Dako EnVision+ System-HRP (Dwuaminobenzydyna)

Dako
EnVision+ System-HRP (Dwuaminobenzydyna)
Do stosowania z podstawowymi przeciwciałami króliczymi
Kod K4010 15 mL
Kod K4011 110 mL
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Wskazówki te dotyczą systemu EnVision+ peroksydazy chrzanowej firmy Dako (EnVision+ System, HRP).
Zestaw ten przeznaczony jest do stosowania z podstawowymi przeciwciałami króliczymi dostarczanymi przez
uŜytkownika do jakościowego oznaczania antygenów w mikroskopie świetlnym w prawidłowych i
patologicznych tkankach zatopionych w parafinie, zamroŜonych tkankach lub preparatach komórek. MoŜna
uŜywać tkanek preparowanych w róŜnych utrwalaczach, łącznie z etanolem, B-5, płynem Bouina, formaliną
cynkową i obojętnym roztworem buforowanej formaliny.
NaleŜy zapoznać się z paragrafem „Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego” lub ze
„Wskazówkami” systemu detekcyjnego dotyczącymi postępowania immunohistochemicznego odnośnie:
(1) zasady postępowania, (2) wymaganych materiałów, nie dostarczanych, (3) przechowywania, (4) preparatyki
próbki, (5) procedury barwienia, (6) kontroli jakości, (7) wykrywania i usuwania problemów, (8) interpretacji
wyniku barwienia, (9) ograniczeń ogólnych.
Streszczenie
i objaśnienie
EnVision+ System-HRP stanowi dwuetapową technikę barwienia immunohistochemicznego. Podstawę
systemu stanowi polimer znakowany peroksydazą chrzanową (HRP), który związany jest z drugimi
przeciwciałami. Znakowany polimer nie zawiera awidyny ani biotyny. Wskutek tego, wyeliminowane lub
znacznie zmniejszone jest nieswoiste barwienie wynikające z aktywności awidyna-biotyna w wątrobie, nerkach,
tkankach limfoidalnych i skrawkach zamroŜonych. Wszystkie odczynniki w EnVision+ System-HRP, oprócz
płynnej dwuaminobenzydyny+ substratu-chromogenu są gotowe do uŜycia. System ten jest niezwykle czułą
metodą i w wyniku tego optymalne rozcieńczenia przeciwciała podstawowego są do 20 razy wyŜsze od
rozcieńczeń stosowanych w tradycyjnej metodzie peroksydaza – anty-peroksydaza i kilkakrotnie wyŜsze niŜ
rozcieńczenia stosowane w tradycyjnych metodach z wiązaniem antygenu lub znakowaną streptawidynąbiotyną. Przyjęte postępowanie oferuje udoskonalony system generowania sygnałów, słuŜących do
wykrywania antygenów obecnych w niskich stęŜeniach lub niskich mian podstawowych przeciwciał.
Podstawowe przeciwciała wytwarzane przez króliki reagują dobrze ze znakowanym polimerem. Interpretację
jakiegokolwiek barwienia dodatniego lub jego nieobecność powinno się dopełnić badaniem morfologicznym i
histologicznym z odpowiednią kontrolą.
Zasady postępowania
Całą aktywność endogennej peroksydazy tłumi się inkubując próbkę z odpowiednim odczynnikiem blokującym
endogenną peroksydazę. Próbkę następnie inkubuje się z odpowiednio odznaczonym i rozcieńczonym
podstawowym przeciwciałem króliczym, po którym następuje inkubacja ze znakowanym polimerem z
zastosowaniem dwóch kolejnych, 30. minutowych inkubacji. NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe w przypadku przeciwciał
wymagających trawienia enzymatycznego lub docelowego odzyskiwania koniecznym moŜe być
wydłuŜenie czasów inkubacji przeciwciałą podstawowego i znakowanego polimeru o 5 do 10 minut.
Barwienie kończy się 5. do 10. minutową inkubacją z 3,3’-dwuaminobenzydyną (DAB)+ substratemchromogenem, co daje w wyniku brązowo zabarwiony strąt w miejscu antygenu. (Dwuaminobenzydyna jest
potencjalnym środkiem rakotwórczym, patrz paragraf „Środki ostroŜności”.).
Dostarczane
odczynniki
Kod K4010:
Następujące materiały, starczające na 150 wycinków tkanek, zakładając 100 µL na wycinek tkanki, znajdują
się w tym zestawie:
Ilość
1x15 mL
Opis
Blok peroksydazy
0,03% nadtlenek wodoru zawierający azydek sodu.
1x15 mL
Znakowany polimer
Polimer znakowany peroksydazą związany jest z kozimi immunoglobulinami
przeciwkróliczymi w buforze Tris-HCl zawierającym proteinę stabilizującą i środek
przeciwbakteryjny.
(127936-001)
P04047PL_01_K4010_K4011/2015.07 s. 1/7
1x18 mL
Bufor substratu
Roztwór buforu substratu, pH 7,5 zawierający nadtlenek wodoru i środek konserwujący.
1x1 mL
Płynna dwuaminobenzydyna+ chromogen
Roztwór chromogenu 3,3’-dwuaminobenzydyny.
Kod K4011:
Następujące materiały, starczające na 1100 wycinków tkanek, zakładając 100 µL na wycinek tkanki, znajdują
się w tym zestawie:
Ilość
1x110 mL
Opis
Blok peroksydazy
0,03% nadtlenek wodoru zawierający azydek sodu.
1x110 mL
Znakowany polimer
Polimer znakowany peroksydazą związany jest z kozimi immunoglobulinami
przeciwkróliczymi w buforze Tris-HCl zawierającym proteinę stabilizującą i środek
przeciwbakteryjny.
1x120 mL
Bufor substratu
Roztwór buforu substratu, pH 7,5 zawierający nadtlenek wodoru i środek konserwujący.
1x5 mL
Płynna dwuaminobenzydyna+ chromogen
Roztwór chromogenu 3,3’-dwuaminobenzydyny.
Przybory
1
1
Materiały wymagane,
lecz nie dostarczone
Probówka kalibrowana
Plastykowa pipeta pasteurowska
Bibuła
Tkanka kontrolna, dodatnia i ujemna
Barwienie negatywne; wodne, takie jak such hematoksyliną Mayera lub hematoksyliną Mayera modyfikowaną
wg Lillie’ego (kod S3309)
Szkiełka nakrywkowe
Woda destylowana
Etanol, bezwodny i 95%
Mikroskop świetlny (20x-800x)
PoŜywki do mocowania takie jak Glycergel Mounting Medium (kod C0563) lub Faramount, wodna poŜywka do
montowania, gotowa do uŜycia (kod S3025) lub bezwodna, stała poŜywka do montowania Ultramont
(kod S1964)
Pierwsze przeciwciała lub odczynnik kontroli ujemnej
Szkiełka, wielokrotnie opłaszczone L-lizyną lub szkiełka silanizowane (kod S3003)
Słoje lub łaźnie barwiące
Stoper (odpowiedni dla wyznaczenia 3-40 minutowych okresów)
Tryskawki
Roztwór buforu przemywającego
Ksylen, toluen lub zamienniki ksylenu
Opcjonalne materiały wymagane, lecz nie dostarczone
Wodorotlenek amonu, 0,015 mol/L rozcieńczony do 0,037 mol/L
Pen peroksydaza – anty-peroksydaza (PAP Pen) kod S2002)
Środki ostroŜności
(127936-001)
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe
reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali.
Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.1.2
3. Nie uŜywać odczynników po wygaśnięciu daty waŜności dla zalecanej metody przechowywania. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ wskazane w niniejszej ulotce, uŜytkownik musi
zweryfikować takie warunki.
4. Nie zastępować odczynników odczynnikami z innych numerów partii lub z zestawów innych producentów.
P04047PL_01_K4010_K4011/2015.07 s. 2/7
5. Wystawienie enzymów i substratu-chromogenów na działanie silnego światła moŜe mieć niekorzystny
wpływ. Nie przechowywać komponentów zestawu, ani nie prowadzić barwienia w silnym oświetleniu, takim
jak bezpośrednie światło słoneczne.
6. Zastosowanie czasów inkubacji, temperatur innych niŜ podano w instrukcji moŜe spowodować błędne
wyniki, wszelkie takie zmiany muszą być weryfikowane przez uŜytkownika.
7. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych naleŜy stosować
prawidłowe procedury postępowania.
8. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy załoŜyć odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
9. NiezuŜyte ilości roztworu naleŜy zutylizować zgodnie z odpowiednimi przepisami.
10. Na Ŝądanie dostępne są Karty charakterystyki bezpieczeństwa materiału.
Niebezpieczeństwo
DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride
H350
MoŜe powodować raka.
H341
Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne.
P201
Przed uŜyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŜności.
P202
Nie uŜywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa.
P281
Stosować wymagane środki ochrony indywidualnej.
P308 + P313
W PRZYPADKU naraŜenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską.
P405
Przechowywać pod zamknięciem.
P501
Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i
międzynarodowymi przepisami.
Przechowywanie
Odczynniki EnVision+ System-HRP naleŜy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamra Ŝać.
Nie uŜywać po upływie daty waŜności wydrukowanej na fiolkach odczynników lub etykiecie zestawu.
Zmiana w wyglądzie odczynnika taka jak wytrącanie się osadu moŜe wskazywać na niestabilność lub
pogorszenie się stanu. W takich przypadkach, odczynnika/odczynników nie naleŜy uŜywać.
Przygotowanie
odczynników
Brak oczywistych oznak wskazujących na brak stabilności produktów. Dlatego teŜ naleŜy wykonywać kontrole
dodatnie i ujemne jednocześnie z badaniem próbek pacjentów. Jeśli zauwaŜone zostanie nieoczekiwane
zabarwienie, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicą w procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, Ŝe
przyczyną moŜe być niniejszy produkt, naleŜy niezwłocznie skontaktować się z działem Pomocy Technicznej
firmy Dako.
Wskazane jest przygotowanie następujących odczynników przed wykonaniem barwienia.
Roztworu buforu przemywającego
TBST – 0,05 mol/L zbuforowany Trisem roztwór soli z Tweenem (Tris Buffered Saline with Tween) (kod S3006)
jest zalecanym buforem przemywającym do automatycznego lub ręcznego wykrywania
immunohistochemicznego. TBS – 0,05 mol/L zbuforowany Trisem roztwór soli (Tris Buffered Saline) (kod
S1968) i PBS - 0,02 mol/L zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (Phosphate Buffered Saline) (kod S3024) są
takŜe właściwymi roztworami buforów przemywających do barwienia ręcznego. Nie zaleca się stosowania
roztworów buforu przemywającego zawierających azydek sodu. Azydek sodu będzie inaktywować
peroksydazę (HRP) doprowadzając do barwienia ujemnego. NiezuŜyty bufor przechowywać w temperaturze
2–8°C. Pozby ć się buforu, jeśli jego wygląd stanie się mętny.
Wodę destylowaną moŜna stosować do płukania blokady peroksydazy, substratu i barwienia negatywnego.
Pierwsze przeciwciało
W firmie Dako dostępne są stęŜone przeciwciała, jednak optymalne rozcieńczenia muszą być doświadczalnie
określone przez uŜytkownika. Ze względu na wysoką czułość EnVision+ System-HRP rozcieńczenia
przeciwciał pierwotnych mogą być od pięciu do dwudziestu razy wyŜsze niŜ rozcieńczenia stosowane w
tradycyjnych metodach immunohistochemicznych. Rozcieńczenia naleŜy przygotować stosując 0,05 mol/L
bufor Tris-HCl, pH 7,2-7,6, zawierający 1% albuminę surowicy wołowej (rozcieńczalnik przeciwciał (Antibody
Diluent), kod S0809). Dla większości przeciwciał pierwszych stosowanych w tym zestawie 30. minutowy czas
inkubacji jest wystarczający.
Gotowe przeciwciała serii NP „Plus” zoptymalizowane są i zalecane do stosowania w wysokoczułych
systemach detekcji „Plus”. W firmie Dako są równieŜ dostępne skoncentrowane przeciwciała. Wymaga się
optymalizacji skoncentrowanych przeciwciał przez końcowego uŜytkownika. Rozcieńczenia naleŜy
przygotować stosując rozcieńczalnik przeciwciał (Antibody Diluent) (kod S0809) lub rozcieńczalnik zawierający
0,05 mol/L bufor Tris-HCI z 1% albuminą surowicy wołowej (BSA). Gotowe przeciwciała serii N nie są
zoptymalizowane do stosowania w wysokoczułych systemach detekcji Dako „Plus”.
Odczynnik kontroli ujemnej
Doskonale, gdy odczynnik kontroli ujemnej zawiera przeciwciało, które nie wykazuje swoistej reaktywności z
ludzkimi tkankami lub zwykłą/nieodporną surowicą w tej samej matrycy/rozcieńczeniu co przeciwciało
pierwotne. Odczynnik kontroli ujemnej powinien naleŜeć do tej samej podklasy i gatunku zwierząt co
przeciwciało pierwsze, być rozcieńczony do takiego samego stęŜenia immunoglobulin lub protein co
przeciwciało pierwsze z uŜyciem tego samego rozcieńczalnika. Czas inkubacji odczynnika kontroli ujemnej
powinien odpowiadać czasowi inkubacji pierwszego przeciwciała.
(127936-001)
P04047PL_01_K4010_K4011/2015.07 s. 3/7
Podczas uŜywania gotowych przeciwciał Dako serii NP „ Plus” odczynnik Universal Negative Control(s)+
zaleca się jako odczynnik kontroli ujemnej. Kontrole te są zoptymalizowane do stosowania z gotowymi mysimi
(kod NP015) lub króliczymi przeciwciałami serii NP „Plus” (kod NP001).
Roztwór substrat-chromogen
Przygotowany według następującego postępowania 1 mL roztworu substrat-chromogen wystarcza na do
dziesięciu wycinków tkanek lub do pięciu rozmazów komórek.
Etap 1
W zaleŜności od ilości szkiełek do barwienia przenieść do probówek po 1 mL buforu z butelki 3a
(bufor substratu) do dostarczonych probówek kalibrowanych.
Etap 2
Do kaŜdego 1 mL buforu dodać jedną kroplę (20 µL) z butelki 3b (płynny chromogen
dwuaminobenzydyny+). Natychmiast wymieszać i nałoŜyć na wycinki tkanek za pomocą pipety
pasteurowskiej.
Przygotowany roztwór substratu-chromogenu jest stabilny przez około pięć dni podczas przechowywania w
temperaturze 2–8°C. Roztwór przed u Ŝyciem naleŜy dokładnie wymieszać. Ewentualny osad pojawiający się w
roztworze nie ma wpływu na jakość barwienia.
Po kaŜdym uŜyciu probówkę i pipetę umyć dokładnie.
Stosowane w całości, 18 mL buforu substratu dostarczanego z K4006 zapewni ilość wystarczającą na 150
badań. Nadmiar moŜe pozostać. Stosowane w całości, 120 mL buforu substratu dostarczanego z K4011
zapewni ilość wystarczającą na 1100 badań. MoŜe pozostać nadmiar.
Barwienie negatywne
Barwny produkt końcowy reakcji barwienia jest rozpuszczalny w alkoholu i powinno się go uŜywać tylko z
wodnym barwieniem negatywnym, takim jak hematoksylina Mayera lub hematoksylina Mayera modyfikowana
wg Lillie’ego (kod S3309). Barwienie negatywne wykonywać hematoksyliną z dokładnym płukaniem wodą
destylowaną, następnie szkiełka z tkankami zanurzyć w w kąpieli 0,037 mol/L amoniaku lub podobnego środka
tuszującego. 0,037 mmol/L wodę amoniakalną przygotowuje się poprzez zmieszanie 2,5 mL 0,015 mol/L
(stęŜonego) wodorotlenku amonowego z 1 litrem wody.
Niewykorzystana woda amoniakalna 0,037 mmol/L moŜe być przechowywana w temperaturze pokojowej
(20–25°C) w szczelnie zamkni ętej butelce do 12 miesięcy.
Po alternatywne procedury barwienia negatywnego naleŜy zajrzeć do wytycznych producenta.
PoŜywka do montowania
PoŜywka do montowania Glycergel® (Glycergel® Mounting Medium) (kod C0563) lub Faramount – bezwodna
poŜywka do montowania, gotowa do uŜycia (kod S3025) zalecane do montowania bezwodnego. Glycergel
trzeba przed uŜyciem podgrzać do przynajmniej 50°C. Mo Ŝna równieŜ uŜywać bezwodnej, stałej poŜywki do
montowania Ultramount (kod S1964).
Przygotowanie
próbek
NaleŜy zapoznać się z paragrafem „Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego” i/lub kartą
specyfikacji przeciwciała.
Przed barwieniem immunohistochemicznym tkanki trzeba utrwalić i opracować. Utrwalanie chroni przed
autolizą i gnilnym rozkładem wyciętych tkanek, zachowuje immunogenność, zwiększa współczynnik załamania
składników tkanki i zwiększa odporność elementów komórkowych na obróbkę tkanki. Obróbka tkanki obejmuje
odwodnienie, usunięcie środków odwadniających, nasączanie środkiem zatapiającym, zatapianie i dzielenie
tkanki na skrawki. Najczęściej stosowane środki utrwalające do preparatów immunohistochemicznych tkanek
zostały omówione w paragrafie „Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego”.
Są to tylko wytyczne. Optymalne metody postępowanie muszą być określone i sprawdzone przez uŜytkownika.
Procedura barwienia
Uwagi dotyczące postępowania
Przed uŜyciem uŜytkownik powinien dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje oraz zapoznać się zawartością
zestawu.
Odczynniki i instrukcje podane w niniejszym zestawie zostały przygotowane w celu uzyskania optymalnych
wyników. Dalsze rozcieńczanie odczynników zestawu lub zmiana czasów lub temperatur inkubacji mogą
powodować błędne wyniki.
Przed immunobarwieniem wszystkie odczynniki naleŜy doprowadzić do temperatury pokojowej (20–25°C).
Analogicznie, wszystkie inkubacje naleŜy przeprowadzić w temperaturze pokojowej.
Nie dopuścić do wysuszenia skrawków tkanek podczas procedury barwienia. Wysuszone skrawki tkanek mogą
wykazywać zwiększone nieswoiste barwienie. Zakryć szkiełka wystawione na działanie przeciągów. Jeśli
stosowane są wydłuŜone inkubacje umieścić tkanki w wilgotnym środowisku.
(127936-001)
P04047PL_01_K4010_K4011/2015.07 s. 4/7
Czułość EnVision+ System-HRP moŜna dalej zwiększyć poprzez wydłuŜanie czasów inkubacji etapów 2
i 3 przez 5-10 minut.
Procedura barwienia
ETAP 1 BLOK PEROKSYDAZY
Postukać szkiełkiem, aby usunąć nadmiar buforu. UŜywając bezkłaczkowego materiału (np.
Kimwipe lub płatka gazy) ostroŜnie przetrzeć dookoła próbkę kliniczną w celu usunięcia nadmiaru
płynu oraz utrzymania odczynnika w określonym miejscu.
NałoŜyć blok peroksydazy z butelki 1 w ilości wystarczającej do zakrycia próbki.
Inkubować przez 5 (±1) minut.
Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub roztworem buforu z tryskawki (nie kierować strumienia
bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŜej kąpieli buforu.
ETAP 2
PIERWSZE PRZECIWCIAŁO LUB ODCZYNNIK KONTROLI UJEMNEJ
Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio.
NałoŜyć optymalnie rozcieńczone pierwsze przeciwciało lub odczynnik kontroli ujemnej w ilości
wystarczającej do zakrycia próbki.
Inkubować przez 30 (±1) minut.
Delikatnie przepłukać roztworem buforu z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na
tkankę) i umieścić
w świeŜej kąpieli buforowej.
Jeśli procedurę barwienia trzeba przerwać, szkiełka moŜna trzymać po inkubacji w kąpieli buforowej
pierwszego przeciwciała (Etap 2) przez okres do godziny w temperaturze pokojowej (20–25°C) bez wpływu na
jakość barwienia.
Kontrola jakości
ETAP 3
POLIMER ZNAKOWANY PEROKSYDAZĄ
Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio.
NałoŜyć znakowany polimer z butelki 2 w ilości wystarczającej do zakrycia próbki.
Inkubować przez 30 (±1) minut.
Wypłukać szkiełka jak polecono w etapie 2.
ETAP 4
SUBSTRAT-CHROMOGEN
Wytrzeć szkiełka jak polecono wcześniej.
NałoŜyć przygotowany roztwór płynnej dwuaminobenzydyny+ substratu-chromogenu w ilości
wystarczającej do zakrycia próbki
(patrz paragraf „Przygotowanie odczynników”.)
Inkubować przez 5–10 minut.
Delikatnie przepłukać wodą destylowaną z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na
tkankę). Zebrać odpady roztworu substrat-chromogen do pojemnika na odpady niebezpieczne celu
właściwego ich usunięcia.
ETAP 5
BARWIENIE NEGATYWNE HEMATOKSYLINĄ (opcjonalne)
Zanurzyć szkiełka w kąpieli wodnej hematoksyliny (kod S3309). Długość czasu inkubacji zaleŜy od
stęŜenia stosowanej hematoksyliny.
Delikatnie przepłukać wodą destylowaną.
Szkiełka zanurzyć 10 razy w kąpieli z 0,037 mol/L amoniaku lub podobnego środka tuszującego.
Delikatnie przepłukać szkiełka wodą destylowaną lub dejonizowaną przez 2–5 minut.
ETAP 6
MONTOWANIE
Próbki moŜna montować i przykrywać szkiełkiem nakrywkowym z wodną poŜywką do montowania,
taką jak Glycergel Mounting Medium (kod C0563) lub Faramount (kod S3025) lub bezwodną, stałą
poŜywką do montowania Ultramount (kod S1964). Szkiełka moŜna takŜe odwodnić i montować na
stałe.
RóŜnice w traktowaniu i procedurach technicznych mogą powodować znaczącą zmienność wyników w
laboratorium uŜytkownika, powodującą konieczność regularnego wykonywania dodatkowych kontroli
wewnętrznych oprócz następujących procedur. NaleŜy sprawdzić wskazówki dotyczące kontroli jakości
zawarte w Programie Certyfikacji dla Immunochemii wg Amerykańskiego Kolegium Patologii (The College
American Pathologists, CAP) oraz w celu uzyskania dalszych informacji naleŜy sprawdzić pozycje
piśmiennictwa od 3 do 5. Szczegóły dotyczące czułości i reaktywności immunologicznej kaŜdego stosowanego
przeciwciała pierwotnego naleŜy sprawdzić arkusz specyfikacji.
Odnośnie dalszych informacji dotyczących kontroli ujemnej i dodatniej naleŜy zapoznać się z paragrafem
„Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego”.
Interpretacja
wybarwienia
(127936-001)
Odnośnie wskazówek dotyczących interpretacji naleŜy zapoznać się z paragrafem „Ogólne wskazówki
barwienia immunohistochemicznego”.
P04047PL_01_K4010_K4011/2015.07 s. 5/7
Ograniczenia
Odnośnie ograniczeń ogólnych naleŜy zapoznać się z paragrafem „Ogólne wskazówki barwienia
immunohistochemicznego”.
Wybarwienie tkanek zaleŜy od traktowania i przygotowania tkanek przed barwieniem. Nieprawidłowe
utrwalenie, zamraŜanie, rozmraŜanie, przemywanie, suszenie, podgrzewanie, dzielenie na skrawki lub
skaŜenie innymi tkankami lub płynami moŜe powodować artefakty, zatrzymywanie przeciwciał lub fałszywie
ujemne wyniki.
UŜycie starych lub niezbuforowanych środków utrwalających lub ekspozycja tkanek na zbyt wysokie
temperatury (wyŜsze od 60°C) podczas traktowania mo Ŝe doprowadzić do zmniejszenia czułości barwienia.
Aktywność endogennej peroksydazy lub pseudoperoksydazy moŜna stwierdzić w hemoproteinach takich jak
hemoglobina, mioglobina, cytochrom i katalaza, ja równieŜ granulocyty kwasochłonne (eozynofile).6,7
Aktywność moŜna hamować inkubując próbki z blokiem peroksydazy butelka nr 1 EnVision+ System, HRP
przez pięć minut przed zastosowaniem pierwszego przeciwciała. Odczynnikiem tym moŜna równieŜ traktować
rozmazy krwi i szpiku kostnego oraz tkanek zamroŜonych. However, this procedure does not abolish the
reddish-brown pigment of hemoproteins. Jednak procedura ta nie usuwa brunatno-czerwonawego barwnika
hemoprotein. Naprzemiennie moŜna stosować roztwór metanol-nadtlenek wodoru. W tej procedurze niektóre
antygeny mogą ulec denaturacji.
Tkanki pochodzące od osób zakaŜonych wirusem zapalenia wątroby typu B oraz u których występuje antygen
powierzchniowy wzw typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste wybarwienie z peroksydazą chrzanową.8
Normalne/nieodporne surowice o tym samym zwierzęcym źródle pochodzenia co wtórne surowice
odpornościowe stosowane na etapach blokowania mogą dać fałszywie-ujemne lub fałszywie dodatnie wyniki
ze względu na autoprzeciwciała lub naturalne przeciwciała.
Odczynniki dostarczane w tym zestawie zostały przygotowane w celu uzyskania optymalnych wyników. Dalsze
rozcieńczanie moŜe spowodować brak zabarwienia antygenu.
Rozwiązywanie
problemów
Opis problemu
1. Brak barwienia
szkiełek
2. Słabe barwienie
wszystkich
szkiełek.
3. Nadmierne
barwienie tła
szkiełek
Prawdopodobne przyczyna
1a. Odczynniki nie zostały uŜyte w
prawidłowej kolejności
1b. Azydek sodu w kąpieli buforowej.
2a. Wycinki zatrzymują zbyt wiele
roztworu po kąpieli.
2b. Szkiełek nie inkubowano
wystarczająco długo z
przeciwciałami lub mieszaniną
substratu.
3a. Próbki wykazują wysoką
aktywność endogennej
peroksydazy.
3b. Parafina nie została całkowicie
usunięta.
3c. Szkiełka nie zostały dokładnie
wypłukane.
3d. Reakcja szybsza niŜ reakcja
zwykłego substratu z powodu np.
zbyt wysokiej temperatury
pomieszczenia.
3e. Skrawki wyschły podczas
procedury barwienia
Sugerowane działanie
1a. Sprawdzić stosowanie odczynników.
1b. UŜyć świeŜego, pozbawionego buforu
azydku.
2a. Delikatnie postukać szkiełkiem, aby
usunąć nadmiar roztworu przed
wytarcie wokół wycinka.
2b. Sprawdzić zalecane czasy inkubacji.
3a. Zastosować dłuŜszy czas inkubacji
bloku peroksydazy, butelka nr 1.
3b. Zastosować kąpiel ze świeŜego
ksylenu i toluenu. Podczas
jednoczesnego barwienia kilku
szkiełek, druga kąpiel z ksylenu
powinna zawierać świeŜy ksylen.
3c. UŜyć świeŜe roztwory w kąpielach
buforowych i tryskawki. Opcjonalnie
jako bufora przemywającego moŜna
uŜyć 0,05 mol/L buforu Tris
zawierającego 0,3 mol/L NaCl i 0,1%
Tween (kod S3306).
3d. Zastosować krótszy czas inkubacji z
roztworem substratu-chromogenu.
3e. Zastosować komorę wilgotną.
Jednorazowo wycierać tylko trzy do
czterech szkiełek przed nałoŜeniem
odczynnika.
3f. Nieswoiste wiązanie
3f. NałoŜyć roztwór blokujący zawierający
odczynników z wycinkiem tkanki.
niezwiązaną proteinę.
3g. Roztwór przeciwciał zbyt
3g. Zastosować większe rozcieńczenie
stęŜony.
przeciwciała pierwotnego.
UWAGA: Jeśli problemu nie moŜna przypisać Ŝadnemu z powyŜszych powodów lub, gdy sugerowane
działanie naprawcze nie rozwiązuje problemu naleŜy skontaktować się z działem Pomocy Technicznej firmy
Dako w celu uzyskania dalszej pomocy.
(127936-001)
P04047PL_01_K4010_K4011/2015.07 s. 6/7
Dodatkowe informacje na temat technik barwienia i przygotowania próbek moŜna znaleźć w Podręczniku
metod barwienia immunohistochemicznego9 (dostępnym w firmie Dako), Atlasie immunohistologii10 i technik
immunoperoksydazowych – praktycznym podejściu do diagnostyki nowotworów.11
Piśmiennictwo
1. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health,
Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead
azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976
2. Center for Disease Control Manual Guide – Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA.
“Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts.” April 30, 1976.
3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836
4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and
definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order Kod C24-A:4
5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech
& Histochem 1991; 66:194
6. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells.
J Histochem Cytochem 1987; 35:213
7. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol
Press 1990; 46
8. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A
possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626
9. Naish SJ (ed). Handbook–immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Corporation 1989
10. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986
11. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago:
Amer Soc Clin Pathol Press 1986
Dodatkowe
piśmiennictwo
Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195
Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol.
Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3–8
Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study
of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl
Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20–25
Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl
Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20–25
Bisgaard K. EnVision Plus–Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl
Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20–25
Edition 07/15
(127936-001)
P04047PL_01_K4010_K4011/2015.07 s. 7/7