jagiellonian university

Prof. dr hab. Marian H. Lewandowski
Zakład Neurofizjologii i Chronobiologii
Katedra Fizjologii Zwierząt
Instytut Zoologii
Uniwersytet Jagielloński
Gronostajowa 9, 30-387 Kraków
: (+12) 664-53-73
E-mail: [email protected]
OCENA
rozprawy doktorskiej Pana magistra inżyniera Marcina DĄBROWSKIEGO pt.
"Wpływ substancji neuroaktywnych na wybrane białka błonowe”
Układ nerwowy w swojej podstawowej strukturze (ogólnej budowie komórki
nerwowej), jak i funkcji (generowaniu potencjału czynnościowego), wydaje się niesłychanie
prosty. Jego skomplikowanie zaczyna się na styku wzajemnej neuronalnej komunikacji, czy
też wpływie różnych substancji na jego aktywność. Do zrozumienia mechanizmu tych
wzajemnych oddziaływań konieczna jest znajomość budowy błony neuronalnej, głównie
jednak specyficznego rodzaju białek błonowych, budujących kanały jonowe, w tym
szczególnie tego najważniejszego przepuszczalnego dla jonów sodu, którego aktywność
regulowana jest zmiennym napięciem elektrycznym błony.
Przedstawiona do recenzji praca bada mechanizm wpływu trzech substancji
neuroaktywnych (alfa toksyny z jadu skorpionów oraz dwu pyretroidów: permetryny i
deltametryny) na aktywność napięciowo zależnych kanałów sodowych aksonu olbrzymiego
karaczana amerykańskiego Periplaneta americana. Wprawdzie literatura przedmiotu
bogata jest w doniesienia dotyczące badanego tematu, to jednak ciągle nie do końca jest ona
wystarczająca do opracowania skutecznych metod stosowania insektycydów, czy też
wykorzystania otrzymanych wyników w szeroko pojętej farmakoterapii.
Praca doktorska Pana mgr Dąbrowskiego nie wykorzystuje jednak, jak można by
przypuszczać, tylko narzędzi klasycznej elektrofizjologii. Autor uważa i słusznie, że do
pełnego zrozumienia mechanizmów zachodzących na poziomie badanego białka, konieczne
jest wprowadzenie nowych metod: komputerowej symulacji białek, ale także dla
obrazowania wzajemnych oddziaływań kanał-toksyna, techniką mikroskopii sił atomowych.
Taki wachlarz metodyczny pozwala lepiej zrozumieć dynamikę molekularną i mechanizmy
powiązania badanej substancji na poziomie analizowanego kanału jonowego.
Podkreślam ten nowatorski element metodyczny, jako bardzo ważny w tej pracy,
bowiem ciągle zbyt nieśmiało wprowadzany jest on do badań przez większość rodzimych
neuronaukowców. A szkoda, gdyż podejście modelowe, szczególnie w oparciu o wyniki
eksperymentalne,
może
być
ich
cennym
uzupełnieniem.
Piszę
to
z
pełną
odpowiedzialnością i nieukrywaną zazdrością, doskonale bowiem zdaję sobie sprawę, jak
ważne, a bardzo często konieczne są niekonwencjonalne narzędzia matematyczne fizyczne (modelowe) przy analizie wyników aktywności neuronalnej, szczególnie jeśli
opisuje ona tak skomplikowane wzajemne powiązania, jak te będące przedmiotem pracy
doktorskiej Pana mgr Dąbrowskiego.
Autor postawił sobie, bardzo jasno sprecyzowane cele pracy. W pierwszym i drugim,
wykorzystuje duże doświadczenie elektrofizjologiczne jednego z promotorów pracy (prof.
Stankiewicz), postanawia zbadać wpływ alfa toksyny z jadu skorpiona na aktywność
bioelektryczną neuronu karaczana, przy podawanym zmiennym napięciu. Zamierza także
określić wzajemną zależność alfa toksyny i powszechnie stosowanego insektycydu
(pyretroidu) na badaną aktywność neuronalną. W kolejnych zadaniach, wykorzystuje
doświadczenie drugiego promotora (prof. Nowaka), i buduje na poziomie aminokwasów,
model molekularnego oddziaływania badanej toksyny z kanałem sodowym, badając wpływ
występowania i kierunku pola elektrycznego na dynamikę tych oddziaływań, aby w końcu
przy wykorzystaniu mikroskopii sił atomowych zobrazować zmiany żywego neuronu pod
wpływem stosowanych neurotoksyn.
Przedmiot podjętych badań jest zatem ważny i aktualny, a postawione cele są bardzo
jasne, ambitne, ale i bardzo trudne. Autor bowiem, co warto podkreślić, w swojej pracy
poszukuje najlepsze (optymalne) dopasowanie tworzonych modeli do wyników
otrzymanych w realnym eksperymencie elektrofizjologicznym. Takie podejście, wymaga
sporo czasu, wytrwałości i odporności na niepowodzenia, które towarzyszą tego typu
analizom.
Praca nie ma typowego układu rozprawy doktorskiej, choć nie jest to zarzut.
Rozpoczyna ją dobrze napisane zwięzłe streszczenie z głównymi wnioskami i słowami
kluczowymi. Obszerny wstęp wprowadza czytającego w badane zagadnienia, szczególnie
stosowną metodykę, którą autor opisuje w oparciu o dobrze dobraną literaturę. Liczne
schematy i ryciny, pozwalają lepiej zrozumieć, szczególnie nie przez fizyka, stosowane
narzędzia metodyczne. Autor wyjaśnia zasadność podjęcia tematu, wskazuje na jego
złożoność, która stała się inspiracją do dodatkowego metodycznego podejścia w celu
2
lepszej interpretacji i pełniejszego wyjaśnia wcześniej uzyskanych i własnych wyników
badań elektrofizjologicznych. Wstęp kończą jasno sformułowane, jak wyżej, cele pracy.
Kolejne rozdziały to pełne opisy stosowanych metod do realizacji wcześniej
postawionych celów badawczych, przedstawienie otrzymanych wyników, ich dyskusja oraz
wypływające z nich wnioski. Taki układ właśnie nazywam nietypowym. Stosowana
metodyka badawcza w zakresie badań elektrofizjologicznych nie budzi moich zastrzeżeń.
Jest ona powszechnie stosowana, a grupa badawcza prof. Stankiewicz należy do jedynej w
Polsce, która z dużym naukowym powodzeniem, kontynuuje Toruńskie tradycje
elektrofizjologii bezkręgowców. Pan mgr Dąbrowski w logicznie zaplanowanych, a
następnie
konsekwentnie
realizowanych
poszczególnych
etapach
badań
elektrofizjologicznych wykazał, że efekt działania testowanej toksyny skorpiona na neurony
karaczana jest napięciowo zależny. Zwiększanie częstotliwości stymulacji aksonu
powodowało zmniejszenie efektu działania toksyny. Autor tłumaczy to zjawisko częstą
aktywacją (ruchem) czujnika napięciowego kanału sodowego. Ruch ten mógł skutecznie
ograniczać wiązanie się toksyny z odpowiednim dla niej receptorem w kanale sodowym,
którego lokalizacja jest blisko „czujnika”, czyli segmentu S4, co w konsekwencji mogło
ograniczać wiązanie toksyny z miejscem receptorowym i jej zmiejszone działanie. Na tym
etapie badań autor zauważył jednak, ciekawe zjawisko rytmicznych oscylacji czasu trwania
potencjału czynnościowego. Ciekaw jestem, jaki mechanizm jonowy może temu
towarzyszyć oraz czy autor znajduje, jakieś fizjologiczne wytłumaczenie (znaczenie) tych
rytmicznych oscylacji? Kolejny etap badań elektrofizjologicznych miał na celu sprawdzenie
wzajemnej funkcjonalnej zależności działania permetryny od alfa toksyny. Po testowym
znalezieniu efektywnego stężenia toksyny skorpiona, autor w jednoznaczny sposób
wykazał, że wzmaga ona, nawet dwukrotnie, działanie powszechnie stosowanego
insektycydu, jakim jest permetryna. Efekt ten nie jest jednak wynikiem kumulacji stężeń
obu związków, bowiem samo podanie alfa toksyny w testowanym stężeniu, nie miało
wpływu na depolaryzację badanego aksonu. Mechanizm zwiększonego powinowactwa
permetryny do kanału sodowych w obecności alfa toksyny, autor tłumaczy wzajemnym
pozytywnym allosterycznym oddziaływaniem dwu miejsc receptorowych (3 i 7) badanych
neurotoksyn.
Kolejny cykl badań dotyczy drugiego etapu pracy doktorskiej, modelowania oddziaływań
neurotoksyn z kanałem sodowym i badania zmiany morfologii błony komórkowej neuronu
po podaniu neurotoksyn, metodą mikroskopii sił atomowych. Autorowi udało się zbudować
3
model domeny IV napięciowo zależnego kanału sodowego i cały kanał sodowy, który
zdaniem doktoranta, może być wykorzystywany do symulacji wpływu oddziaływań
badanych substancji z kanałem. Stworzony przez autora model kanału pozwolił określić
zmianę jego dynamiki pod wpływem pola elektrycznego, która objawiała się zmianą
charakteru i siły powiązania toksyny z kanałem. Słowem, stworzony z dużym sukcesem
przez autora model kanału otwiera zupełnie nowe możliwości badania jego kinetyki w
powiązaniu z wpływem na jego aktywność różnych peptydów.
Wyniki ostatniego etapu zaplanowanych badań należy potraktować pilotażowo, jako
dobry „zaczyn” do dalszych prób ulepszania metody obrazowania powierzchni żywego
neuronu. Sam autor w sposób krytyczny, a zatem naukowo, bardzo dojrzały, ocenia ich
rezultaty. Wprawdzie udało się uzyskać, jak sam to określa „unikatowy obraz żywego
neuronu”, lecz otoczonego osłonką mielinową komórek Schwanna, które niestety i na cale
szczęście dla fizjologii neuronu, maskują (izolują) samą błonę neuronu. Wprawdzie po
podaniu alfa toksyny nie obserwowano żadnych morfologicznych różnic, to jednak
permetryna powodowała silne zmiany obszaru neuronu, badanego siłami mikroskopii
atomowej. Efekt ten, jak krytycznie ocenia autor nie koniecznie jednak, musi być związany
z wpływem samej permytryny, ale związków towarzyszących stosowanej metodzie.
Prezentowane przez autora wyniki badań, oprócz części opisowej, zawierają także
bogatą dokumentację graficzną, dodatkowo ilustrującą i potwierdzającą otrzymane
rezultaty, które autor w sposób ostrożny dyskutuje w oparciu o bogatą i dobrze dobraną
literaturę.
W podsumowaniu, chciałbym wyraźnie podkreślić, że autor wynikami swojej pracy,
stosując konsekwentnie precyzyjne i skomplikowane metodycznie procedury, osiągnął
zamierzone cele. Doktorat Pana Dąbrowskiego to pionierskie, bardzo obszerne, solidne i
cenne opracowanie, uzupełniające dotychczasowe wyniki, otrzymane w klasycznych
eksperymentach elektrofizjologicznym, dotyczące błonowych mechanizmów na poziomie
pojedynczych kanałów jonowych, wzajemnych interakcji neurotoksyna - kanał.
Z obowiązku recenzenta zmuszony jestem, także wskazać pewne uchybienia pracy,
które nie dotyczą jej części merytorycznej, a jedynie formy edytorskiej. Nie będę ich
wymieniał w szczegółach, proponuję jednak, aby autor z uwagą raz jeszcze ją przeczytał i
sam je z pewnością dostrzeże. Zwracam uwagę na brak konsekwencji w cytowaniu prac w
tekście, raz autor stosuje kryterium daty ukazania się publikacji (od najstarszej do
4
najnowszej), a innym razem kryterium alfabetyczne. Brakuje w spisie literatury pracy
promotora (W. Nowak, 2014) na którą autor powołuje się str.30 i 33. Nie ma powodu także
umieszczać inicjałów imion autorów przy ich nazwiskach. Niektóre figury są mało czytelne
(Rys. 1.3.4), a na kilku brakuje pełnego opisu np. skali (Rys.1.2.2), zaznaczenia koloru
(Rys.1.2.8). Jest też sporo literówek, również przy nazwiskach (str.38 Bielkmar czy
Bjelkmar?), niezręczności językowych np. co oznacza, że cyt. „Kompleks był
udokładniony…” str. 40. Lepiej mówić o miejscach niż „residuach” Rys. 1.3.8. Nie ma też
konsekwencji w pisaniu angielskich określeń, raz i tak powinno być, autor pisze je kursywą,
a innym razem liternictwem prostym. Nie ma „modów” drgań, tylko są moduły str.50.
Te drobne uwagi, w żaden sposób oczywiście nie wpływają, na bardzo wysoką
wartość merytoryczną recenzowanej pracy.
Uważam zatem, że rozprawa doktorska spełnia wymogi określone w art. 13
Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach
i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 z późn. zm.). Stanowi ona oryginalne
rozwiązanie przez autora problemu naukowego i wskazuje na Jego ogólną wiedzę
teoretyczną w dyscyplinie naukowej, której dotyczy recenzowana praca, a także
umiejętność samodzielnego prowadzenia pracy naukowej. Zwracam się zatem do Rady
Naukowej Instytutu Fizyki Uniwersytetu Mikołaja Kopernika o dopuszczenie Pana mgr
inż. Marcina Dąbrowskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego.
Prof. dr hab. Marian H. Lewandowski
Kraków dnia 04. listopda 2015.
5