PRACOWNIA HODOWLI I BIOTECHNOLOGII

Zadania MRiRW
Zadanie nr 99: Ocena możliwości wytworzenia nowej puli genowej w
aspekcie występowania dysfunkcji ograniczających
męską płodność roślin kapustowatych
Kierownik zadania: dr Piotr Kamiński
W 2010 roku kontynuowano badania nad oceną możliwości identyfikacji
i wykorzystania mechanizmów ograniczających męską płodność roślin
kapustowatych dla stworzenia nowej puli genowej. Badania obejmowały
analizę cech morfologicznych, użytkowych oraz wyrównania
wewnątrzliniowego męskosterylnych oraz męskopłodnych genotypów
uzyskanych w wyniku zapyleń wsobnych i siostrzanych w poprzednim
sezonie wegetacyjnym. Jednocześnie na podstawie cech morfologicznych
i użytkowych eksperymentalnych mieszańców F1 otrzymanych w wyniku
krzyżowań międzyliniowych przeprowadzono ocenę zdolności
kojarzeniowej wybranych męskosterylnych komponentów rodzicielskich
oraz samozgodnych form dopełniających kapusty głowiastej białej.
Dokonano także oceny cech morfologicznych i użytkowych
samozgodnych
populacji
roślin
kapustowatych
oraz
form
męskosterylnych uzyskanych w roku 2009 w fazie generatywnej i
wegetatywnej.
Zadanie nr 100: Analiza potencjału genetycznego nowych form
użytkowych kapusty pekińskiej przystosowanych
do uprawy proekologicznej w warunkach Polski
Kierownik zadania: dr Piotr Kamiński
W roku 2010 w Instytucie Warzywnictwa im. Emila Chroboczka
w Skierniewicach kontynuowano prace zmierzające do zgromadzenia i
oceny zasobów genowych kapusty pekińskiej w celu opracowania
podstaw metodycznych i określenia uwarunkowań genetycznych dla
określenia ich przydatności do uprawy proekologicznej.
Populacje 51 genotypów kapusty pekińskiej rozmnożonych w
roku 2009 charakteryzujących się wysoką zdolnością do rozmnażania
generatywnego, zróżnicowanym poziomem samozgodności oceniono w
fazie wegetatywnej pod względem poziomu odporności i plonowania
również w warunkach ograniczonej ochrony chemicznej, zgodnie z
normami dla upraw ekologicznych i integrowanych. Analiza cech
morfologicznych i użytkowych wykazała istotne zróżnicowanie pomiędzy
fenotypami o różnym pochodzeniu pod względem cech jakościowych
oraz podatności na najważniejsze choroby na podstawowe choroby
występujące w uprawie kapusty pekińskiej: bakteryjne gnicie (Erwinia
spp / Pseudomonas spp), czerń krzyżowych (Alternaria brassicae/
A.brassicola), wewnętrzne brunatnienie główek (tip-burn), pieprzową
plamistość (Pseudomonas syringae pv. maculicola), oraz czarną zgniliznę
(Xanthomonas campestris). Wyselekcjonowane spośród każdego z
genotypów pojedynki o najwyższej zdrowotności i dobrej jakości główek,
zostały przeznaczone do jarowizacji. Będą one służyły, w kolejnym
sezonie wegetacyjnym, do oceny w fazie generatywnej zdolności do
rozmnażania generatywnego, poziomu samozgodności, oraz możliwości
wytwarzania nasion wyrównanych, eksperymentalnych mieszańców
heterozyjnych o wysokiej zdrowotności i jakości główek.
Zadanie nr 101: Poszukiwanie nowych źródeł odporności na
mączniaka rzekomego i opracowanie mechanizmu
dziedziczenia tej cechy u ogórka
Kierownik zadania: mgr Urszula Kłosińska
W warunkach sztucznej inokulacji grzybem Pseudoperonospora
cubensis w warunkach fitotronowych zbadano zmienność wewnątrz- i
międzyliniową cechy odporności/podatności na mączniaka rzekomego
pięciu populacji mieszańcowych pochodzących ze skrzyżowania dwóch
linii jednopiennych (B 6106 - podatnej i B 6115 - odpornej na mączniaka
rzekomego).
W stosunku do roku poprzedniego zaobserwowano
mniejszą zmienność wewnątrzliniową w poszczególnych populacjach
pokolenia F3/Bc1P2, co wskazuje na postępujący proces ich
homozygotyzacji.
W warunkach naturalnego źródła infekcji w polu oceniono 29 obiektów
pod względem odporności na mączniaka rzekomego. Bardzo wysokim i
stabilnym poziomem odporności wyróżniło się sześć linii: DM 48, DM 9,
DM 49, DM 103, DM 100 i DM 106, u których pod koniec wegetacji
zanotowano niskie wskaźniki podatności (DSI=1.3-1.8).
Kontynuowano badania nad doskonaleniem metod hodowli in vivo
grzyba Pseudoperonospora cubensis.
Na podstawie udziału
zarodników zdeformowanych oraz wskaźnika podatności podatnej linii
DM 1 określono wpływ długości przechowywania zarodników w -80oC
na ich wirulencję. Stwierdzono, że okres czterech miesięcy najsilniej
obniżył wirulencję zarodników, co objawiło się bardzo niskim
wskaźnikiem podatności DSI u linii podatnej DM 1 oraz dużym udziałem
(49%) zarodników zdeformowanych.
Badania
cech
anatomiczno-morfologicznych
liścia
wykazały
zróżnicowanie roślin odpornych i podatnych. Stwierdzono, że liście
roślin odpornych są istotnie grubsze niż liście roślin podatnych, ponieważ
grubość każdej tkanki składającej się na budowę anatomiczną liścia
(epiderma górna i dolna, miękisz palisadowy i gąbczasty) była istotnie
większa u roślin odpornych niż u podatnych. Kolejną cechą istotnie
różnicującą liście genotypów odpornych i podatnych była liczba włosków
gruczołowych, których zanotowano znacznie więcej u genotypów
odpornych. Ponadto komórki miękiszu gąbczastego u roślin odpornych
charakteryzowały się bardziej zwartą strukturą, niż u roślin podatnych, co
może także decydować o wyższej odporności roślin na mączniaka
rzekomego.
Zadanie nr 102: Tworzenie nowej zmienności genetycznej odporności
na niskie temperatury u ogórka
Kierownik zadania: dr hab. Elżbieta U. Kozik, prof. nadzw.
Oceniono zmienność wewnątrz- i międzyliniową w populacjach
mieszańcowych F4 i F6 pochodzących ze skrzyżowań linii i odmian o
różnym poziomie chłodoodporności w fazie rozsady i kiełkowania
nasion. Przeprowadzone badania w warunkach obniżonych temperatur
znaczne różnice pod względem dynamiki wschodów oraz uszkodzeń
chodowych na liścieniu, liściu pierwszym i stożku wzrostu. Zakres
wschodów badanych genotypów mieścił się w przedziale od 32% dla
populacji Chipper x PI 246930 do 82% dla populacji Gy14 x PI 390953.
Najsłabsze wartości uszkodzeń chodowych i jednocześnie najmniejszą
zmienność pod względem uszkodzeń chłodowych w fazie pierwszego
liścia stwierdzono dla populacji skrzyżowań Gy 14 z liniami PI 390953 i
PI 246903.
Przeprowadzono wstępną analizę genetyczną zdolności kiełkowania
nasion populacji mieszańcowych otrzymanych ze skrzyżowania linii
różniących się zdolnością kiełkowania w 13oC (PI 390953 – odporny,
Chipper – wrażliwy). Segregacja w populacjach mieszańcowych pokoleń
F1 i F2 wskazuje, że badana cecha dziedziczona jest recesywnie.
Zadanie nr 103: Poszukiwanie markerów DNA sprzężonych z cechą
odporności na mączniaka rzekomego u ogórka oraz
określenie genetycznego zróżnicowania grzyba
Pseudoperonospora cubensis (Berk & M.A. Curtis)
Rostovzev na terenie Polski
Kierownik zadania: dr Hanna Habdas
Kontynuowano badania nad opracowaniem metody selekcji
materiałów hodowlanych ogórka przy pomocy markerów DNA blisko
sprzężonych z cechą odporności na mączniaka rzekomego dyniowatych.
Badano pięć linii odpornych (DM3, DM4, DM8, DM48 i CH29) i jedną
linię podatną DM1 z Instytutu Warzywnictwa oraz sześć linii odpornych
(162, 175, 150, 106, 76x72, RWI243) i sześć linii podatnych (80x70,
7x30, 8x30, 113x114, NV, B5888) ze stacji hodowlanej Grębałów firmy
,,Polan” w Krakowie.
Izolację genomowego DNA wykonano z
najmłodszych liści każdej rośliny zestawem NucleoSpin® Plant II
(Machery-Nagel). Przeprowadzono reakcje RAPD używając starterów
wybranych w poprzednim roku. Starter OPX18 generował polimorficzny
fragment DNA o wielkości 950pz dla wszystkich badanych roślin
odpornych linii ogórka pochodzących z hodowli Instytutu Warzywnictwa
w Skierniewicach oraz ze stacji hodowlanej Grębałów. Marker OPX18950
nie występował w badanych liniach podatnych. Sprzężenie markera
OPX18950 będzie badane w pokoleniu F2 w następnym roku. Oprócz
markerów RAPD, w związku ze zmapowaniem genomu ogórka przez
inne laboratoria, będą poszukiwane specyficzne markery PCR odporności
ogórka na mączniaka rzekomego.
W bieżącym roku od 13.08 do 11.09 zebrano liście porażone
grzybem Pseudoperonospora cubensis z okolic Krakowa, Warszawy,
Skierniewic, Kutna, Lublina, Bydgoszczy, i Tczewa uzyskując 24 próby z
różnych upraw ogórka.
Zadanie nr 106: Ocena zmienności genetycznej funkcjonalnie
sterylnych linii pomidora
Kierownik zadania: mgr Marzena Nowakowska
Badania przeprowadzono na 17. liniach z genem ps oraz 2. liniach
z genem ps-2. Na podstawie analizowanych mierników sterylności
stwierdzono duże zróżnicowanie linii męsko sterylnych. Na wyróżnienie
zasługują dwie linie (W-1.8a, MC68/89) z genem ps oraz dwie linie
(M3090, M3091) z ps-2, które charakteryzowały się najwyższą
sterylnością kwiatów spośród wszystkich badanych obiektów. Analiza
genetyczna poziomu sterylności i budowy kwiatu u linii ps wykazała, że
obie cechy dziedziczone są pojedynczym, recesywnym genem.
Pojawienie się jednak nowych rekombinatów stwarza dodatkowe
trudności w interpretacji wyników, które powinny być zweryfikowane w
następnym sezonie wegetacyjnym poprzez analizę roślin F3. W celu
powiększenia puli genowej męskosterylnych linii o nowe rekombinanty z
pokolenia F2 wyselekcjonowano rośliny z cechą ps o zróżnicowanych
cechach użytkowych (twardość, zróżnicowana barwa i wydłużony owoc,
odporność na czynniki biotyczne). Stwierdzono dużą międzyliniową
różnorodność
fenotypową
badanych
linii,
dotyczącą
cech
morfologicznych roślin (wigor, wzrost, długość gron) i owoców (masa,
kształt). Poziom odporności na choroby: wirusa mozaiki pomidora
(ToMV), bakteryjna cętkowatość, linii męskosterylnych był bardzo
zróżnicowany. Obie linie ps-2 oraz linia W-1.1 ps wyróżniły się
homozygotyczną odpornością na ToMV. Pozostałe linie były podatne na
choroby.
Zadanie nr 107: Poszukiwanie nowych źródeł odporności na zarazę
ziemniaka u pomidora z uwzględnieniem zmian w
patogeniczności w populacjach Phytophthora
infestans oraz próby identyfikacji markerów
sprzężonych z genami odporności
Kierownik tematu: dr hab. Elżbieta U. Kozik, prof. nadzw.
Odporność 45. linii i odmian pomidora na zarazę ziemniaka
badano w dwóch doświadczeniach w warunkach naturalnej infekcji
grzybem Phytophthora infestans. Stwierdzono wyraźne różnice w
podatności badanych obiektów w zależności od lokalizacji. W warunkach
ODR w Boguchwale rośliny badanych populacji były intensywniej
porażone przez P. infestans niż na polu doświadczalnym Instytutu
Warzywnictwa w Skierniewicach. Ponadto w przypadku kilku genotypów
zaobserwowano krańcowo odmienne reakcje na porażenie przez grzyba.
Podobnie jak w latach poprzednich, najwyższym poziomem odporności w
obu lokalizacjach wyróżniła się linia L. hirsutum LA 1033 oraz pięć linii
pomidora uprawnego własnej hodowli. Brak różnic w stopniu porażenia
pomiędzy WV 700, L 3708, LA 1033 oraz porażenie roślin odmian z
genem Ph-1 może sugerować, że populacja patogena, która wystąpiła na
polu doświadczalnym IWARZ należała do rasy 1.
W bieżącym roku poszerzono kolekcję P. infestans o 37 nowych
izolatów, pochodzących z różnych rejonów Polski.
W testach listkowych zbadano poziom wirulencji 46. izolatów na
podatnej odmianie pomidora Rumba. W zależności od użytego izolatu
obserwowano duże różnice w nasileniu objawów chorobowych na
listkach.
Sprawdzono obecność markera T1682 sprzężonego z allelem Ph-2
w liniach pomidora uprawnego oraz dzikich gatunków Lycopersicon.
Marker ten był wyróżnikiem allelu Ph-2 w liniach dzikich gatunków WV
700 (L. pimpinellifolium), L3708 (L. pimpinellifolium), LA1033 (L.
hirsutum). Natomiast w liniach F2 L. esculentum obecność markera
stwierdzono w 4. z 26. wyselekcjonowanych genotypach. Chociaż marker
ten nie był identyfikowany w pozostałych genotypach ocena tych
populacji w warunkach naturalnej infekcji w polu wykazała wysoki
poziom ich odporności.
Zadanie nr 108: Wykorzystanie markerów molekularnych w hodowli
odpornościowej pomidora na choroby powodowane
przez Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici i
Pseudomonas syringae pv. tomato
Kierownik zadania: dr Miroława Staniaszek
Celem prowadzonych badań jest:
1. Identyfikacja markerów SC4871500 i TA01902 w odmianach i
liniach hodowlanych pomidora
2. Opracowanie markera kodominującego do identyfikacji locus Pto na
bazie sekwencji RP4871500, co pozwoli na identyfikację linii
homozygotycznych względem allelu Pto
Ad 1. Materiał do badań stanowiło 98 genotypów pochodzących ze
skrzyżowań, przeprowadzonych między 10 odmianami o wartościowych
cechach użytkowych i odmianą Ontario 7710. Materiał roślinny do
analiz otrzymano z Polskiej Hodowli i Nasiennictwa Roślin
Ogrodniczych „IWARZ-PNOS” w Regułach. Badano również 34
pojedynki otrzymane z PlantiCo Zielonki oraz odmiany testowe i jedną
linię hodowlaną z genem I-2 (Mogeor, Motelle, A241) oraz dwie
odmiany i jedną linię hodowlaną, podatne na fuzaryjne więdnięcie
(Momor, Marmande, A238).
Spośród analizowanych 98 pojedynków pochodzących z „IWARZ-PNOS”
w Regułach obecność markera SC4871500 obserwowano w 74 genotypach,
co świadczy o odporności tych genotypów na Pseudomonas syringae pv.
tomato. Natomiast nie stwierdzono obecności produktów restrykcyjnych
markera TA01902, specyficznych dla allelu dominującego w badaniach 98
genotypów. Dla wszystkich badanych genotypów uzyskano profile
produktów restrykcyjnych markera TAO1902 jak dla linii podatnej A238.
Spośród 34 analizowanych roślin pochodzących z PlantiCo
Zielonki, marker SC4871500 był wyróżnikiem obecności dominującego
allelu Pto w 3 genotypach. Analiza restrykcyjna markera TAO1902
umożliwiła wyróżnienie 4 genotypów odpornych na Fusarium oxysporum
f. sp. lycopersici. Marker TA01902 po trawieniu RsaI i BseGI
identyfikowano dla jednego genotypu odpornego homozygotycznego
względem locus I-2, a dla trzech genotypów wykazano obecność
produktów restrykcyjnych markera TA01902 specyficznych dla allelu
dominującego i recesywnego, co wskazuje, że odmiany te są w stanie
heterozygoty względem locus I-2
Ad 2. Celem badań było opracowanie wariantu amplifikacji markera PCR,
aby możliwe było rozróżnienie genotypów pomidora w stanie homozygoty
i heterozygoty względem allelu Pto.
Analiza sekwencji SC4871555 wykazała obecność przynajmniej 3 miejsc
restrykcyjnych dla enzymu RsaI. W ramach obecnie wykonanych badań
przetestowano 18 par starterów reakcji PCR zaprojektowanych dla różnych
fragmentów sekwencji wyjściowej w celu identyfikacji amplikonu
posiadającego informatywne miejsce restrykcyjne RsaI. Zidentyfikowano
region sekwencji SC4871555, amplifikowany przy wykorzystaniu starterów
oznaczonych symbolami U10 i L, wykazujący oczekiwany polimorfizm
produktów restrykcyjnych. Amplifikację prowadzono w temperaturze
550C, w obecności 3 mM MgCl2 i 0.3 µM każdego ze starterów reakcji
PCR. Produkt amplifikacji SC487547trawiono enzymem RsaI.
Specyficzność i sprzężenie markera DNA zweryfikowane zostanie na
roślinach pokolenia F2 oraz na liniach i mieszańcach odpornych/podatnych
na Pseudomonas syringae pv. tomato
Zadanie nr 109: Poszukiwanie markerów DNA sprzężonych z genem
ps
warunkującym
funkcjonalną
sterylność
pomidora, przydatnych w selekcji materiałów
hodowlanych
Kierownik zadania: dr Mirosława Staniaszek
Zgodnie z przyjętym harmonogramem na 2010 rok realizacja projektu
obejmowała następujące etapy:
- izolację DNA z roślin pokolenia F2
- ocenę polimorfizmu zbiorczych pul DNA z pojedynków F2 dla
wybranych markerów DNA
- ocenę sprzężenia genetycznego wyróżnionych markerów DNA z genem
ps na podstawie
badań pojedynków F2.
Z samozapylenia pokolenia F1 (E 1227) uzyskanego z
krzyżowania linii funkcjonalnie męskosterylnej z genem ps W.1.8 i linii
płodnej M 4155, otrzymano pokolenie mieszańcowe F2 (M 4697). Na
podstawie oceny biologicznej, zidentyfikowano w pokoleniu F2 98 roślin
płodnych i 21 sterylnych. Analiza polimorfizmu komponentów
rodzicielskich, jako wstępny etap identyfikacji markerów RAPD, przy
zastosowaniu 155 starterów RAPD umożliwiła wyselekcjonowanie 3
starterów RAPD, które różnicowały linie rodzicielskie. Zidentyfikowano
3 markery RAPD: OPJ131190, OPK152500 i OPL04800, które powielane
były w sterylnej linii matecznej.
Markery RAPD będące wyróżnikami genu ps badano dla płodnych i
sterylnych genotypów pokolenia F2 (98 genotypów płodnych i 21
genotypów sterylnych). Obecność wielu rekombinantów względem locus
ps: OPJ131190 – 21 rekombinantów, OPK152500 – 30 rekombinantów,
OPL04800 - 17 rekombinantów świadczy, że markery te są słabo
sprzężone z locus ps.
Sposród analizowanych 18 sekwencji specyficznych, znaleziono jedną
przydatną do detekcji genu ps.
Marker C2-211800 jest markerem kodominującym, który umożliwia
identyfikację
genotypów
funkcjonalnie
męskosterylnych
homozygotycznych względem locus ps. Procedura jego detekcji oprócz
etapu powielania sekwencji, obejmuje trawienie enzymen restrykcyjnym
MboI. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym MboI otrzymano fragment
DNA o długości 380 pz , który był wyróżnikiem homozygotycznych
roślin męskosterylnych z genem ps oraz produkt o długości 420 pz
specyficzny dla roślin płodnych. Rośliny heterozygotyczne posiadały oba
produkty restrykcyjne.
Sprawdzono obecność specyficznych fragmentów restrykcyjnych markera
C2-211800 po trawieniu enzymem restrykcyjnym MboI dla 119 roślin
pokolenia F2. Dla 21 sterylnych genotypów roślin pokolenia F2 uzyskano
profile jak dla sterylnej linii matecznej linii. Natomiast wśród 98
płodnych roślin pokolenia F2 analiza restrykcyjna tego markera przy
użyciu enzymu MboI, umożliwiła wyróżnienie 37 genotypów płodnych,
homozygotycznych
względem
locus
ps,
58
genotypów
heterozygotycznych oraz 3 genotypy sterylne.
Przydatność markera C2-211800 do selekcji zostanie zweryfikowana w
odmianach, liniach hodowlanych i mieszańcach F1 pomidora do hodowli
których użyto linie z genem ps.