terapia genowa

Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Zakład Biologii Molekularnej
Materiały do ćwiczeń z przedmiotu:
„TERAPIA GENOWA”
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Plan ćwiczeń
Ćwiczenie 1: Przygotowanie warsztatu terapii genowej
1. Kontrola jakościowa preparatów plazmidowych pAAV/LacZ,
Ćwiczenie 2: Transfer genów do komórek
1. Transfekcja komórek (HEK293; B16F10) kompleksami pAAV/LacZ:PEI oraz
pAAV/GFP:PEI
Ćwiczenie 3: Ekspresja transgenu
1. Badanie ekspresji genu wprowadzanego do komórek na plazmidzie pAAV
2. Badanie obecności sekwencji transgenu (GFP) z wykorzystaniem techniki PCR
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Ćwiczenie 1
Kontrola jakościowa preparatów plazmidowych pAAV/LacZ:
1. Wirowanie hodowli bakteryjnej nocnej pAAV/LacZ (pAAV/GFP).
2. Izolacja plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych z wykorzystaniem
komercyjnego zestawu odczynników
3. Cięcie enzymatyczne wyizolowanego plazmidowego DNArozdział
elektroforetyczny
Ad.1.
•
Pobrać po 2ml hodowli bakteryjnej (pAAV/LacZ) do dalszej analizy (miniprep);
•
•
•
Odwirować 2ml hodowli bakteryjnej: >8000 rpm, 3’ RT; odrzucić supernatant
Osad zawiesić w 250 µl buforu P1, przenieść do świeżego eppendorfa
Do probówki dodać kolejne 250 µl buforu P2, dokładnie wymieszać obracając
probówkę kilkukrotnie
Dodać 350 µl buforu N3 i wymieszać jak poprzednio
Zwirować: 13000rpm, 10min
Supernatant przenieść na kolumnę do wirowania (QIApreo spin kolumn)
Zwirować 1’, odrzucić przesącz
Przepłukać kolumnę 0,75ml buforu PE i wirować przez 1’
Odrzucić przesącz, kolejne wirowanie: 1’ 13000rpm
W celu wyeluowania pDNA kolumnę przenieść do nowego eppendorfa, delikatnie
nakroplić na nią 50 µl H2O, pozostawić na 1-5’ na blacie, zwirować (1’)
Ad.2.
•
•
•
•
•
•
•
Ad.3.
Objętość reakcyjna: 20 µl
Stężenie wyjściowe pDNA(pAAV/LacZ):
Do reakcji: 1-2 µg pDNA
Bufor reakcyjny 10X 1X
Enzym restrykcyjny:10U/µl/reakcję
Wielkość fragmentów po cięciu:
Ø
Bufor
2 µl
Cięcie
enzymatyczne
2 µl
NotI
-
1 µl
H2O
pDNA
•
•
•
Inkubacja mieszaniny reakcyjnej przez 1h, 37 oC
Przygotowanie 1,8% żelu agarozowego (2,52 g agarozy/140 ml buforu 1X TBE (Trisacetate); podgrzać w mikrofalówce do momentu uzyskania klarownego roztworu, co
jakiś czas mieszając zlewkę z płynem; dodać BrEt (5 µg/µl5 µg/ml); przelać roztwór
do saneczek elektroforetycznych, pozostawić żel do zastygnięcia)
Elektroforeza agarozowa: nałożyć po 10 µl/studzienkę mieszaniny reakcyjnej
zmieszanej z obciążnikiem (2 µl) + marker wielkości w ilości 4 µl ( na pierwszą z
brzegu studzienkę); 30-40min, 100V; po wskazanym czasie żel sprawdzić
podświetlając go promieniami UV
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Ćwiczenie 2
Transfekcja komórek (B16F10) kompleksami pDNA:PEI
Protokół opisuje ilości na 1 (10cm) płytkę;
PEI=polietylenoimina
Stężenia plazmidów pAAV/LacZ st.:
pAAV/LacZ st
pAAV/GFP:
współczynnik kompleksowania R= µl PEI/µg DNA (R=2)
•
•
60 µl 1X PEI + 300 µl NaCl
Przygotować mieszaninę pDNA w NaCl;
30 µg (?µl) pDNA dopełnić do 360 µl NaCl
• Dodać (kropla po kropli) mix PEI do mixu pDNA, delikatnie wymieszać, 20-30min 37
o
C
• Zmienić pożywkę na płytkach z komórkami (2,5ml poż.MEM 2%FBS)
• Dodać mix PEI z pDNA na płytki z komórkami (kroplami)
Liczenie komórek w komorze Burkera
Po 10 µl zawiesiny komórek odpipetować na komorę nad i pod środkowym rowkiem,
przykryć szkiełkiem nakrywkowym i liczyć wg wzoru:
LICZBA KOM. W 1ML= N x 10000
CAŁKOWITA LICZBA KOM. = N x 10000 x ROZCIEŃCZENIE
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Ćwiczenie 3
x
x
x
x
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Badanie ekspresji genu wprowadzanego do komórek na plazmidzie pAAV:
1. Zebranie komórek z płytek po transfekcji
2. Liza termiczna osadu komórkowego
3. Test Beta-gal
4. Test Beta-gal in situ (Stratagene)
Ad.1.
• Ściągnąć pożywkę znad powierzchni komórek, dwukrotnie przepłukać je PBSem (69ml/płytkę);
• Płytki z komórkami delikatnie zeskrobać (scaper) z powierzchni płytki i zawieszone w
PBSie przenieść do probówki 15ml
• Zwirować 3’, RT, 1500 rpm, supernatant delikatnie ściągnąć ssawką nie naruszając
osadu komórkowego
Ad.2.
• Osad komórek zawiesić w buforze 0,25M Tris pH=8 w ilości 50-200 µl/próbę,
roztwór powinien być mętny;
• (-70 oC 10min, 37 oC 10min)x3
• Wirowanie: 12000 rpm, 10min, 4 oC
• Zebrać supernatant (lizat białkowy), w trakcie początkowych etapów eksperymentu
trzymać na lodzie (nadmiar mrozić w -20 oC)
Ad.3.
• Odpipetować do nowej probówki 10 µl lizatu białkowego /próbę
• Odpipetować tą samą ilość (co lizatu białkowego) samego buforu Tris (próbka ślepa
która posłuży do kalibracji)
• Dodać 3 µl 100X Mg/próbę
• Dodać 50 µl substratu ONPG/próbę
• Dopełnić do 300 µl buforem fosforanowym (0,1 M Na3PO4)
• Inkubacja w 37 oC, 30-60min (żółte zabarwienie)
• Blokowanie reakcji: 500 µl węglanu sodu (1M Na2CO3)
• Pomiar absorbancji przy wartości 420nm
• Pomiar ilości białka.
• Obliczyć współczynnik Abs 420/Abs całościowego białka
Ad.4.
• Ściągnąć ssawką medium znad komórek
• Dodać na płytkę z komórkami 3ml 1X roztworu utrwalającego (fixing solution),
inkubować 10’ RT
• Ściągnąć z płytki utrwalacz, przepłukać komórki dwukrotnie 1X PBSem (4ml/płytkę)
• Dodać 2ml świeżego 1X roztworu wybarwiającego (staining solution), inkubować
15min-24h, 37 oC
• Po ściągnięciu roztworu wybarwiającego komórki, przepłukać je 1X PBSem
(4ml/płytkę)
• Dokonać analizy mikroskopowej
Badanie obecności sekwencji transgenu (LacZ) z wykorzystaniem techniki PCR:
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
1.
2.
3.
4.
Zebranie komórek z płytek po transfekcji
Izolacja DNA (Sherlock, alternatywnie Qiagen)
Pomiar stężenia DNA
Reakcja PCR
Ad.1.
• Osad komórkowy zawiesić w 0,3ml buf. TE, zworteksować
Ad.2.
• Dodać 0,3ml buf. L 1.4, zworteksować
• Dodać 20 µl Proteinazy K, zworteksować
• Inkubacja w 50oC co jakiś czas worteksując próbkę do momentu całkowitego
zlizowania komórek
• Lizat przenieść na kolumnę z żółtym korkiem (filtr 1), zwirować 5000 rpm 1’
• Usunąć kolumnę, przesącz nanieść na kolumnę z niebieskim korkiem (Spin 10 AX),
zwirować 5000 rpm 1’
• Wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do probówki, dodać 0,6ml roztworu K2,
5000 rpm 1’
• Powtórzyć poprzednią czynność
• Przenieść kolumnę do nowej probówki (2ml) i dodać 0,35ml roztworu elucyjnego K3,
2’ RT, następnie 5000 rpm 1’
• Ponownie dodać 0,35ml roztworu K3, następnie zwirować 5000 rpm 1’
• Usunąć kolumnę, eluat (w nim DNA) przenieść do probówki (1,5ml) dodając 5 µl
Wzmacniacza precypitacji oraz 0,6ml izopropanolu, całość wymieszać, zwirować
12000 rpm 5’
• Po odwirowaniu zlać supernatant (osad DNA niebiesko-zabarwiony) i dodać 70%
EtOH, wymieszać , 12000 rpm 5’
• Po wirowaniu zlać supernatant, osad osuszyć przez odwrócenie probówki na 10min w
RT
• Osad po wyschnięciu zawiesić w wodzie dest./buforze TE/10mM pH =8
Ad.3.
• Przygotować 60-krotne rozcieńczenie DNA do pomiaru spektrofometrycznego
(objętość próby: 600 µl)
• Dokonać pomiaru absorbancji badanej próby przy następujących długościach fal: Abs
260 oraz Abs 280
• Obliczyć stężenie DNA wg formuły:
Abs 260*współczynnik dsDNA (50)*rozcieńcznie (60)
Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM.
Ad.4.
Objętość reakcyjna: 20 µl
Stężenie wyjściowe pDNA(pAAV/GFP):
Do reakcji: 100 ng pDNA
Bufor reakcyjny 10X 1X
dNTPs: 10mM
RedTaq: 1U/ µl
Długość produktu:
•
Warunki reakcji:
Bufor 10X
dNTPs
Forward
Reverse
RedTaq
H2 O
pDNA
94 oC 5’
94 oC 30’’
55 oC 30’’
72 oC 30’’
72 oC 10’
4 oC ∞
x 30 cykli
x1
2 µl
2 µl
1 µl
1 µl
1 µl
x