Nr kat. IR641

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
CD246, ALK Protein
Klon ALK1
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR641
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human CD246, ALK Protein, Klon ALK1, Ready-to-Use (Link) jest
przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciało wykazuje odczyn z
prawidłowym ludzkim białkiem ALK oraz chimerą białkową NPM-ALK i jest przydatne w klasyfikacji chłoniaków
anaplastycznych z duŜych komórek (ALCL) do podgrupy wykazującej ekspresję ALK (1, 2). Interpretacja kliniczna
wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich
prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby
pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
CD246 (3).
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Natywne białko chłoniaka anaplastycznego (ALK) o aktywności kinazy o masie cząsteczkowej równej 200 kDa jest
przezbłonowym receptorem wykazującym aktywność kinazy tyrozynowej (4). Ekspresja ALK po urodzeniu występuje
jedynie w postaci nielicznych rozproszonych komórek układu nerwowego (niektóre komórki glejowe i nerwowe,
nieliczne komórki śródbłonka i pericyty) (1).
W około 72,5% przypadków ALCL z obecnością ALK stwierdza się związek z translokacją pomiędzy chromosomem
2 i 5, w wyniku której dochodzi do złączenia genu nukleofosminy (NPM), zlokalizowanego na chromosomie 5q35, z
genem ALK, zlokalizowanym na chromosomie 2p23. Na skutek fuzji część genu NPM kodująca N-końcowy fragment
białka NPM zostaje umieszczona obok części genu ALK kodującego cały fragment cytoplazmatyczny białka ALK. W
następstwie gen ALK dostaje się w obszar działania promotora NPM, co prowadzi do stałej transkrypcji genu
hybrydowego NPM-ALK i wytwarzania chimery białkowej NPM-ALK o masie cząsteczkowej 80 kDa (4).
W 3 duŜych badaniach ALCL stwierdzono, Ŝe w 15-28% chłoniaków z obecnością chimery z ekspresją ALK nie
występowała translokacja t(2;5), a główny alternatywny gen uczestniczący w fuzji został zidentyfikowany jako gen
tropomiozyny 3. Takie zjawisko występuje w 17,5% przypadków ALCL z ekspresją ALK (4).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko
stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: ALK1 (1). Izotyp: IgG3, kappa.
Immunogen
Rekombinowane białko DHFR-ALK zawierające reduktazę dihydrofolianu (DHFR) pochodzenia mysiego oraz
aminokwasy 1359-1460 pełnołańcuchowego ludzkiego białka ALK, odpowiadające aminokwasom 419-520 chimery
białkowej NPM-ALK (1).
Swoistość
Przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD246, klon ALK1, zostały zdefiniowane jako anty-CD246 podczas konferencji
7th International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (7. międzynarodowe
warsztaty i konferencja na temat antygenów róŜnicujących ludzkie leukocyty) (3).
W teście Western blot lizatu linii komórkowej t(2;5)+ SU-DHL-1 stwierdzono znakowanie przeciwciałami pasma o
masie cząsteczkowej 80 kDa, odpowiadającego białku NPM-ALK. Przeciwciała równieŜ rozpoznają pasmo o masie
cząsteczkowej 200 kDa odpowiadające białku ALK linii komórkowej ludzkiego mięsaka prąŜkowanokomórkowego
Rh30, wykazującej ekspresję białka ALK o pełnej długości oraz linii komórkowej 293T transferowanej cDNA
kodującym białko ALK o pełnej długości. Po transfekowaniu linii komórkowej 293T wyłącznie wektorem nie
obserwowano reaktywności (1).
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
(117865-002)
Dako Denmark A/S
IR641/PL/SSMI/07.04.08 str. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, oraz gdy podejrzewa się
problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie preparatów cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje się po
wstępnej obróbce tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX, Target Retrieval Solution, Low pH (10x), (Link)
(nr kat. K8005).
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, które zostały odparafinowane, zalecany jest odczynnik Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101).
Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link.
Postępować według procedury wstępnej obróbki zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX, Target
Retrieval Solution, Low pH (10x), (Link) (nr kat. K8005). Dla aparatów PT Link naleŜy stosować następujące
parametry: Temperatura wstępnego ogrzewania: 65°C; temperatura i czas odmaskow ania antygenu: 97°C przez
20 (±1) minut, ochłodzić do 65°C. Usun ąć statywy na szkiełka aparatu Autostainer wraz ze szkiełkami ze zbiornika
aparatu PT Link i natychmiast zanurzyć szkiełka w słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109)
wypełnionym rozcieńczonym buforem EnVision FLEX Wash Buffer (10x), (Link) (nr kat. K8002) o temperaturze
pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na 1 – 5 minut.
Skrawki zatapiane w parafinie: W celu odmiennego przygotowania próbek zarówno odparafinowanie, jak i
odmaskowanie moŜna wykonać w aparacie PT Link z zastosowaniem zmienionej procedury. Informacje moŜna
znaleźć w Instrukcji uŜytkownika aparatu PT Link. Po zakończeniu wykonywania odczynu skrawki tkankowe naleŜy
poddać odwodnieniu, oczyszczeniu i nakryć za pomocą środka do trwałego zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek Dako Silanized Slides (nr kat. S3003).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+, Mouse, High pH, (Link) (nr kat. K8002), zastępując
odczynnik High pH Target Retrieval Solution z tego zestawu odczynnikiem EnVision FLEX Target Retrieval
Solution, Low pH (10x), (Link) (nr kat. K8005). W systemie Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy
odczynu i czasy inkubacji. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników
przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym
systemie Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury
inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
Optymalne warunki mogą zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny być
określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym
nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako w celu
uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie
zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części
„Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (nr kat.
K8008). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować chłoniaki
anaplastyczne z duŜych komórek z translokacją t(2;5), natomiast we wszystkich dodatnich preparatach
komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka
wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja
wybarwienia
Charakterystyka
działania
Komórki znakowane przeciwciałem wykazują odczyn cytoplazmatyczny i/lub jądrowy.
Tkanki normalne: Przeciwciała wykazują reakcję w obrębie układu nerwowego – z niektórymi komórkami gleju,
nielicznymi komórkami śródbłonka, pericytami i pojedynczymi rozproszonymi komórkami nerwowymi. Nie wykazano
znakowania komórek tkanki krwiotwórczej ani limfoidalnej bądź tkanek pochodzących z przewodu pokarmowego i
układu moczowo-płciowego (1).
Tkanki patologiczne: Przy uŜyciu przeciwciał przeanalizowano 239 przypadków chłoniaka, stwierdzając Ŝe w 53,4%
(39/73) przypadków ALCL wystąpiła ekspresja CD30+. Więcej przypadków dodatniego odczynu na ALCL stwierdzono u
dzieci (23/26 przypadków = 88,5%) niŜ u dorosłych (16/47 przypadków = 34,0%). Z nielicznymi wyjątkami wszystkie
komórki nowotworowe w przypadkach dodatnich wykazywały silny odczyn. Dodatni odczyn z ALK stwierdzono jedynie
w 1 z 17 przypadków nowotworów o typie „Hodgkin’s-like ALCL”. W Ŝadnym z 50 przypadków klasycznego chłoniaka
Hodgkina, licznych innych typach chłoniaków oraz białaczek nie stwierdzono odczynu (1).
W innym badaniu (2), 51% (36/70) przypadków ALCL dało wynik dodatni z przeciwciałem, w tym 15 (42%) przypadków
komórek T, 16 (44%) null i 5 (14%) komórek B. śaden z przypadków ALCL z komórek B nie wykazywał morfologii ani
immunofenotypu rzadko występujących chłoniaków z duŜych komórek B wykazujących ekspresję ALK i CD30
ujemnych, opisywanych przez Delsola i wsp. (5), co moŜe oznaczać, Ŝe „prawdziwe” ALCL z komórek B, wykazujące
ekspresję ALK+, nie istnieją. W chłoniaku anaplastycznym z duŜych komórek z translokacją t(2;5), rozproszone komórki
nowotworowe wykazują reakcję o stopniu umiarkowanym do silnego.
(117865-002)
Dako Denmark A/S
IR641/PL/SSMI/07.04.08 str. 2/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Piśmiennictwo
1.
Pulford K, Lamant L, Morris SW, Butler LH, Wood KM, Stroud D, et al. Detection of anaplastic lymphoma
kinase (ALK) and nucleolar protein nucleophosmin (NPM)-ALK proteins in normal and neoplastic cells with the
monoclonal antibody ALK1. Blood 1997;89:1394-404.
2.
Gascoyne RD, Aoun P, WU D, Chhanabhai M, Skinnider BF, Greiner TC, et al. Prognostic significance of
anaplastic lymphoma kinase (ALK) protein expression in adults with anaplastic large cell lymphoma. Blood
1999;93:3913-21.
3.
Pulford K, Mason DY. TC5. CD246 (ALK) cluster report. In: Mason D, André P, Bensussan A, Buckley C, Civin
C, Clark E, et al., editors. Leucocyte typing VII. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 7th
International Workshop and Conference; 2000 Jun 19-23; Harrogate, United Kingdom. New York: Oxford
University Press Inc.; 2002. p. 694-6.
4.
Stein H, Foss H-D, Dürkop H, Marafioti T, Delsol G, Pulford K, et al. CD30+ anaplastic large cell lymphoma: a
review of its histopathologic, genetic, and clinical features. Blood 2000;96:3681-95.
5.
Delsol G, Lamant L, Mariamé B, Pulford K, Dastugue N, Brousset P, et al. A new subtype of large B-cell
lymphoma expressing the ALK kinase and lacking the 2;5 translocation. Blood 1997;89:1483-90.
Obja śnienie s ym boli
Nume r kata lo go wy
Temp era tu ra p rzec ho wywa ni a
Zu Ŝyć p rzed
Wyr ób me dycz ny d o
d ia gn ostyki i n vi tro
Zawa rtość wystarcz a na <n >
te stów
Prod uce nt
Sp ra wdz ić w i nstru kcji
sto sow an ia
Nu mer se rii
(117865-002)
Dako Denmark A/S
IR641/PL/SSMI/07.04.08 str. 3/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17