Nowoczesne techniki cytogenetyczne
Transkrypt
Nowoczesne techniki cytogenetyczne
Nowoczesne techniki cytogenetyczne Anna Latos-Bieleńska Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu Metody cytogenetyki klasycznej Zalety Duża dostępność badania (badanie szeroko stosowane we wszystkich ośrodkach genetyki medycznej Stosunkowo niski koszt badania Wady Ograniczona rozdzielczość badania (5-10 Mb w zależności od jakości preparatów cytogenetycznych) Wiarygodność badania zależy od doświadczenia cytogenetyka Badanie możliwe tylko na komórkach dzielących się Oczekiwanie na wynik od 5 dni do 3 tygodni FISH – nowoczesna technika badania kariotypu podnosząca jakość diagnostyki cytogenetycznej Zalety: Technika uzupełniająca metody cytogenetyki klasycznej poprzez identyfikację addycji, insercji oraz chromosomów markerowych. Dzięki dużej rozdzielczości (< 3 Mpz, nawet do 0,5 kbz) umożliwia wykrycie submikroskopowych aberracji chromosomowych. Metoda z wyboru w diagnostyce mikrodelecji Umożliwia szybką analizę setek komórek (ważne w przypadku kariotypów mozaikowych) Umożliwia badanie aberracji chromosomowych w komórkach nie dzielących się Pozwala na szybkie uzyskanie wyniku ( do 24 godz.) Umożliwia badanie materiału archiwalnego (kostki parafinowe) Pozwala na badanie pojedynczej komórki (ważne w diagnostyce genetycznej preimplantacyjnej!) Wady: Nie pozwala na analizę całego kariotypu Wysoki koszt odczynników, zwłaszcza sond molekularnych Zasada FISH Odpowiednio dobrana sonda molekularna (fragment DNA) wyznakowana fluorochromem nałożona na preparat (chromosomy lub jądra komórkowe na szkiełku podstawowym) wiąże się z DNA materiału biologicznego w preparacie i w tym miejscu obserwujemy pod mikroskopem fluorescencję. 1 Sondy molekularne w FISH • Specyficzne - komplementarne do określonego regionu chromosomu • Centromerowe - komplementarne do centromerów • Malujące - pokrywające cały chromosom lub poszczególne jego ramiona Sonda malująca FISH – widoczna translokacja insercyjna sonda centromerowa FISH do jądra interfazowego – triploidia SKY-FISH – analiza widmowa kariotypu Stosuje się jednocześnie 24 sondy molekularne (dla każdej pary chromosomów autosomalnych oraz dla X i Y inna) wyznakowane różnymi kombinacjami 5 różnych fluorochromów. Komputerowa analiza widmowa obrazu po hybrydyzacji – ocena całego kariotypu w jednym badaniu. CGH - Porównawcza hybrydyzacja genomowa Potrzebne: Preparat cytogenetyczny (chromosomy osoby o prawidłowym kariotypie) DNA osoby badanej wyznakowany jednym fluorochromem (np. fluorescencja zielona) DNA kontrolny – prawidłowy DNA wyznakowany innym fluorochromem (np.fluorescencja czerwona) Cot1 DNA do wysycenia regionów zawierających sekwencje wysoko powtarzające się Zasada metody: Na preparat cytogenetyczny nakłada się DNA pacjenta i DNA kontrolny (1:1) i prowadzi hybrydyzację. Po hybrydyzacji analiza komputerowa obrazu. Interpretacja wyników: Przewaga fluorescencji zielonej – duplikacja materiału genetycznego pacjenta Przewaga fluorescencji czerwonej – delecja materiału genetycznego pacjenta 2 Zalety Umożliwia badanie całego genomu (wszystkich chromosomów) Nie wymaga hodowli komórek pacjenta Można wykorzystac materiał archiwalny (kostki parafinowe) Można zrobi badanie na podstawie pojedynczej komórki Wady CGH Nie wykrywa aberracji zrównoważonych Nie wykrywa triploidii Wysoki koszt badania Array CGH Zasada techniki taka sama jak dla CGH (tzn. DNA kontrolny i DNA badany wyznakowane różnymi fluorochromami), ale sekwencja docelowa to małe odcinki DNA umieszczone na nośniku (mikromacierz). Olbrzymia rozdzielczośc badania. Obecnie jeszcze koszt badania bardzo wysoki, ale jest to technologia przyszłości. 3