanim wystąpią jej kliniczne objawy. Na tej podstawie moŜliwe jest wyodrębnienie grupy chorych, u której naleŜy zastosować badziej zintensyfikowane leczenie
[5, 25]. Niski poziom MRD lub jej brak pod koniec leczenia indukującego stanowi o
dobrym rokowaniu, natomiast ryzyko wystąpienia wznowy jest proporcjonalne do
298 J. JÓŁKOWSKA
poziomu MRD. Coustan-Smith i zespół wykazali, Ŝe choroba resztkowa na poziomie
≤10-2 na zakończenie leczenia indukującego jest złym czynnikiem rokowniczym, co
wiązało się z podwyŜszonym ryzykiem wystapienia wznowy [8]. Pacjenci z MRD na
poziomie ≥10-4 podczas leczenia i pod koniec indukcji remisji charakteryzowali się
znacząco niskim przeŜyciem wolnym od choroby, w porównaniu z pacjentami z wartością MRD <10-4 [5]. Klasyfikacja do grup ryzyka odbywa się na podstawie wyników
MRD, które jako niezaleŜny czynnik prognostyczny, pozwalają na ocenę odpowiedzi
na leczenie [7, 11, 21, 25, 30]. Ponadto klasyfikacja oparta na wynikach MRD pozwala
z większą precyzją wyodrębnić pacjentów z wysokim ryzykiem wystąpienia wnowy
ALL, niŜ podział oparty na badaniach cytomorfologicznych i klinicznych [25, 29].
Pozwala równieŜ na wyselekcjonowanie grupy chorych z opornością na stosowaną
terapię [30]. Istotna jest równieŜ odpowiedź na pytanie, czy MRD ma takie samo znaczenie prognostyczne we wszystkich grupach pacjentów i czy koreluje z innymi znanymi czynnikami ryzyka. Stwierdzono, Ŝe poziom MRD istotnie koreluje z wyodrębnionymi grupami ryzyka, bowiem u pacjentów z grupy wysokiego ryzyka, w porównaniu z grupą standardowego i niskiego ryzyka, znacznie częściej obserwowano wysoki
poziom MRD. Okazało się takŜe, Ŝe u chorych słabo odpowiadających na leczenie (co
oszacowano przez ocenę morfologii komórek szpiku w 8 dniu leczenia indukującego
remisję), chorobę resztkową wykrywano znacznie częściej na zakończenie indukcji,
w porównaniu z chorymi z szybką odpowiedzią na zastosowaną terapię [6]. Występowanie choroby resztkowej korelowało takŜe z wykrywaniem translokacji chromosomowych (wielu pacjentów z Ph+ ALL było takŜe MRD+ na zakończenie leczenia indukującego, obecność translokacji TEL-AML1 była związana z korzystnym rokowaniem i znacząco niskim wykrywaniem MRD) [6, 8].
Analiza MRD jest równieŜ bardzo waŜna w przypadku chorych poddawanych
przeszczepieniu komórek krwiotwórczych. U pacjentów pediatrycznych z relatywnie
wysokim poziomem przetrwałych komórek białaczkowych (10-2-10-3) przed SCT,
prawdopodobieństwo wystąpienia wznowy wynosi około 80%, natomiast z poziomem
powyŜej 10-5 tylko z 25-30% [24]. W przypadku poziomu MRD w granicach 10-4-10-5
lub braku przesłanek świadczących o występowaniu choroby resztkowej, rokowanie
jest zdecydowanie korzystniejsze. Wielu autorów potwierdza silny związek pomiędzy
poziomem MRD przed SCT, a potransplantacyjnym stanem klinicznym chorego,
szczególnie w przypadku ALL [2, 24, 28]. Chodzi tu głównie o moŜliwość określenia
ryzyka ewentualnego wystąpienia wznowy ALL. Co więcej, monitorowanie kinetyki
zmian MRD po SCT oraz zmiany w chimeryzmie hematopoetycznym mogą równieŜ
pomóc w przewidywaniu wznowy. Bardzo istotne okazuje się ustalenie odpowiednich
punktów czasowych, w których pobiera się materiał do badań molekularnych. Główną
przeszkodą bowiem w precyzyjnym monitorowaniu MRD w celu przewidywania
wznowy ALL jest fakt, Ŝe moŜe wystapić ona w krótkim czasie po przeszczepieniu lub
przerwa między kolejnymi badaniami (zminami poziomu MRD) moŜe okazać się zbyt
krótka, nie dając czasu na nawet błyskawiczną interwencję terapeutyczną [24]. Często
wyniki MRD okazują się być takŜe pomocne w podejmowaniu decyzji terapeutycznych oraz w lepszym monitorowaniu postępu choroby, zwłaszcza u pacjentów po prze-
Choroba resztkowa i chimeryzm u dzieci z ALL
299
szczepieniu allogenicznych krwiotwórczych komórek macierzystych z zastosowaniem
niemieloablacyjnego kondycjonowania [12]. Niskie wartości MRD pod koniec leczenia indukującego remisję u dzieci z ALL wiąŜą się z korzystnym rokowaniem. Ocena
poziomu MRD ma takŜe duŜe znaczenie u pacjentów juŜ leczonych z powodu wznowy
oraz zakwalifikowanych do SCT. Natomiast badanie chimeryzmu komórkowego moŜe
być szczególnie pomocne w sytuacji, gdy u danego chorego nie są dostępne specyficzne markery do monitorowania MRD [1].
Niezwykle istotnym parametrem dla podejmowania decyzji klinicznych po SCT
w ALL jest kinetyka chimeryzmu hematopoetycznego. Wykazano, Ŝe dzieci z ALL,
u których występował progresywny wzrost mieszanego chimeryzmu po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych, miały znacząco podwyŜszone ryzyko wystąpienia
wznowy. Wznowę obserwowano równieŜ znacznie częściej u pacjentów ze zwiększającym się mieszanym chimeryzmem, niŜ u pacjentów z pełnym chimeryzmem lub ze
zmniejszającym się mieszanych chimeryzmem [3, 24]. Dla wyselekcjonowania pacjentów z podwyŜszonym ryzykiem wystąpienia wznowy po SCT konieczna jest zatem
seryjna analiza chimeryzmu, w moŜliwie najkrótszych odstępach czasu pomiędzy poszczególnymi badaniami. Co więcej, naleŜy rozwaŜyć kombinację obu metod (chimeryzm, MRD) dla bardziej wiarygodnego monitorowania postępów w leczeniu ALL.
W dobie spektakularnego rozwoju technik molekularnych koniecznością stało się
upowszechnianie diagnostyki molekularnej MRD oraz chimeryzmu hematopoetycznego we wszystkich dziecięcych ośrodkach hematoonkologicznych. W obecnych czasach
trudno sobie wyobrazić prowadzenie chorego po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych, bez monitorowania kinetyki zmian chimeryzmu komórkowego i oceny minimalnej choroby resztkowej. Szczególnie istotne jest równieŜ dopracowanie odpowiedniej strategii pobierania materiału biologicznego do badań molekularnych. Zwiększona
częstotliwość badań chimeryzmu poprzeszczepowego wydaje się być kluczowym elementem, niezbędnym dla wczesnego wykrywania wznowy ALL zwłaszcza, Ŝe choroba
ta moŜe rozwijać się w sposób bardzo gwałtowny. Koniecznością staje się jak najszybsze opracowanie i wdroŜenie standardów badań choroby resztkowej oraz chimeryzmu
poprzeszczepowego, z jednoczesnym powołaniem do działania wyspecjalizowanej
sieci laboratoriów referencyjnych, przy dziecięcych ośrodkach hematoonkologicznych
na terenie całego kraju.
Artykuł ten przygotowano w ramach realizacji projektu zamawianego PBZ-KBN120/P05/2004, koordynowanego przez Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie.
PIŚMIENNICTWO
1. Alizadeh M, Bernard M, Danic B, Dauriac C, Birebent B, Lapart C, Lamy T, Le Prise PY, Beauplet A, Bories D, Semana G, Quelvennec E. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after
bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood 2002; 99(12):
4618-4625.
300 J. JÓŁKOWSKA
2. Bader P, Hancock J, Kreyenberg H, Goulden NJ, Niethammer D, Oakhill A, Steward CG,
Handgretinger R, Beck JF, Klingebiel T. Minimal residual disease (MRD) status prior to allogeneic stem
cell transplantation is a powerful predictor for post-transplant outcome in children with ALL. Leukemia
2002; 16: 1668-1672.
3. Bader P, Kreyenberg H, Hoelle W, Dueckers G, Handgretinger R, Lang P, Kremens B, Dilloo D,
Sykora KW, Schrappe M, Niemeyer C, von Stackelberg A, Gruhn B, Henze G, Greil J, Niethammer D,
Dietz K, Beck JF, Klingebiel T. J Clin Oncol. 2004; 22(9): 1696-705.
4. Beck O, Seidl C, Lehrnbecher T, Kreyenberg H, Schwabe D, Klingebiel T, Seifried E, Bader P,
Koehl U. Quantification of chimerism within peripheral blood, bone marrow and purified leukocyte subsets: comparison of singleplex and multiplex PCR amplification of short tandem repeat (STR) loci. Eur J
Haematol. 2006; 76(3): 237-44.
5. Bjorklund E, Mazur J, Soderhall S, Porwitt-MacDonald A. Flow cytometric follow-up of minimal
residual disease in bone marrow gives prognostic information in children with acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2003; 17: 138-148.
6. Borowitz MJ, Pullen DJ, Shuster JJ, Viswanatha D, Montgomery K, Willman CL, Camitta B.
Minimal residual disease detection in childhood precursor-B-cell acute lymphoblastic leukemia: relation to
other risk factors. A Children’s Oncology Group study. Leukemia 2003; 17: 1566-1572.
7. Cazzaniga G, d’Aniello E, Corral L, Biondi A. Results of minimal residual disease (MRD) evaluation and MRD-based treatment stratification in childhood ALL. Best Pract Res Clin Haematol. 2002;
15(4): 623-638.
8. Coustan-Smith E, Sancho J, Hancock ML, Boyett JM, Behm FG, Raimondi SC, Sandlund JT,
Rivera GK, Rubnitz JE, Ribeiro RC, Pui CH, Campana D. Clinical importance of minimal residual disease
in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000; 96: 2691-2696.
9. Coustan-Smith E, Sancho J, Hancock ML, Razzouk BI, Ribeiro RC, Rivera GK, Rubnitz JE,
Sandlund JT, Pui CH, Campana D. Use of peripheral blood instead of bone marrow to monitor minimal
residual disease in children with acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002; 100(7): 2399-2402.
10. Coustan-Smith E, Ribeiro RC, Stow P, Zhou Y, Pui CH, Rivera GK, Pedrosa F, Campana D. A
simplified flow cytometric assay identifies children with acute lymphoblastic leukemia who have a superior clinical outcome. Blood 2006; 108(1): 97-102.
11. Gabert J, Beillard E, Van der Velden VHJ, Bi W, Grimwade D, Pallisgaard N, Barbany G, Cazzaniga G, Cayuela JM, Cave H, Pane F, Aerts JLE, De Micheli D, Thirion X, Pradel V, Gonzales M,
Viehmann S, Malec M, Saglio G, van Dongen JJM. Standardization and quality control studies of realtime quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual
disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer Program. Leukemia 2003; 17: 2318-2357.
12. Galimberti S, Benedetti E, Morabito F, Papineschi F, Callea V, Fazzi R, Stelitano C, Andreazzoli F, Guerrini F, Ciabatti E, Martino M, Nobile F, Iacopino P, Petrini M. Prognostic role of minimal
residual disease in multiple myeloma patients after non-myeloablative allogeneic transplantation. Leukemia Res. 2005; 29(8): 961-6.
13. Gemano G, del Giudice L, Palatron S, Giarin E, Cazzaniga G, Biondi A, Basso G. Clonality profile in relapsed precursor-B-ALL children by GeneScan and sequencing analyses. Consequences on minimal residual disease monitoring. Leukemia 2003; 17(8): 1573-82.
14. Guggemos A, Eckert C, Szczepański T, Hanel C, Taube T, van der Velden VHJ, Graf-Einsidel
H, Henze G, Seeger K. Assessment of clonal stability of minimal residual disease targets between 1st and
2nd relapse of childhood precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2003; 88: 737746.
15. Hancock J.P., Goulden N.J., Oakhill A., Steward C.G. Quantitative analysis of chimerism after
allogeneic bone marrow transplantation using immunomagnetic selection and fluorescent microsatellite
PCR. Leukemia 2003; 17: 247-251.
Choroba resztkowa i chimeryzm u dzieci z ALL
301
16. Jółkowska J, Pieczonka A, Strabel T, Boruczkowski D, Wachowiak J, Bader P, Witt M. Hematopoietic chimerism after allogeneic stem cell transplantation: a comparison of quantitative analysis by
automated DNA sizing and fluorescent in situ hybridization. BMC Blood Disorders 2005; 5(1): 1-6.
17. Jółkowska J, Derwich K, Dawidowska M. Methods of minimal residual disease (MRD) detection in childhood haematological malignancies. J Appl Genet. 2007; 48(1):75-81.
18. Kerst G, Kreyenberg H, Roth C, Well C, Dietz K, Coustan-Smth E, Campana D, Koscielniak E,
Niemeyer C, Schlegel PG, Muller I, niethammer D, Bader P. Concurrent detection of minimal residual
disease (MRD) in childhood acute lymphoblastic leukaemia by flow cytometry and real-time PCR. Br J
Haematol. 2005; 128(6): 774-82.
19. Kreyenberg H., Holle W., Mohrle S., Niethammer D., Bader P. Quantitative analysis of chimerism after allogeneic stem cell transplantation by PCR amplification of microsatellite markers and capillary
electrophoresis with fluorescence detection: the Tuebingen experience. Leukemia 2003; 17: 237-240.
20. Malec M, van der Velden VH, Bjorklund E, Wijkhuijs JM, Soderhall S, Mazur J, Bjorkholm M,
Porwit-MacDonald A. Analysis of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia:
comparison between RQ-PCR analysis of Ig/TCR gene rearrangements and multicolor flow cytometric
immunophenotyping. Leukemia 2004; 18(10): 1630-1636.
21. Markus M, Mann G, Monschein U, Lodzinski M, Gall C, Flohr T, Viehmann S, Langer T,
Schrappe M, Gadner H, Haas OA, Panzer-Grumayer ER. Minimal residual disease analysis in children
with t(12;21) - positive acute lymphoblastic leukemia: comparison of Ig/TCR rearrangenments and the
genomic fusion gene. Haematologica 2006; 91(5): 683-6.
22. Perez-Simon JA, Caballero D, Diez-Campelo M, Lopez-Perez R, Mateos G, Canizo C, Vazquez
L, Vidriales B, Mateos MV, Gonzalez M, San Miguel JF. Chimerism and minimal residual disease monitoring after reduced intensity conditioning (RIC) allogeneic transplantation. Leukemia 2002; 16: 14231431.
23. Robillard N, Cave H, Mechinaud F, Guidal C, Garnache-Ottou F, Rohrlich PS, Avet-Loiseau H,
Garand R. Four-color flow cytometry bypasses limitations of IG/TCR polymerase chain reaction for
minimal residual disease detection in certain subsets of children with acute lymphoblastic leukemia.
Haematologica 2005; 90(11): 1516-23.
24. Schilham MW, Balduzzi A, Bader P. Is there a role for minimal residual disease levels in the
treatment of ALL patients who receive allogeneic stem cells? Bone Marrow Transplant. 2005; 35: S49S52.
25. Sramkova L, Muzikova K, Fronkova E, Krejci O, Sedlacek P, Formankova R, Mejstrikova E,
Stary J, Trka J. Detectable moinimal residual disease before allogeneic hematopoietic stem cell transplantation predicts extremely poor prognosis in children with acute lymphoblastic leukemia. Pediatr Blood
Cancer 2007; 48(1): 93-100.
26. Szczepański T, Willemse MJ, Brinkhof B, van Wering ER, van der Burg M, van Dongen JJ.
Comparative analysis of Ig and TCR gene rearrangements at diagnosis and at relapse of childhood precursor-B-ALL provides improved strategies for selection of stable PCR targets for monitoring of minimal
residual disease. Blood 2002; 99: 2315-2323.
27. Szczepański T, van der Velden VHJ, Raff T, Jacobs DCH, van Wering ER, Bruggemann M,
Kneba M. Comparative analysis of T-cell receptor gene rearrangements at diagnosis and relapse of T-cell
acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) shows high stability of clonal markers for monitoring of minimal
residual disease and reveals the occurrence of second T-ALL. Leukemia 2003; 17: 2149-2156.
28. Uzunel M, Jaksch M, Mattsson J, Ringden O. Minimal residual disease detection after allogeneic stem cell transplantation is correlated to relapse in patients with acute lymphoblastic leukemia. Br J
Haematol. 2003; 122(5): 788-794
29. van der Velden VHJ, Hochhaus A, Cazzaniga G, Szczepański T, Gabert J, van Dongen JJM.
Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects. Leukemia 2003; 17: 1013-1034.
302 J. JÓŁKOWSKA
30. Willemse MJ, Seriu T, Hettinger K, d’Aniello E, Hop WCJ, Panzer-Grumayer R, Biondi A,
Schrappe M, Kamps WA, Masera G, Gadner H, Riehm H, Bartram CR, van Dongen JJM. Detection of
minimal residual disease identifies differences in treatment response between T-ALL and precursor BALL. Blood 2002; 99(12): 4386-4393.
31. Zwick D, Cooley L, Hetherington M. Minimal residual disease testing of acute leukemia by flow
cytometry immunophenotyping: a retrospective comparison of detection rates with flow cytometry DNA
ploidy or FISH-based methods. Lab Hematol. 2006; 12(2):75-81.
Praca wpłynęła do Redakcji 2.04.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 15.09.2007 r.
Adres Autora:
Dr Justyna Jółkowska
Instytut Genetyki Człowieka PAN, Zakład Genetyki Molekularnej i Klinicznej
ul. Strzeszyńska 32,
60-479 Poznań