Fluorescencja

Fluorescencja
Plan wykładu
1) Absorpcja, emisja wymuszona i emisja spontaniczna
2) Przesunięcie Stokesa
3) Prawo lustrzanego odbicia
4) Znaczniki fluorescencyjne
5) Fotowybielanie
Emisja spontaniczna i wymuszona
absorpcja
w
hν
emisja
spontaniczna
emisja
wymuszona
hν
hν
n
hν
∆E = hν
Przesunięcie Stokesa
Przesunięcie Stokesa relaksacja chromoforu
Widmo fluorescencji cząsteczek w roztworze zazwyczaj wykazuje
maksimum dla fal dłuŜszych niŜ widmo absorpcji ze względu na jądrową
relaksację wzbudzonych cząsteczek, których część energii zostaje
przeniesiona do otoczenia przez cząsteczki rozpuszczalnika zanim dojdzie
do fluorescencji wzbudzonej cząsteczki
=> przesunięcie Stokesa
Przesunięcie Stokesa –
relaksacja otoczenia
Dodatkowo, przesunięcie Stokesa moŜe być spowodowane relaksacją
(=reorganizacją) otaczających cząsteczek rozpuszczalnika (do której
dochodzi równieŜ pomiędzy aktem absorpcji i emisji).
Przesunięcie Stokesa - relaksacja
chromoforu c.d.
Energia
Relaksują (słabną) drgania
wewnątrzcząsteczkowe
bg, be – średnia długość wiązania w
stanie
podstawowym i wzbudzonym
∆ – zmiana długości wiązania
podczas oscylacji = be - bg
Λ – wibracyjna energia
reorganizacji (energia potrzebna
do rozciągnięcia lub ściśnięcia
wiązania o (be - bg)
∆
Współrzędne koordynacyjne chromoforu
(np. zmiana długości wiązania)
Przesunięcie Stokesa: hνabs - hνfl =2Λ
Przesunięcie Stokesa – relaksacja
otoczenia c.d.
Analogiczny rysunek do
poprzedniego, ale energia w funkcji
współrzędnych cząsteczek
rozpuszczalnika!
Energia
tu: Λ - energia reorganizacji
rozpuszczalnika
Całkowita energia reorganizacji jest
sumą energii reorganizacji
wibracyjnej (chromoforu) i
rozpuszczalnika
i podobnie:
∆
Współrzędne koordynacyjne
rozpuszczalnika
Całkowite przesunięcie Stokesa jest
sumą przesunięć wibracyjnego i
pochodzącego od rozpuszczalnika
Przesunięcie Stokesa, a polarność
rozpuszczalnika
Ze wzrostem polarności rozpuszczalnika, przesunięcie Stokesa z reguły
rośnie (relaksacja cząsteczek rozpuszczalnika mocno obniŜa energię stanu
wzbudzonego), np. tryptofan moŜe być w białku w róŜnym środowisku
bardziej lub mniej polarnym - maksima fluorescencji dla róŜnych długości fali.
Prawo lustrzanego odbicia
Prawo lustrzanego odbicia
Względna amplituda
Widmo fluorescencji cząsteczki jest zazwyczaj w przybliŜeniu lustrznym
odbiciem widma absorpcji.
ε ≈ ν Dba
absorpcja
F ≈ ν3Dba
fluorescencja
(Uwzględnienie róŜnych
zaleŜności absorpcji i
fluorescencji od
częstotliwości światła)
Liczba falowa (1/λ) [cm-1]
Kiedy prawo lustrzanego odbicia
jest zachowane?
1) Gdy mody wibracyjne są harmoniczne (krzywe energii potencjalnych modów
drgań cząsteczki są opisywane przez parabole; kx2) a ich częstotliwości
wibracji ν są jednakowe w stanie podstawowym i wzbudzonym
=> Wówczas energie moŜliwych przejść wibronowych w widmach absorpcji i
emisji są symetrycznie rozłoŜone po przeciwnych stronach energii przejścia 00, hν00
Energia
np.
hνabs = hν00 + 3hν
hνfl = hν00 - 3hν
hνabs
hν00
lub ogólniej:
hνfl
νabs = ν00 + δ
νfl = ν00 - δ
∆
Współrzędne koordynacyjne chromoforu
Znaczniki fluorescencyjne (barwniki)
Znaczniki fluorescencyjne (barwniki)
- mają powszechne zastosowanie
do badania zmian strukturalnych w białkach i innych cząsteczkach
znakowania Ŝywych komórek
Znaczniki
fluorescencyjne
(barwniki) przykłady
Znaczniki fluorescencyjne – kropki
kwantowe
-nanokryształy (klastry) materiałów półprzewodnikowych (np. CdS, CdSe) o
średnicy ~20 -100 Å otoczone przezroczystą warstwą izolacyjną;
-dodatkowo mogą być pokryte polimerem z przyłączonymi ligandami
konkretnych białek lub innych cząsteczek
Kropki kwantowe
- właściwości fluorescencyjne są związane
z ograniczonymi rozmiarami kropek
- kształt gaussowski pasm fluorescencji
- wąskie pasma fluorescencji - szerokość
spektralna (FWHM) 30-50 nm
- szerokie widma absorpcji (łatwo
wzbudzić światłem o dowolnej długości fali
poniŜej długości fali światła emitowanego)
- bardzo odporne na fotozniszczenie
Białko GFP
Green Fluoresent Protein (GFP)
- GFP silnie „świeci” w zakresie widzialnym i moŜe być genetycznie przyłączane
do innych białek – nie trzeba dodatkowo znakować badanych białek
The Nobel Prize in Chemistry 2008
"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP"
Osamu Shimomura
Martin Chalfie Roger Y. Tsien
GFP
Gly-Tyr-Ser emisja fluorescencji
Aequorea victoria
Pochodne GFP
Pochodne GFP
Fotowybielanie
Fotowybielanie
- fotochemiczny proces nieodwracalnego przejścia cząsteczki w stan
niefluoryzujący (i nieabsorbujący),
- często związany z obecnością O2 w elektronowym stanie singletowym
(wzbudzony stan O2 powstający np. na skutek przeniesienia energii ze
wzbudzonych stanów tripletowych cząsteczek aromatycznych na O2 w
stanie podstawowym)
O2 w stanie singletowym reaguje z podwójnymi wiazaniami C=C
=> fotoprodukty
- wydajność fotowybielania: rzędu 10-7 – 10-6 lub większa przy duŜym
natęŜeniu światła
FRAP i FLIP
- wykorzystanie zjawiska fotowybielenia do badania ruchliwości biomolekuł
(np. lipidów lub białek w błonie biologicznej)
- FRAP = fluorescence recovery after photobleaching
- FLIP = fluorescence loss in photobleaching
FRAP
FLIP
Fluorescencja w róŜnych miejscach próbki obserwowana przez mikroskop